張蒙

（涼山州農(nóng)業(yè)學(xué)校，四川 西昌 615000）

由于獼猴在形態(tài)學(xué)、生殖生理特性和生化代謝方面與人類(lèi)非常相似，在醫(yī)學(xué)和生物學(xué)領(lǐng)域早已被作為理想的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。本試驗(yàn)通過(guò)采集3個(gè)不同年齡段（幼年、青年、老年）獼猴的糞便樣本，提取其中的微生物總DNA，并應(yīng)用ERIC-PCR技術(shù)對(duì)3種糞便中的菌群結(jié)構(gòu)差異及相關(guān)性進(jìn)行分析，為進(jìn)一步研究腸道菌群與獼猴營(yíng)養(yǎng)、消化和吸收的關(guān)系奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1 材料

1.1.1 糞便樣品 從國(guó)家實(shí)驗(yàn)獼猴基地采集老年（2只）、青年（2只）和幼年（2只）獼猴的新鮮糞便各2份。1.1.2 主要儀器 臺(tái)式離心機(jī)，分光光度計(jì)，核酸蛋白檢測(cè)儀，PCR擴(kuò)增儀，BIO-RAD凝膠成像系統(tǒng)，F(xiàn)R-180A電泳槽，電熱恒溫水浴鍋。

1.1.3 主要試劑 無(wú)菌PBS緩沖液（0.05 mol/L，pH 7.4），TE buffer，丙酮，含溶菌酶的TE（溶菌酶濃度20mg/mL），消化緩沖液，無(wú)水乙醇，蛋白酶K，洗液，洗脫緩沖液，10×Buffer，dNTP，上下游引物，TaqDNA聚合酶，DNA模板，雙蒸水，MgCl2。

2 試驗(yàn)方法

2.1 糞便采集 采集3個(gè)年齡段獼猴的糞便各2份，每份標(biāo)本濕重約4g，收集到無(wú)菌塑料袋置于冰盒中，迅速帶入實(shí)驗(yàn)室-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 糞便標(biāo)本預(yù)處理 將每份糞便標(biāo)本分成均勻的3份，分別加入裝有6 mL無(wú)菌PBS緩沖液的試管中，充分振蕩5～10min，500r/min離心5 min，收集上清液。此步驟重復(fù)3次。然后取上清液以5000 r/min離心10min，收集沉淀置于Eppendorf管中。沉淀物在1mL TE buffer中懸置，混合后以14 000 r/min離心5min，收集沉淀。將沉淀溶于200μL丙酮中（-20℃預(yù)冷），振蕩混勻，14000r/min離心2min，棄上清。此步驟重復(fù)3次。最后將細(xì)菌溶于TE buffer中，混勻，分別標(biāo)上記號(hào)，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 細(xì)菌基因組提取

2.3.1 反復(fù)凍融法[1]在預(yù)處理好的樣品中加入660 μL TE緩沖液（pH 7.2），充分振蕩混勻，-20℃冰凍1h，取出，迅速于65℃溫浴30min，反復(fù)3次。然后加入75μL的SDS（10%）和12.5μL的蛋白酶K（20mg/mL），37℃溫浴2h，最后進(jìn)行酚-氯仿抽提。

2.3.2 酶裂解法[2]在預(yù)處理好的樣品中加入200μL裂解液I（50 mmol/L Tris-base+50 mmol/L Na2EDTA，pH 7.8）和50μL的溶菌酶（50mg/mL），37℃溫浴1h，每隔20min輕輕倒置混勻。然后加入500μL的裂解液Ⅱ（200mmol/L NaCl+100mmol/L Tris2-base+50 mmol/L Na2EDTA+2.0%SDS+1.0%Triton X2100）和12.5 μL的蛋白酶K（20mg/mL），37℃溫浴12h，最后進(jìn)行酚-氯仿抽提[3]。

2.3.3 試劑盒法[4]在預(yù)處理好的標(biāo)本中加200μL含溶菌酶的TE，用移液尖混勻。室溫下孵育40min，加入試劑盒中提供的消化緩沖液400μL，混勻；再加入3μL蛋白酶K，混勻后55℃保溫2～3h；加入260μL無(wú)水乙醇，混勻后用移液尖將樣品全部轉(zhuǎn)移至UNIQ-10柱中，8000r/min離心1min；取下UNIQ-10柱，棄去收集管中的廢液，將柱放回收集管中，加入500μL洗液，10000r/min離心30s。此步驟重復(fù)兩次。取下UNIQ-10柱，棄去收集管中的全部廢液；將柱放回收集管中，10000r/min室溫離心1 min，以除去殘留洗液，將柱放入新的Eppendorf管中，在柱中央加入50μL洗脫緩沖液，室溫或37℃放置2min；室溫下10000r/min離心1min，離心管中收集的液體即為細(xì)菌基因組DNA。

2.4 腸道菌群總DNA質(zhì)量檢測(cè) 各取7μL用以上3種方法抽提的青年組DNA，分別作上標(biāo)記，用0.8%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色，在凝膠成像儀上觀察分析[5]。各取30μL青年組DNA樣品稀釋100倍，用分光光度計(jì)檢測(cè)總DNA的A260、A280和A260/A280值，同時(shí)用核酸蛋白檢測(cè)儀檢測(cè)DNA樣品的濃度值。

2.5 ERIC-PCR擴(kuò)增 引物序列：應(yīng)用通用引物進(jìn)行擴(kuò)增。上游引物序列ERIC-1：5′-ATGTAAGCTCC CTGGGGAATCCA-3′，下游引物序列ERIC-2：5′-AAGTAAGTGACTGGGGTGATGCG-3′。這對(duì)通用引物可擴(kuò)增近全長(zhǎng)的細(xì)菌ERIC序列。擴(kuò)增體系：10× PCR Buffer 2.5μL，dNTP 2.5μL，MgCl21.5μL，上下游引物各1 μL，Taq酶0.2 μL，模板DNA 2 μL，加ddH2O將反應(yīng)體積補(bǔ)至25μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5min，94℃變性1min，52℃退火1 min，65℃延伸8min，循環(huán)30次，最后65℃延伸12min。

2.6 ERIC-PCR產(chǎn)物分析 取6μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，電泳緩沖液為0.5×TBE，瓊脂糖濃度為1%，EB染色，用凝膠成像儀觀察拍照，記錄結(jié)果[6]。

3 結(jié)果與分析

3.1 總DNA的濃度和純度檢測(cè) 用反復(fù)凍融法得到的2份青年組樣品DNA提取物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)（圖1），結(jié)果顯示：獲得的DNA片段完整，不存在降解現(xiàn)象，但所提取的DNA條帶亮度較低，清晰度較差。

用酶裂解法得到的2份青年組樣品DNA提取物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)（圖1），結(jié)果顯示：所得到的DNA片段完整，不存在降解現(xiàn)象，且提取的DNA條帶很清晰，亮度高。

用試劑盒法得到的2份青年組樣品DNA提取物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)（圖1），結(jié)果顯示：所得到的DNA片段完整，不存在降解現(xiàn)象，且提取的DNA條帶很清晰，亮度高。

圖1 3種方法提取的樣品DNA經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳得出的結(jié)果

用分光光度計(jì)檢測(cè)的結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可以看出，用3種方法提取的青年組獼猴腸道菌群總DNA中，反復(fù)凍融法的濃度最低，而酶裂解法和試劑盒法的濃度較高，但3種方法提取的總DNA的A260/A280值均介于1.6～1.9之間，且同組的結(jié)果差異不大，說(shuō)明用這3種方法提取DNA的污染小，重復(fù)性較好，與電泳結(jié)果一致。

表1 3種方法提取的DNA濃度值和純度值比較 μg/μL

隨機(jī)選擇青年組的2個(gè)樣品分別用3種方法進(jìn)行DNA提取，確定最佳的DNA提取方法。最終得出酶裂解法和試劑盒法均能提取較好質(zhì)量的DNA，綜合選定酶裂解法。

3.2 ERIC-PCR產(chǎn)物分析 將酶裂解法得到的幼年（2份）、青年（2份）、老年（2份）組獼猴腸道菌群總DNA進(jìn)行ERIC-PCR分析（其擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳結(jié)果見(jiàn)圖2）。圖譜上的泳帶反映了糞樣中的優(yōu)勢(shì)菌群，亮度表明了腸道菌群DNA的豐度，泳帶數(shù)量和位置的復(fù)雜性說(shuō)明了菌群的多樣性。由圖2可知，同年齡組的泳帶數(shù)量和位置變化很??；幼年獼猴糞便樣品的條帶數(shù)較為豐富，表明此時(shí)已有較多菌群在腸道內(nèi)定植；青年獼猴糞便樣品與幼年獼猴相比，無(wú)論是ERIC條帶的數(shù)量還是位置都發(fā)生了較為明顯的改變；老年獼猴糞樣中的條帶數(shù)最少，說(shuō)明腸道菌群種類(lèi)最少。

4 討論與分析

1987年之前，對(duì)生態(tài)系統(tǒng)中微生物群體的多樣性以及群落結(jié)構(gòu)的分析大多是將微生物進(jìn)行分離培養(yǎng)，然后通過(guò)一般生理生化性狀，或者特定的表型來(lái)進(jìn)行分析。以上方法都是局限于從培養(yǎng)基上分離到的微生物。目前，腸道中許多細(xì)菌還不能用現(xiàn)有的培養(yǎng)手段獲得，純培養(yǎng)日益顯現(xiàn)出局限性。因而通過(guò)直接從糞便中提取細(xì)菌總DNA，然后利用ERIC-PCR方法對(duì)微生物的多樣性進(jìn)行研究，避免了細(xì)菌培養(yǎng)這一步，從而可以對(duì)微生物群體的全貌加以研究。ERIC-PCR廣泛用于細(xì)菌的鑒定、分子分類(lèi)等研究。

圖2 3個(gè)年齡段獼猴腸道菌群DNA的ERIC-PCR擴(kuò)增結(jié)果

本文研究的3種方法均能夠得到質(zhì)量較高的總DNA，但是反復(fù)凍融法所提DNA的條帶亮度都比較低，清晰度差，DNA濃度明顯低于其他2種方法。最終我們選擇酶裂解法是因?yàn)槊噶呀夥ê驮噭┖蟹ㄌ崛〉募?xì)菌DNA濃度和純度都很高，效果差不多，但是試劑盒法所需要的實(shí)驗(yàn)操作較復(fù)雜且成本較高[7]。

本文采用ERIC-PCR技術(shù)分析了3個(gè)不同年齡段獼猴的菌群結(jié)構(gòu)的變化和特點(diǎn)，并結(jié)合相似性分析比較了獼猴個(gè)體菌群的多樣性。結(jié)果表明，老年動(dòng)物的優(yōu)勢(shì)條帶少，青年動(dòng)物的優(yōu)勢(shì)條帶多，幼年動(dòng)物的優(yōu)勢(shì)條帶次于青年動(dòng)物。相同年齡組獼猴腸道菌群組成差異不大，優(yōu)勢(shì)菌群也有一定差別；不同年齡組獼猴腸道菌群組成差異較大，青年組菌群種類(lèi)最多，老年組菌群種類(lèi)最少。相對(duì)而言，幼年獼猴腸道微生物區(qū)系很不穩(wěn)定，食物和環(huán)境的改變均可導(dǎo)致其微生物菌群的不平衡；青年獼猴腸道優(yōu)勢(shì)菌群較多，微生物系統(tǒng)已經(jīng)比較穩(wěn)定了；老年獼猴腸道優(yōu)勢(shì)菌群最少，說(shuō)明其腸道微生物系統(tǒng)已逐漸退化，不能滿足對(duì)營(yíng)養(yǎng)的全面吸收。以上只是ERIC-RCR的初步分析結(jié)論，因?yàn)橥粋€(gè)大小的DNA片段往往包含有多個(gè)條帶，如要進(jìn)行進(jìn)一步的分析則還需要通過(guò)其他方式，如DGGE和測(cè)序等。

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