馬艷君，阿比克哈莫，湯承，岳華

（西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川 成都 610041）

2017年4月，四川省某肉牛場(chǎng)從外省購(gòu)回32頭3～4月齡的西門塔爾?；蛭麟s牛，24頭在運(yùn)回后7～10d發(fā)病，主要臨床癥狀為精神沉郁、食欲下降，鼻鏡干燥、流出黃白色膿性鼻液，呼吸困難、體溫升高，部分病牛結(jié)膜發(fā)炎、流淚等。本試驗(yàn)采集患病牛的深部鼻腔棉拭子，對(duì)病原進(jìn)行了分離鑒定，并對(duì)分離株的敏感性藥物進(jìn)行了篩選。

1 材料與方法

1.1 臨床樣本 患呼吸道疾病的牛鼻腔棉拭子24份，編號(hào)1～24。

1.2 菌株和引物 臨床樣本檢測(cè)參照文獻(xiàn)[1]特異性檢測(cè)牛支原體的PCR方法，設(shè)置引物靶基因?yàn)閛ppD/F，擴(kuò)增片段大小為448bp；采用文獻(xiàn)[2]報(bào)道的PCR方法進(jìn)行分離菌株的鑒定，引物為靶向支原體屬16S rRNA的通用引物，擴(kuò)增片段為1021bp。以上兩條引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成。用于質(zhì)控的牛支原體菌株由本實(shí)驗(yàn)室分離保存。

1.3 主要試劑 支原體基礎(chǔ)培養(yǎng)基、支原體瓊脂培養(yǎng)基均購(gòu)自青島海博生物技術(shù)有限公司，Taq酶、DNA MakerⅡ均購(gòu)自TAKARA公司，馬血清購(gòu)自Hyclone公司，Gel Extraction Kit購(gòu)自O(shè)mega公司，土霉素、鏈霉素、氟苯尼考、慶大霉素等藥物購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所或Sigma公司。

1.4 牛支原體的PCR檢測(cè) 用1mL PBS充分洗滌臨床樣本，經(jīng)12000r/min 4℃離心30min后，運(yùn)用常規(guī)酚-氯仿法提取沉淀中的DNA作為模板，參照文獻(xiàn)[1]報(bào)道的方法進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)以牛支原體為陽(yáng)性對(duì)照，以無(wú)模板對(duì)照為陰性對(duì)照，通過1.5%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行鑒定。

1.5 牛支原體的分離培養(yǎng) 將浸泡有鼻腔棉拭子的支原體液體培養(yǎng)基（1mL）經(jīng)渦旋混勻后，吸取液體經(jīng)4000r/min 4℃離心5min，上清用0.45μm細(xì)菌濾器過濾，取0.2mL濾液接種至1.8mL支原體液體培養(yǎng)基中，并進(jìn)行10倍梯度稀釋，稀釋到10-7，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～5 d，每天觀察，當(dāng)培養(yǎng)基顏色由紅色變?yōu)槌赛S色且澄清透亮?xí)r，再涂布于支原體固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)3～5d，光學(xué)顯微鏡下低倍觀察菌落形態(tài)，同時(shí)挑取單菌落接種于支原體液體培養(yǎng)基，經(jīng)三次純化后凍干保存。

1.6 基于16S rRNA序列的支原體種鑒定和系統(tǒng)進(jìn)化分析 用酚-氯仿法提取支原體液體純培養(yǎng)物的DNA作為PCR檢測(cè)的模板，采用文獻(xiàn)[2]的方法進(jìn)行檢測(cè)，以無(wú)模板對(duì)照為陰性對(duì)照，以牛支原體為陽(yáng)性對(duì)照，通過1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，用Gel Extraction Kit對(duì)目的片段進(jìn)行純化回收，送上海生工生物工程股份有限公司測(cè)序。

用DNAman對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行同源性比對(duì)，選取GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中不同國(guó)家不同地域的牛支原體株的16S rRNA基因序列，運(yùn)用Mega5.0軟件構(gòu)建進(jìn)化樹，進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。

1.7 藥敏試驗(yàn) 隨機(jī)選取4株分離株，參考文獻(xiàn)[3]的微量稀釋法對(duì)泰樂菌素、慶大霉素等8種藥物的最低抑菌濃度（MIC）進(jìn)行測(cè)定。

圖1 部分樣本PCR擴(kuò)增電泳圖

2 結(jié)果

2.1 牛支原體的PCR檢測(cè)結(jié)果 凝膠電泳結(jié)果顯示，有23份臨床樣本擴(kuò)增出目的條帶，如圖1所示。

2.2 牛支原體的分離培養(yǎng) 將23份陽(yáng)性樣本接種于支原體液體培養(yǎng)基，其中10份樣本在培養(yǎng)3～4d時(shí)培養(yǎng)基澄清且變成了橙黃色，將變色的培養(yǎng)基涂布于支原體固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)3～5d，結(jié)果出現(xiàn)了針尖大小的菌落，用普通光學(xué)顯微鏡觀察可見菌落呈現(xiàn)中間凸起的“煎蛋樣”。將分離到的10株牛支原體編號(hào)為SC-1～SC-10。

2.3 支原體種鑒定和系統(tǒng)進(jìn)化分析

2.3.1 基于16S rRNA序列的支原體種鑒定 對(duì)分離的10株菌進(jìn)行了基于16S rRNA序列的菌種鑒定，電泳結(jié)果顯示，PCR擴(kuò)增在1000bp左右出現(xiàn)特異性條帶，如圖2所示，與預(yù)期目的片段相符。將膠回收產(chǎn)物送至上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序，并運(yùn)用DNAman對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比對(duì)分析，結(jié)果顯示與牛支原體的同源性為99.7%～100%。

圖2 分離菌株16S rRNA基因PCR擴(kuò)增電泳圖

2.3.2 基于16S rRNA序列的系統(tǒng)進(jìn)化分析 分析牛支原體分離株的進(jìn)化樹，發(fā)現(xiàn)10株牛支原體聚為5大支，表明分離株的遺傳多樣性比較豐富；其中2株牛支原體分離株（SC-10、SC-1）聚為一支，與我國(guó)湖北株（CP007591.1）、廣東株（KM576849.1）、福建株（KX230478.1）遺傳關(guān)系最近；3株牛支原體分離株（SC-3、SC-7、SC-9）聚為一支，與我國(guó)湖北株（CP002513.1）遺傳關(guān)系最近；分離株SC-6、SC-2、SC-4聚為一支，與匈牙利株（KX462435.1）的遺傳關(guān)系最近；分離株SC-5和SC-8單獨(dú)聚為一支，且與重慶株（CP005933.1）的遺傳關(guān)系最近。

2.4 藥敏試驗(yàn)結(jié)果 運(yùn)用臨床常用的8種抗菌類藥物對(duì)隨機(jī)挑選的4株分離株進(jìn)行MIC測(cè)定，結(jié)果見表1。敏感、耐藥的判定標(biāo)準(zhǔn)參考CLSI[4]。從表1可知，這4株牛支原體對(duì)泰樂菌素、氧氟沙星、土霉素、慶大霉素、頭孢喹諾、氟苯尼考敏感，而對(duì)恩諾沙星和頭孢噻呋具有耐藥性。

表1 8種抗生素對(duì)4株牛支原體的最小抑菌濃度（MIC）μg/mL

3 討論

牛支原體不僅引發(fā)牛肺炎、乳腺炎，還可導(dǎo)致關(guān)節(jié)炎、角膜結(jié)膜炎和母牛流產(chǎn)等多種疾病[5]。國(guó)內(nèi)自2008年證實(shí)牛支原體與牛呼吸道疾病緊密相關(guān)以來(lái)，關(guān)于該菌的研究已經(jīng)有很多報(bào)道[6]。運(yùn)輸應(yīng)激是導(dǎo)致牛支原體病發(fā)生的一個(gè)主要原因[7]。因此，長(zhǎng)途運(yùn)輸時(shí)進(jìn)行抗應(yīng)激處理是減少牛支原體病的重要手段[8]。本試驗(yàn)從24個(gè)臨床樣本中檢測(cè)到23個(gè)牛支原體陽(yáng)性樣本，其感染率高達(dá)95.83%，說明牛支原體是該肉牛場(chǎng)重要的病原菌之一。由于引起呼吸道疾病的病因復(fù)雜，有必要進(jìn)一步對(duì)其他病原菌（如病毒、細(xì)菌等）進(jìn)行調(diào)查，以便更加全面地了解該場(chǎng)的混合感染情況。

抗生素治療是控制和治療牛支原體病的主要手段。由于支原體結(jié)構(gòu)和功能的特點(diǎn)使其對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗菌藥和磺胺類藥物具有內(nèi)在的抗性，但是對(duì)影響蛋白質(zhì)或核酸合成的抗生素敏感[9]。近年來(lái)，牛支原體耐藥的報(bào)道逐漸增多，從比利時(shí)、德國(guó)和意大利3個(gè)國(guó)家分離的牛支原體對(duì)替米考星、泰樂菌素等常用藥具有嚴(yán)重的耐藥性[10]。張利等[3]研究表明，牛支原體對(duì)恩諾沙星、環(huán)丙沙星、諾氟沙星等藥物的抵抗性增強(qiáng)。本試驗(yàn)對(duì)分離出的牛支原體進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，結(jié)果表明泰樂菌素、氧氟沙星、土霉素、慶大霉素、頭孢喹諾、氟苯尼考為敏感藥物，恩諾沙星和頭孢噻呋有耐藥。這一結(jié)果為該牛場(chǎng)的疫病治療提供了用藥參考。

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