李小麗 王炎 朱鐘慧 田琳

1首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院、北京熱帶醫(yī)學(xué)研究所寄生蟲病研究室、熱帶病防治研究北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（北京100050）；2首都醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院勞動(dòng)衛(wèi)生與環(huán)境衛(wèi)生學(xué)系、首都醫(yī)科大學(xué)環(huán)境毒理學(xué)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（北京100069）

間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是一種非造血干細(xì)胞的成體干細(xì)胞，具有自我更新、多向分化的能力，同時(shí)還展現(xiàn)出抑制惡性細(xì)胞增殖、免疫調(diào)節(jié)及抗炎的特性［1］。隨著研究的深入，學(xué)者們逐漸認(rèn)識(shí)到MSCs的旁分泌效應(yīng)在組織損傷中起到積極作用。MSCs通過分泌一些可溶性生物活性因子，抑制細(xì)胞凋亡和纖維化、促進(jìn)血管再生、刺激組織內(nèi)祖細(xì)胞有絲分裂和（或）分化以及調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)促進(jìn)損傷組織的修復(fù)再生［2］。目前MSCs已在骨組織、心肌、腎臟、肺臟、腦組織及肝臟的損傷（如毒性藥物、缺血再灌注損傷）中廣泛應(yīng)用［3-4］。MSCs還具有種子細(xì)胞的特性，如容易獲取、能夠快速、大量擴(kuò)增、無或具有低免疫原性及具有較高純度，所以在組織工程與再生醫(yī)學(xué)研究中發(fā)揮著重要作用。因此，本文就近年來MSCs的旁分泌功能在組織損傷修復(fù)中的作用及其機(jī)制研究進(jìn)展作一綜述。

1 免疫調(diào)節(jié)作用

MSCs對(duì)固有免疫和適應(yīng)性免疫均有很強(qiáng)的調(diào)節(jié)作用。

1.1 固有免疫

1.1.1 巨噬細(xì)胞巨噬細(xì)胞按照功能的不同可分為M1型和M2型，M1型巨噬細(xì)胞以分泌促炎因子為主，發(fā)揮促炎功能，導(dǎo)致機(jī)體組織的炎癥損傷［5］。其分泌的炎性因子一氧化氮、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor，TNF?α）、白細(xì)胞介素-6（interleukin?6，IL?6）等，均具有很強(qiáng)的抗原呈遞作用。但是在MSCs的作用下，這些反應(yīng)均可被抑制。M2型巨噬細(xì)胞可抑制炎癥反應(yīng)，發(fā)揮修復(fù)組織的功能，以上功能可被MSCs促進(jìn)。所以MSCs通過對(duì)M1/M2型巨噬細(xì)胞的調(diào)節(jié)，抑制炎癥反應(yīng)，促進(jìn)組織的修復(fù)。

靳麗媛等［6］報(bào)道MSCs的上清液可以促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M2型分化，同時(shí)使炎癥因子的分泌減少，抗炎因子的分泌增多。在哮喘研究中，人骨髓來源的MSCs可以促進(jìn)肺泡巨噬細(xì)胞向M2型分化，但并不會(huì)增加巨噬細(xì)胞的總量，從而有效抑制氣道高反應(yīng)性及嗜酸性粒細(xì)胞的大量沉積［7］。在橫紋肌溶解引起的急性腎損傷中，MSCs促使M2型的巨噬細(xì)胞在損傷腎組織中聚集，從而起到抗炎作用，保護(hù)腎功能的繼續(xù)損害及腎小管的損傷。將MSCs與巨噬細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)促炎因子TNF?α、IL?6含量降低，抗炎因子IL?10的含量增加，同時(shí)M2型巨噬細(xì)胞標(biāo)志物CD206表達(dá)增加，說明MSCs促使巨噬細(xì)胞向M2型分化［8］。研究還發(fā)現(xiàn)MSCs對(duì)巨噬細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用是通過旁分泌因子前列腺素E2（prostaglandin?E2，PGE2）來實(shí)現(xiàn)的。1，25-二羥基維生素D3可以促使MSCs分泌更多的PGE2和血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF），減少炎性因子的產(chǎn)生，從而調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞引起的炎癥反應(yīng)［9］。

1.1.2 中性粒細(xì)胞在免疫復(fù)合物引起的血管炎研究中，MSCs可以抑制中性粒細(xì)胞的呼吸爆發(fā)，降低細(xì)胞死亡及過氧化物酶的釋放，從而減少組織損傷。給予不同數(shù)量的MSCs，中性粒細(xì)胞的氧化還原反應(yīng)被抑制，MSCs的數(shù)量越多，其抑制作用越顯著。MSCs還可抑制中性粒細(xì)胞死亡的數(shù)量，其釋放的各種酶如髓過氧化物酶、基質(zhì)金屬蛋白酶-9（matrix metallopeptidase 9，MMP?9）及中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶的釋放也被抑制。其抑制機(jī)制為MSCs分泌的細(xì)胞間黏附分子-1下調(diào)了中性粒細(xì)胞的吞噬作用及胞外過氧化物歧化酶3的釋放，減輕了氧化應(yīng)激的水平，從而抑制中性粒細(xì)胞的死亡及蛋白酶的釋放［10］。急性肺損傷時(shí)，大量中性粒細(xì)胞迅速進(jìn)入肺實(shí)質(zhì)，釋放氧自由基、蛋白溶解酶及炎癥介質(zhì)，加重炎癥反應(yīng)［11］。MSCs可抑制以上物質(zhì)的釋放，減輕肺組織的炎癥反應(yīng)及氧化性損傷，提高動(dòng)物的存活率［12］。

1.1.3 樹突狀細(xì)胞（dendritic cells，DC）MSCs可以通過旁分泌腫瘤壞死因子α刺激基因-6（tumor necrosis factor?inducible gene 6，TSG?6）抑制DC的成熟及功能［13］。成熟的DC 高表達(dá)抗原 CD80、CD86、MHC?II及 CD11c，未成熟的DC均低表達(dá)這些抗原。當(dāng)成熟的DC加入MSCs后，其表面的上述抗原表達(dá)降低，說明MSCs可以抑制DC的成熟。將MSCs的TSG?6基因沉默之后，再與DC共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)DC的成熟度未被抑制，說明MSCs確實(shí)通過TSG?6抑制DC的成熟。另一方面MSCs還可以抑制DC的功能。成熟的DC分泌IL?2，DC越成熟，分泌的IL?12越多。IL?12可激活T淋巴細(xì)胞，促進(jìn)其增殖，同時(shí)提高干擾素（interferon?γ，IFN?γ）的水平。MSCs可抑制DC分泌IL?12，降低T細(xì)胞的增值及IFN?γ的水平。但是加入了TSG?6基因沉默的MSCs后，DC被抑制的功能均可得到恢復(fù)，由此證明MSCs通過旁分泌TSG?6抑制DC的功能。所以，MSCs可以通過旁分泌細(xì)胞因子抑制DC的成熟及功能，調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)。

1.1.4自然殺傷（natural killer，NK）細(xì)胞MSCs可以抑制NK細(xì)胞的功能改變其細(xì)胞表型，同時(shí)也可以抑制NK細(xì)胞的增殖、細(xì)胞毒性以及NK細(xì)胞所分泌細(xì)胞因子的釋放，如IFN?γ、TNF?α、IL?10、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子及其他調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)的趨化因子。在敗血癥模型小鼠體內(nèi)，MSCs能刺激肺組織中IL?10的表達(dá)升高，抑制IL?6、IFN?γ及TNF?α等促炎因子的表達(dá)。其具體機(jī)制為MSCs通過激活JAK/STAT信號(hào)通路，上調(diào)細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子3的目的基因，抑制NK細(xì)胞的功能及增殖［14］，從而減輕敗血癥的炎癥反應(yīng)。

1.2 適應(yīng)性免疫

1.2.1T淋巴細(xì)胞眾多肺組織損傷的研究報(bào)道中，MSCs有調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞的作用，其中包括過敏性氣道炎癥及急性肺損傷。而MSCs調(diào)節(jié)T細(xì)胞的作用表現(xiàn)為不同的作用機(jī)制，如MSCs具有抑制T淋巴細(xì)胞增殖的作用［15］，其旁分泌的轉(zhuǎn)化生長因子-β及肝細(xì)胞生長因子（hepatocyte growth factor，HGF）是MSCs抑制T淋巴細(xì)胞增殖的主要調(diào)節(jié)因子。也有報(bào)道稱MSCs旁分泌的PGE2參與了對(duì)T淋巴細(xì)胞的抑制作用。MSCs還可以抑制T淋巴細(xì)胞分泌相應(yīng)的細(xì)胞因子。程序性死亡受體1（programmed death?1，PD?1）是一種重要的免疫抑制分子，廣泛分布于各種組織中。PD?1與其配體PD?L1結(jié)合后可以抑制T淋巴細(xì)胞的增殖及其細(xì)胞因子的產(chǎn)生。自身免疫性肝炎的研究中，MSCs可以降低血清中轉(zhuǎn)氨酶的水平，減輕肝臟組織的病理損害。其作用機(jī)制與抑制Th17所分泌IL?17的產(chǎn)生，上調(diào)PD?1的表達(dá)有關(guān)。小鼠的自身免疫性肝炎模型經(jīng)尾靜脈注射MSCs，無論是Western blot還是real?time PCR檢測(cè)，PD?1的表達(dá)明顯升高，促炎因子IL?17表達(dá)下降，說明MSCs通過上調(diào)了PD?1，抑制T細(xì)胞分泌IL?17，改善肝臟的免疫反應(yīng)［16］。所以在T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫中，MSCs可通過旁分泌途徑調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞的功能。

1.2.2B淋巴細(xì)胞MSCs能抑制B淋巴細(xì)胞的增殖、分化及抗體的分泌。MSCs使B淋巴細(xì)胞滯留于G0/G1期，抑制B淋巴細(xì)胞的增殖。MSCs還可以通過PD?1/PD?L1的調(diào)節(jié)，抑制B淋巴細(xì)胞的激活。但也有文獻(xiàn)報(bào)道MSCs可促進(jìn)純化的小鼠B淋巴細(xì)胞的增殖與分化。雖然以上結(jié)果完全相反，但ROSADO等［17］的研究給出了合理解釋。免疫反應(yīng)中，MSCs對(duì)B淋巴細(xì)胞進(jìn)行免疫調(diào)節(jié)的同時(shí)會(huì)伴有T淋巴細(xì)胞的參與。MSCs需要CD3+T淋巴細(xì)胞的參與，來發(fā)揮抑制B淋巴細(xì)胞增殖的作用。無論MSCs、T淋巴細(xì)胞及B淋巴細(xì)胞之間直接接觸，還是他們所分泌的可溶性細(xì)胞因子，都依賴PD?1/PD?L1的調(diào)節(jié)作用。通過PD?1/PD?L1的調(diào)節(jié)，MSCs抑制濾泡及邊緣區(qū)B淋巴細(xì)胞的激活。T淋巴細(xì)胞釋放的細(xì)胞因子IFN?γ可以激發(fā)MSCs與B淋巴細(xì)胞之間PD?1/PD?L1的作用。若MSCs抑制T淋巴細(xì)胞釋放IFN?γ，則PD?1/PD?L1信號(hào)通路被阻止，MSCs則無法發(fā)揮抑制B淋巴細(xì)胞的作用，B淋巴細(xì)胞的增殖及分化功能可以得到恢復(fù)。所以MSCs在調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的過程中，各種細(xì)胞及細(xì)胞因子相互關(guān)聯(lián)、相互作用，會(huì)得到不同的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

研究證實(shí)MSCs還可以抑制B淋巴細(xì)胞分化為漿細(xì)胞。通過細(xì)胞的直接接觸，MSCs可以抑制B淋巴細(xì)胞向漿細(xì)胞分化［18］。MSCs產(chǎn)生的白介素1受體拮抗劑抑制了B淋巴細(xì)胞的成熟分化［19］。

2 抗氧化應(yīng)激

MSCs有減輕氧化應(yīng)激的作用。首先MSCs可以增加清除自由基的酶類表達(dá)，如NADPH依賴的醌氧化還原酶（NADPH quinone oxidoreductase 1，NQO1）、谷胱甘肽還原酶、谷胱甘肽過氧化物酶及血紅素氧化酶-1（heme oxygen?ase?1，HO?1）。脂多糖引起的急性肺損傷中，給予 MSCs后，抗氧化酶HO?1的表達(dá)量明顯增高，過氧化指標(biāo)丙二醛的表達(dá)量明顯降低，說明MSCs通過提高HO?1的表達(dá)，減輕脂多糖引起的急性肺損傷［20］。在腎臟的缺血再灌注損傷中，過表達(dá)HO?1的MSCs可促進(jìn)腎臟組織損傷修復(fù)因子基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1、VEGF及HGF的分泌，腎功能及病理損傷明顯好轉(zhuǎn)［21］。

Nrf2是一種調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激反應(yīng)的重要轉(zhuǎn)錄因子，氧化應(yīng)激促使Nrf2被激活并進(jìn)入細(xì)胞核，與核內(nèi)的Mar蛋白結(jié)合形成異二聚體后識(shí)別并結(jié)合抗氧化反應(yīng)元件，啟動(dòng)ARE調(diào)控的多種抗氧化酶及II相解毒酶基因表達(dá)或活化，如SOD、過氧化氫酶、谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶、HO?1等，來增加細(xì)胞對(duì)氧化應(yīng)激的抗性［22］。在博來霉素誘導(dǎo)的肺纖維化中，博來霉素減少了抗氧化物質(zhì)基因NQO1、HO?1及Nrf2的表達(dá)。給予MSCs移植后，可通過增加上述抗氧化物質(zhì)的表達(dá)，激活Nrf2通路，抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)，阻止膠原蛋白的沉積，減輕肺組織的纖維化程度［23］。

3 血管新生及血管發(fā)生

MSCs可修復(fù)機(jī)體組織的缺血梗死，如心肌梗死、腦缺血缺氧及腎缺血性損傷。MSCs可以促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、發(fā)芽及遷移，形成血管樣的結(jié)構(gòu)，它還可以旁分泌血管再生所需的各種細(xì)胞因子促血管再生。MSCs能夠分泌足夠的VEGF促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖［24］。雖然VEGF對(duì)血管形成的調(diào)控占主導(dǎo)地位，但血管形成過程復(fù)雜，還有其他因子參與。在心肌缺血的大鼠模型體內(nèi)，注射MSCs條件培養(yǎng)基（MSCs conditioned medium，MSCs?CM）可促進(jìn)心肌梗死邊緣毛細(xì)血管的形成，縮小心肌梗死的面積，說明MSCs通過旁分泌的方式達(dá)到改善心肌功能的作用?；蛐酒夹g(shù)檢測(cè)提示MSCs分泌的因子多數(shù)為促進(jìn)血管生成的細(xì)胞因子，如VEGF、堿性纖維細(xì)胞生長因子、胰島素樣生長因子、促血小板生成素及血小板源性生長因子-BB［25］。這些促進(jìn)血管生成的細(xì)胞因子參與了組織修復(fù)及血管的形成。

除了這些細(xì)胞因子，基質(zhì)金屬蛋白（MMPs）在血管生成中也占有很重要的地位。在體外實(shí)驗(yàn)中，MSCs?CM雖然不含有VEGF，但是依然發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和毛細(xì)血管的形成，說明即使無VEGF存在，MSCs分泌的其他細(xì)胞因子也能促進(jìn)血管的生成，但前提是有高濃度的金屬蛋白酶及MMP?2的存在［26］。血管損傷后發(fā)生的血管重構(gòu)包括血管平滑肌細(xì)胞增殖、遷移、凋亡和細(xì)胞外基質(zhì)的改變，這些變化部分由MMPs介導(dǎo)。在三維空間培養(yǎng)MSCs時(shí)，MSCs對(duì)內(nèi)皮毛細(xì)血管樣結(jié)構(gòu)的形成發(fā)揮關(guān)鍵作用，但加入MMPs抑制劑后，內(nèi)皮血管發(fā)芽則停止，說明MSCs在調(diào)節(jié)血管生成的過程中，需要有MMPs的參與［27］。

MSCs通過多種途徑改善組織供血狀況，目前認(rèn)為其旁分泌促血管生成因子是其重要機(jī)制。

4 外泌體

外泌體也稱細(xì)胞外囊泡，是直徑大約40～100 nm的囊泡，由多種細(xì)胞內(nèi)膜以出芽方式形成的多泡體，釋放到細(xì)胞間隙，參與細(xì)胞間的信息交流，并參與多種生理病理過程［28］?，F(xiàn)已證實(shí)除了MSCs，還可以分泌外泌體的細(xì)胞包括：肥大細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、DC及腫瘤細(xì)胞［29-31］等。外泌體在細(xì)胞間傳遞的物質(zhì)包括：蛋白、脂質(zhì)、mRNA及多種生物活性成分。

MSCs的外泌體作為細(xì)胞間信號(hào)傳遞的介質(zhì)，其修復(fù)潛能己經(jīng)在各種疾病模型中得到證實(shí)。在肺動(dòng)脈高壓大鼠模型中，MSCs源性外泌體能有效降低平均肺動(dòng)脈壓及右心室壓，改善肺血管與右心室重構(gòu)，抑制肺部炎性細(xì)胞浸潤，減輕組織纖維化［32］。在心肌缺血/再灌注模型中，外泌體可以減少心肌梗死的面積，改善再灌注的損傷［33］。外泌體對(duì)腎損傷也有保護(hù)作用。在2型糖尿病腎病及胰島素缺陷型糖尿病腎病的小鼠模型中，含有外泌體的MSCs?CM可使血清中的肌酐及尿素氮水平明顯降低，腎小管間質(zhì)的炎性因子TNF?α的表達(dá)降低，腎小管上皮細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化被抑制，腎纖維化的程度得到改善。外泌體還起到腎小管上皮細(xì)胞間緊密連接結(jié)構(gòu)的保護(hù)作用及抗凋亡作用［34］。在股動(dòng)脈切除的小鼠體內(nèi)，給予外泌體可以促進(jìn)血管再生相關(guān)性因子的表達(dá)，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移及血管的形成，改善下肢缺血的癥狀［35］。外泌體的研究也涉及到了肝臟疾病，在肝臟缺血再灌注損傷的模型中，外泌體使血清轉(zhuǎn)氨酶水平明顯降低，減輕了肝細(xì)胞損傷程度，對(duì)肝臟缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用［36］。

雖然外泌體的研究在各種疾病中均表現(xiàn)出較好的效果，但是它發(fā)揮作用的機(jī)制及具體成分仍需進(jìn)一步去探討。

5 結(jié)語

越來越多的研究者從細(xì)胞旁分泌途徑來揭示MSCs進(jìn)行組織修復(fù)損傷的機(jī)制。MSCs能夠分泌各種旁分泌因子及外泌體，與損傷組織周圍的各種實(shí)質(zhì)細(xì)胞共同作用，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)、抗氧化應(yīng)激、血管再生等旁分泌作用。MSCs的這一特性對(duì)器官損傷修復(fù)具有重大臨床意義。