蘆紅云，吳天祥,2,*，鐘 敏，聶文強(qiáng)

（1.貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院，貴州 貴陽 550025；2.貴州大學(xué)明德學(xué)院，貴州 貴陽 550025）

漆酶是微生物中廣泛存在的一種含銅多酚氧化酶，在食品[1-2]、環(huán)境[3]、生物漂白[4-5]等領(lǐng)域具廣闊的應(yīng)用前景，是近年來的研究熱點(diǎn)。擔(dān)子菌中的白腐菌是漆酶重要的生產(chǎn)者?；覙浠ǎ℅rifola frondosa）屬于白腐菌，在生產(chǎn)栽培時(shí)，分泌漆酶來降解底物秸稈皮殼中的木質(zhì)素供自身生長。Nitheranont等[6]研究指出灰樹花漆酶能有效應(yīng)用于合成染料的脫色以及雙酚A的降解。目前，外源添加物對真菌漆酶影響的研究主要集中在添加金屬離子、芳香族化合物、有機(jī)酸等[7-10]，對于添加中藥成分的研究鮮有報(bào)道。齊艷兵等[11]研究表明酚類底物中的基團(tuán)如—NH2、—OH、—OCH3及—CHCHCH3等，能夠明顯增強(qiáng)漆酶反應(yīng)活性。同時(shí)，文獻(xiàn)[12-14]指出一些中藥藥渣和中藥提取物可顯著促進(jìn)真菌生長及漆酶的產(chǎn)生。

天麻作為貴州三寶之一，是一種名貴的中藥材，其活性成分主要是以天麻素（gastrodin，GA）、對羥基苯甲醇（p-hydroxybenzyl alcohol，HA）、對羥基苯甲醛（p-hydroxylbenzaldehyde，HBA）為主的酚類、有機(jī)酸、甾醇、苷類等[15-17]，這些物質(zhì)的存在是研究天麻對漆酶活力影響的基礎(chǔ)。Xing等[9]研究指出HBA能促進(jìn)灰樹花產(chǎn)漆酶，同時(shí)，課題組[16-21]前期研究也表明，天麻提取物及其主要成分能促進(jìn)灰樹花生長。

實(shí)驗(yàn)以灰樹花菌株為研究對象，研究天麻提取物對灰樹花產(chǎn)胞外漆酶和菌絲體生長的影響，并在此基礎(chǔ)上分析天麻主要成分GA、HA、HBA[22]對灰樹花生長和產(chǎn)漆酶的影響，來探明對其增效貢獻(xiàn)最大的成分，并闡明作用機(jī)理，旨在為天麻提取物及主要成分誘導(dǎo)產(chǎn)漆酶提供理論依據(jù)。GA、HA、HBA的結(jié)構(gòu)式如圖1所示。

圖1 GA、HA、HBA的結(jié)構(gòu)式Fig. 1 Structures of GA, HA and HBA

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及培養(yǎng)基

灰樹花菌株（菌種編號：5.404） 中國普通微生物菌種保藏管理中心；天麻（Rhizoma gastrodiae）貴州省德江縣天麻種植基地。

GA、HA、HBA 美國Sigma公司；2,2’-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（2,2’-azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate)，ABTS）、L-天冬酰胺美國Amrescoa公司；其余試劑均為市售分析純。

斜面培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基；液體種子培養(yǎng)基：葡萄糖30 g/L，蛋白胨2 g/L，酵母膏6 g/L，KH2PO40.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L；pH值自然；發(fā)酵培養(yǎng)基（每1 L含有如下物質(zhì)）[9]：葡萄糖10 g，L-天冬酰胺5 g，Na2HPO40.475 g，KH2PO40.453 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，CaCl2·2H2O 0.013 g，酵母膏提取物1 g，VB125 mg，痕量溶液1 mL（痕量溶液組成：檸檬酸鐵4.8 g/L，ZnSO4·7H2O 2.64 g/L，MnCl2·4H2O 2.0 g/L，COCl2·6H2O 0.4 g/L，CuSO4·5H2O 0.4 g/L）。

1.2 儀器與設(shè)備

BXM-30R立式滅菌鍋 上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；SW-CJ-1D凈化工作臺 蘇州凈化設(shè)備有限公司；TGL-20M臺式高速冷凍離心機(jī) 長沙邁佳森儀器設(shè)備有限公司；TS-2102C恒溫振蕩器 上海天呈儀器有限公司；UV-1800雙光速紫外-可見光光度計(jì) 上海欣茂儀器有限公司；1100高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀及檢測器、5TC-C18色譜柱 美國Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 斜面種子培養(yǎng)

從母種試管中挑取黃豆粒大小菌絲塊接種于PDA斜面中部，25 ℃恒溫培養(yǎng)，至菌絲長滿整個(gè)斜面，轉(zhuǎn)置4 ℃保存。

1.3.2 液體種子培養(yǎng)

用接種勺在斜面菌種管中取1 勺細(xì)小菌絲體，接種于液體種子培養(yǎng)基中，三角瓶裝液量為200 mL/500 mL，加入少許細(xì)小玻璃珠，于25 ℃、150 r/min搖床中培養(yǎng)6 d。

1.3.3 發(fā)酵培養(yǎng)

無菌條件下，按10%的接種量，用移液槍取5 mL種子液接于發(fā)酵培養(yǎng)基中，250 mL三角錐形瓶裝液量為50 mL，于150 r/min的搖床中25 ℃條件下培養(yǎng)。

1.3.4 天麻提取物和粗酶液的制備

天麻粉制備：天麻洗凈，55 ℃烘干，粉碎后過80目備用。

天麻醇提物制備：準(zhǔn)確稱取上述10 g的天麻粉末，加入100 mL 75%乙醇溶液。25 ℃浸提48 h后過濾，60 ℃減壓除去乙醇。加25 mL蒸餾水重溶后過濾，即得到2.5 mL/g的天麻醇提物。

天麻水提物制備：將上述10 g的天麻粉末加入到100 mL的蒸餾水中。25 ℃浸提48 h后過濾得到濾液，60 ℃減壓濃縮，定容至25 mL，即得到2.5 mL/g的天麻水提物。

粗酶液制備：將發(fā)酵液經(jīng)8 層紗布過濾，濾液在轉(zhuǎn)速為6 000 r/min條件下4 ℃低溫離心10 min。

1.3.5 外源誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)

分別向液體培養(yǎng)基中加入不同體積分?jǐn)?shù)的天麻提取物、GA、HBA、HA及不同質(zhì)量的天麻粉末，使其達(dá)到設(shè)定的最終質(zhì)量濃度，并以此為實(shí)驗(yàn)組，以未額外加入任何外源物的液體培養(yǎng)基為對照組。兩者均經(jīng)過高壓滅菌，再接入種子液。發(fā)酵一定時(shí)間后，進(jìn)行指標(biāo)測定，以考察所添加的外源誘導(dǎo)物對灰樹花菌絲體生長和誘導(dǎo)產(chǎn)胞外漆酶的影響。

1.3.6 指標(biāo)測定

1.3.6.1 菌絲體生物量的測定

菌絲體生物量用來評價(jià)灰樹花的生長情況。液體培養(yǎng)過濾后得到菌絲體，將其用蒸餾水沖洗3 次，于數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱中60 ℃烘干至恒量，其質(zhì)量即為菌絲體生物量。

1.3.6.2 漆酶活力測定[23]

以ABTS為底物，2.5 mL反應(yīng)體系中含有1 mL 0.03 g/100 mL ABTS、1 mL pH 2.2磷酸二氫鈉-檸檬酸緩沖溶液和0.5 mL粗酶液。在1 cm的比色皿中，將緩沖液和底物混勻后再加入酶液，在25 ℃反應(yīng)3 min后，在420 nm波長處測吸光度的增加值。煮沸15 min滅活的粗酶液經(jīng)相同處理后為對照組。酶活力定義：每分鐘使1 μmol ABTS轉(zhuǎn)化所需的酶量為1 個(gè)活力單位（U）。計(jì)算公式如下：

式中：ΔA為吸光度的差值；V總為反應(yīng)體系總體積/mL；V酶為酶液體積/mL；ε=3.6×104L/（mol·cm）；L為比色皿直徑/mm；Δt為反應(yīng)時(shí)間差/s。

1.3.7 HPLC分析[22]

1 mL發(fā)酵液經(jīng)膜過濾（0.22 μm）后，用HPLC檢測。條件如下：色譜柱：Agilent TC-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：0.1%磷酸溶液（流動(dòng)相A）和乙腈（流動(dòng)相C）。洗脫梯度：0～35 min，3%～30% C；35～45 min，30%～70% C。流速1 mL/min，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量20 μL，檢測波長221 nm。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法

采用SPSS 17.0軟件分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯著性；Origin 7.5軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 灰樹花菌絲體生長曲線及產(chǎn)漆酶情況

圖2 培養(yǎng)時(shí)間對灰樹花菌絲體生長及漆酶活力的影響Fig. 2 Effect of culture period on mycelial growth and laccase activity of G. frondosa

在無外源添加物的灰樹花液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，每隔1 d隨機(jī)取3 瓶發(fā)酵液，測定其胞外漆酶活力和菌絲體生物量。由圖2可知，搖床培養(yǎng)至12 d時(shí)灰樹花漆酶活力和菌絲體生物量達(dá)到峰值，分別為19.63 U/L、3.06 g/L。1～4 d，灰樹花處于調(diào)整期，產(chǎn)漆酶活力較低，發(fā)酵液中菌絲球極少；4～10 d，灰樹花進(jìn)入指數(shù)生長期，漆酶的活力迅速升高，發(fā)酵液呈微黃透明，菌絲球體積逐步變大，新長出來的細(xì)小菌絲球較多；10～12 d，灰樹花菌體生長進(jìn)入穩(wěn)定期，其所產(chǎn)漆酶活力達(dá)到峰值，發(fā)酵液顏色逐步加深，菌絲球邊緣齊整；12 d以后，隨著菌絲體進(jìn)入衰亡期，漆酶活力逐漸降低，發(fā)酵液顏色漸深而且黏度增加，菌體出現(xiàn)自溶現(xiàn)象。因此，培養(yǎng)最佳周期為12 d?？v觀整個(gè)培養(yǎng)階段可知，灰樹花所產(chǎn)漆酶活力較低，與尹立偉[24]、Sun Shujing[25]等研究結(jié)果一致。王宜磊等[12]研究出枸杞子水提物能提高真菌胞外漆酶活力。后期實(shí)驗(yàn)將以天麻提取物為誘導(dǎo)物來研究其對漆酶活力的影響，以期提高漆酶活力。

2.2 不同質(zhì)量濃度的天麻粉末及提取物對灰樹花漆酶和菌絲體的影響

在裝有灰樹花液體培養(yǎng)基的三角瓶中，分別添加質(zhì)量濃度為1～7 g/L的天麻粉末和天麻提取物（天麻粉末經(jīng)過水提或乙醇提取后的到的物質(zhì)）。發(fā)酵培養(yǎng)12 d后，研究外源誘導(dǎo)物對灰樹花菌體生長和產(chǎn)胞外漆酶活力的影響。由圖3、4可知，外源物對灰樹花菌絲體和胞外漆酶活力均有顯著的促進(jìn)作用。從整體看，隨著外源物質(zhì)量濃度提高，灰樹花生物量和漆酶活力均呈現(xiàn)先增加至峰值后再降低的趨勢，出現(xiàn)這種趨勢的原因可能是天麻中除了含有誘導(dǎo)漆酶分泌芳香族化合物和糖苷類物質(zhì)外[26]，還含有一定量抑制真菌活性的有機(jī)酸（酯）類揮發(fā)油性成分和生物堿[27]，當(dāng)質(zhì)量濃度不斷增大時(shí)，糖苷類物質(zhì)和芳香族化合物的誘導(dǎo)作用逐步達(dá)到最大值，繼續(xù)增加藥渣質(zhì)量濃度，其中揮發(fā)油性成分和生物堿抑菌活性的作用逐漸顯現(xiàn)，漆酶活力和菌絲體生物量又逐漸下降。

圖3 添加物質(zhì)量濃度對灰樹花漆酶活力的影響Fig. 3 Effect of R. gastrodiae extract concentration on laccase activity of G. frondosa

圖4 添加物質(zhì)量濃度對灰樹花菌絲體生長的影響Fig. 4 Effect of R. gastrodiae extract concentration on biomass production by G. frondosa

由圖3可得出，天麻提取物的提取方式不同對誘導(dǎo)漆酶活力的影響不明顯。在3 g/L天麻醇提物、4 g/L天麻水提物、5 g/L天麻粉末的誘導(dǎo)下，漆酶活力均達(dá)到峰值，分別為（106.46±1.25）、（105.25±1.24）U/L和（107.07±1.4）U/L。圖4中，在3 g/L天麻醇提物、2 g/L天麻水提物、4 g/L天麻粉末誘導(dǎo)下，菌絲體生物量達(dá)到各自的峰值，分別為（10.03±0.06）、（5.88±0.14）、（9.03±0.07）g/L，且差距顯著。

因此，選擇3 g/L的天麻醇提物作為誘導(dǎo)物添加到灰樹花深層發(fā)酵中，此時(shí)對菌絲體生長和漆酶的促進(jìn)作用最大，分別為（10.03±0.06）g/L、（106.46±1.25）U/L，相較于空白組，分別提高了1.62 倍和7.41 倍（P＜0.05）。有理由推測天麻醇提物中存在某些對灰樹花菌絲體生長和產(chǎn)漆酶增效的成分。

2.3 天麻醇提物中3種主要成分的HPLC分析

圖5 天麻醇提物（a）和GA（b）、HA（c）、HBA（d）標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC圖Fig. 5 HPLC chromatograms of R. gastrodiae extract and GA, HA and HBA standards

因含外源添加物的灰樹花液體培養(yǎng)基需經(jīng)高壓滅菌，且基于課題組前期研究表明，天麻提取物滅菌操作后組分含量發(fā)生變化，活性成分GA、HBA、HA的含量會上升[28]。故利用滅菌后的天麻提取物進(jìn)行HPLC分析，來探明天麻醇提物中對灰樹花漆酶活力具有最顯著促進(jìn)作用的主要成分。由圖5a可知，滅菌后的3 g/L的天麻醇提物主要成分有GA、HA、HBA等，計(jì)算出各成分的含量分別為5.556、1.265、1.417 mg/g。

2.4 天麻主要成分對灰樹花漆酶活力和菌絲體生長的影響

圖6 天麻醇提物和3 種天麻成分對灰樹花漆酶活力影響的比較Fig. 6 Comparative effects of 3 g/L R. gastrodiae extract, GA, HA and HBA on laccase activity of G. frondosa

圖7 天麻醇提物和3 種天麻成分對灰樹花菌絲體生長影響的比較Fig. 7 Comparative effects of 3 g/L R. gastrodiae extract, GA, HA and HBA on mycelial biomass production by G. frondosa

將3 g/L的天麻醇提物和相應(yīng)含量的3 種主要成分添加到灰樹花液體培養(yǎng)中作為實(shí)驗(yàn)組，對照組中不含任何外源添加物，考察對灰樹花生長和產(chǎn)漆酶起關(guān)鍵作用的主要成分。由圖6、7可以看出，相較于對照組，實(shí)驗(yàn)組中添加的外源物均能有效促進(jìn)灰樹花菌絲體生長和其分泌的胞外漆酶活性。

由圖6可知，HA、HBA和天麻醇提物對漆酶活力有明顯促進(jìn)作用。HA、HBA促進(jìn)漆酶活力可能與苯環(huán)中含有羥基有關(guān)[11]。添加HA時(shí)酶活力最大為（104.14±1.28）U/L，相比添加3 g/L天麻醇提物的實(shí)驗(yàn)組，其酶活力提高10.25%，說明相較于添加天麻醇提物，HA對漆酶活力的促進(jìn)作用更強(qiáng)。由圖7可知，灰樹花液體培養(yǎng)添加HBA時(shí)菌絲體的生物量為（8.92±0.12）g/L，與添加天麻醇提物的實(shí)驗(yàn)組菌絲體生物量（8.07±0.19）g/L相比，菌絲體生物量提高9.17%。說明前者更能促進(jìn)菌絲體的生長，其原因可能是天麻醇提物存在某些抑制真菌生長的物質(zhì)，與2.2節(jié)的分析一致。

2.5 不同濃度的HA、HBA、GA對漆酶活力的影響

圖8 不同濃度HA、HBA、GA對灰樹花漆酶活力影響的比較Fig. 8 Effect of different concentrations of HA, HBA and GA on laccase activity of G. frondosa

為確定天麻3種主要成分對漆酶影響最佳添加量，分別稱取7.4、7.3、17.2 mg的HA、HBA和GA溶于10 mL蒸餾水中配成溶液。按一定的體積梯度添加到每瓶液體培養(yǎng)基中，使灰樹花液體培養(yǎng)基中HA、HBA和GA最終濃度分別為0.01、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4 mmol/L。發(fā)酵12 d后，根據(jù)每瓶中測得的漆酶活力考察3種成分對漆酶的影響。如圖8所示，漆酶活力隨著HA、HBA濃度的增加呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，然而漆酶活力并沒有隨GA濃度增加而明顯上升，甚至較早出現(xiàn)穩(wěn)步下降的趨勢。與對照組相比，HA濃度在0.05～0.3 mmol/L、HBA濃度在0.05～0.2 mmol/L均能顯著促進(jìn)漆酶活力（P＜0.05），其中，HA濃度在0.2 mmol/L時(shí)，灰樹花胞外漆酶活力促進(jìn)作用最佳，此時(shí)漆酶活力值為（97.53±1.96）U/L，相較于對照組提高了3.65 倍。因此，在所添加的3 種天麻主要成分中，0.2 mmol/L HA對促進(jìn)漆酶活力的貢獻(xiàn)最大。

2.6 不同濃度的HA、HBA、GA對菌絲體生物量的影響

圖9 不同濃度HA、HBA、GA對灰樹花菌絲體生物量影響的比較Fig. 9 Effects of different concentrations of HA, HBA and GA on mycelial biomass production by G. frondosa

按照一定的體積梯度向裝有50 mL灰樹花液體培養(yǎng)基中添加少量HBA、HA及GA，使得這些成分最終濃度分別為0.2～1.4 mmol/L，發(fā)酵12 d后測菌絲體生物量。由圖9可知，菌絲體生物量均隨著添加物濃度的升高先上升后下降；其中HBA濃度在1 mmol/L時(shí)對菌絲體生物量的促進(jìn)作用達(dá)到最大值，為（6.17±0.16）g/L，相較于對照組提高了2.13 倍。因此，3 種添加物中，HBA對菌絲體生物量促進(jìn)作用最大。

3 結(jié) 論

實(shí)驗(yàn)開展了關(guān)于天麻提取物對灰樹花深層培養(yǎng)中的產(chǎn)胞外漆酶和菌絲體生長影響的研究。通過比較培養(yǎng)時(shí)間對漆酶和菌絲體干質(zhì)量的影響，得出了灰樹花液體培養(yǎng)的最佳培養(yǎng)周期是12 d；添加不同質(zhì)量濃度的天麻提取物于灰樹花液體培養(yǎng)基，測定出當(dāng)加入3 g/L的天麻醇提物時(shí)，此時(shí)菌絲體生物量和漆酶活力均達(dá)峰值，分別為（10.03±0.06）g/L、（106.46±1.25）U/L，相較于對照組，分別提高了1.62 倍和7.41 倍。其誘導(dǎo)漆酶機(jī)理可能是這些外源添加物中存在某些結(jié)構(gòu)中含有芳基和羥基化合物，而芳基和羥基是漆酶作用底物的特征官能團(tuán)，所以它們能夠誘導(dǎo)菌體分泌更多的漆酶[29-30]。

利用HPLC對3 g/L的天麻醇提物的成分進(jìn)行分析，得到GA、HA、HBA的含量分別為5.556、1.265、1.417 mg/g，將其與3 g/L的天麻醇提物分別添加到培養(yǎng)基中作為實(shí)驗(yàn)組，相較于空白組，這些外源添加物均能有效促進(jìn)灰樹花菌體生長和漆酶活力。其中，HA能顯著促進(jìn)灰樹花分泌的漆酶活力；HBA能顯著增大灰樹花的生物量，與吳彩云等[21]研究結(jié)果一致。天麻醇提物成分復(fù)雜，影響漆酶活力的物質(zhì)也較多。天麻醇提物中是否存在某些物質(zhì)較對羥基苯甲醇對漆酶活力具有更強(qiáng)的促進(jìn)作用，需要進(jìn)一步研究。

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