郭新梅，董 冰，葛兆鵬，裴玉賀，趙美愛(ài)，宋希云*

(1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)，山東 青島 266019；2.青島市主要農(nóng)作物種質(zhì)資源創(chuàng)新與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266019)

【研究意義】單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms SNPs)指在基因組水平上由單核苷酸的變異所引起的一種DNA 序列多態(tài)性，這種變異是由單堿基的轉(zhuǎn)換、顛換及單堿基的插入或缺失所引起的[1]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】1994年，SNPs這個(gè)術(shù)語(yǔ)首次在人類(lèi)分子遺傳雜志上出現(xiàn)，Lander正式提出SNPs為新一代分子標(biāo)記[2]。1997年，作為第三代分子標(biāo)記的SNPs的提出與應(yīng)用，在生物界引起了DNA多態(tài)性研究的新高潮。在1999年的第二次“SNPs與復(fù)雜基因組”國(guó)際會(huì)議中，新增加了群體遺傳學(xué)與信息學(xué)的領(lǐng)域[3]。隨著SNPs的飛速發(fā)展，其在動(dòng)植物中的研究開(kāi)發(fā)也越來(lái)越受到關(guān)注，各種研究迅速開(kāi)展，尤其是在重要農(nóng)作物和模式動(dòng)物中已經(jīng)取得了可喜的成績(jī)[4-6]。SNPs分子標(biāo)記得到了較好的開(kāi)發(fā)[7]，由于SNPs密度高，片段短，遺傳穩(wěn)定，易于高通量、自動(dòng)化分析[8]，廣泛用于繪制EST圖譜、群體遺傳學(xué)和連鎖不平衡、遺傳標(biāo)記。而SNPs的檢驗(yàn)方法有很多，測(cè)序和單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)檢測(cè)技術(shù)已經(jīng)非常的成熟，除此之外，有很多新的檢測(cè)技術(shù)頻頻出現(xiàn)，并逐漸成為主要的檢測(cè)手段。SNPs為基于測(cè)序的高密度遺傳圖譜的構(gòu)建提供了有力工具[9]。直接測(cè)序法是目前最簡(jiǎn)單的SNPs檢測(cè)方法，檢出率基本可達(dá)到100 %。除此之外，采用直接測(cè)序的方法還能得到SNPs的類(lèi)型以及準(zhǔn)確位置等SNPs分型所需的重要參數(shù)。由于DNA測(cè)序趨于自動(dòng)化以及測(cè)序成本的降低，使得直接測(cè)序法越來(lái)越多的應(yīng)用于SNPs的檢測(cè)和分型，出現(xiàn)了很多生物類(lèi)型的全基因組分型SNPs芯片，然而這種芯片對(duì)大群體的試驗(yàn)來(lái)說(shuō)，費(fèi)用高，大部分實(shí)驗(yàn)室無(wú)法完成這類(lèi)全基因組SNPs分型掃描?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】本試驗(yàn)利用候選基因直接測(cè)序比對(duì)后獲得SNPs位點(diǎn)，并通過(guò)HRM篩選和驗(yàn)證SNPs，分析、總結(jié)直接測(cè)序結(jié)合HRM法進(jìn)行SNPs位點(diǎn)的篩選和驗(yàn)證的優(yōu)缺點(diǎn)，【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】以期為直接測(cè)序法進(jìn)行大規(guī)模SNPs篩選提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

玉米自交系H21，糯玉米紫糯96-619及171個(gè)以H21為輪回親本、紫糯96-619為非輪回親本回交5代自交2代的H21BC5F2∶3。材料由青島農(nóng)業(yè)大學(xué)分子育種實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 DNA的提取

取適量玉米種子播種于培養(yǎng)盆中，培養(yǎng)盆中沙土濕度適中，將培養(yǎng)盆放置28 ℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行暗培養(yǎng)，待玉米苗長(zhǎng)至2～3片葉片時(shí)剪取葉片， CTAB法提取DNA，將其稀釋到100 ng/μl，-80 ℃冰箱中凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 候選基因的測(cè)序

候選基因sbe1(AC211441)全長(zhǎng)序列由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成。根據(jù)候選基因AGPS1a-1(bt2)(AF334959)全長(zhǎng)序列，利用Primer 5進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，共設(shè)計(jì)了8對(duì)分段引物，引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，具體的引物設(shè)計(jì)情況如表1所示。

引物合成后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系(50 μl)為：dNTP 5 μl、5×buffer 10 μl、DNA模板 4 μl、上游引物 2 μl、下游引物 2 μl、高保真酶 1 μl、ddH2O 26 μl。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋孩?5 ℃預(yù)變性1 min；②95 ℃變性20 s；③根據(jù)不同引物退火溫度(50到55 ℃不等)，退火20 s；④72 ℃延伸30 s；⑤2～4重復(fù)35個(gè)循環(huán)；⑥72 ℃后延伸5 min。每一個(gè)PCR反應(yīng)重復(fù)3次，產(chǎn)物送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序部進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果使用DNAMAN軟件進(jìn)行比對(duì)分析。再利用ContigExpress軟件將核實(shí)后的測(cè)序結(jié)果進(jìn)行基因片段序列的拼接，確定AGPS1a-1(bt2)的全長(zhǎng)序列。

1.4 SNPs位點(diǎn)的查找

將獲得的sbe1和bt2候選基因全長(zhǎng)核酸序列用SoftBerry軟件翻譯成氨基酸序列，比對(duì)氨基酸序列的差異性。用Antheprot 5.0軟件進(jìn)行蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)；用SWISS MODEL網(wǎng)站進(jìn)行蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)和功能域分析。根據(jù)親本的基因序列及氨基酸序列比對(duì)結(jié)果，在SNPs位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物，引物設(shè)計(jì)情況如表2所示。

1.5 SNPs位點(diǎn)在群體中的檢測(cè)

利用表2中的引物對(duì)親本進(jìn)行普通PCR擴(kuò)增之后，確定引物的最適退火溫度。按照確定好的每對(duì)引物的最佳退火溫度用于Rotor Gene Q(QIAGEN)的HRM(高分辨率熔解曲線(xiàn)) PCR擴(kuò)增，通過(guò)與親本間曲線(xiàn)的比對(duì)情況檢測(cè)后代基因型的分型情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因組DNA的提取

親本及部分子代DNA提取結(jié)果如圖1所示，提取的DNA的純度和質(zhì)量較好，沒(méi)有RNA和其他雜質(zhì)污染，條帶較為清晰，可以進(jìn)行后續(xù)的試驗(yàn)研究。

2.2 bt2目的片段的擴(kuò)增

引物合成后進(jìn)行目的片段PCR擴(kuò)增，經(jīng)0.8 %的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，部分結(jié)果如圖2所示。

表1 bt2引物序列Table 1 Information of primers for bt2

表2 SNPs引物設(shè)計(jì)情況統(tǒng)計(jì)Table 2 Information of SNPs primers for bt2 and sbe1

2.3 bt2基因氨基酸序列比對(duì)與蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

從圖3(封三)可以看出，bt2基因的氨基酸序列在第322處不同，H21在此處的氨基酸為甲硫氨酸，而紫糯96-619的為異亮氨酸。根據(jù)以上的氨基酸序列進(jìn)行的蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果如圖4所示。

從圖4(封三)可以看出，bt2基因編碼的蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)絕大多數(shù)都是α-螺旋和β-折疊，在親本中的表現(xiàn)很相似，但是又存在不同(圖4中箭頭所示)，主要是折疊的位置不同或者區(qū)域大小有差別，如左側(cè)箭頭所示位置的β-折疊，H21比紫糯96-619明顯小；如右側(cè)箭頭所示的位置H21比紫糯96-619明顯少了一段β-折疊，說(shuō)明bt2基因在親本間的差異引起了蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化。

A：M.15000 DNA marker；1.紫糯96-619；2.H21；B：M.15 000 DNA marker；1～12：部分子代圖1 親本(A)及部分BC5 F2∶3(B)的DNA提取Fig.1 DNA extraction of parents(A)and some BC5F2∶3(B) individuals

M. 2000 bp DNA marker; 1. bt2-5 H21; 2. bt2-5 紫糯; 3. bt2-6 H21; 4. bt2-6 紫糯；5. bt2-2 H21; 6. bt2-2 H21; 7. bt2-2 紫糯; 8. bt2-2 紫糯; 9. bt2-7 H21; 10. bt2-7 H21; 11. bt2-7 紫糯; 12. bt2-7 紫糯圖2 bt2部分引物對(duì)H21和紫糯96-619的擴(kuò)增Fig.2 Partial results of H21 and ZN96-619 PCR amplification using primers of bt2

根據(jù)氨基酸序列的變化，在SWISS MODEL網(wǎng)站上應(yīng)用同源建模法對(duì)蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)的結(jié)果如圖5所示，bt2基因編碼的兩親本之間的蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)模型幾乎是一樣的，只在箭頭所示的位置有所不同。說(shuō)明bt2基因在親本間的差異影響了蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)。

本文利用AIS數(shù)據(jù)，構(gòu)建船舶領(lǐng)域統(tǒng)計(jì)方法模型，并根據(jù)目標(biāo)船周?chē)罱暗南鄬?duì)位置分布情況，采用最小二乘法確定領(lǐng)域邊界；利用荊州AIS數(shù)據(jù)對(duì)模型進(jìn)行驗(yàn)證，并對(duì)比分析橫駛船舶與直航船舶的船舶領(lǐng)域，得出橫駛船舶領(lǐng)域與直航船舶領(lǐng)域形狀特征的差異；對(duì)比不同尺度的上行和下行船舶的船舶領(lǐng)域，得到船舶尺度、航速對(duì)船舶領(lǐng)域大小的影響，為船舶在水上航行時(shí)的避碰和風(fēng)險(xiǎn)研究提供一定的理論依據(jù)。

2.4 sbe1基因氨基酸序列比對(duì)與蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

sbe1基因的氨基酸序列比對(duì)結(jié)果如圖6所示，H21在第448個(gè)氨基酸為丙氨酸，紫糯96-619為天冬氨酸。根據(jù)以上的氨基酸序列進(jìn)行的蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果如圖7所示。

圖7(封三)顯示，sbe1基因編碼的蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)絕大多數(shù)都是α-螺旋和β-折疊，折疊和無(wú)規(guī)則卷曲的位置及區(qū)域大小有差別，如箭頭所示的位置H21與紫糯96-619一段β-折疊大小及位置明顯不同，說(shuō)明sbe1基因在親本間的差異引起了蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化。

根據(jù)氨基酸序列的變化，在SWISS MODEL網(wǎng)站上應(yīng)用同源建模法對(duì)蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)的結(jié)果如圖8所示，sbe1基因編碼的兩親本之間的蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)模型幾乎是一樣的。

上述結(jié)果顯示bt2和sbe1基因編碼的各自的親本蛋白質(zhì)在空間結(jié)構(gòu)上一樣的，只是在螺旋的長(zhǎng)度和折疊的數(shù)量上有細(xì)微的差別，其編碼的蛋白質(zhì)的具體功能有待進(jìn)一步研究。

圖8 sbe1基因編碼的紫糯96-619和H21的蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.8 Spatial structure prediction of proteins encoded by gene sbe1 in ZN 96-619 and H21

2.5 bt2和sbe1基因中SNPs位點(diǎn)的篩選

根據(jù)sbe1和bt2候選基因全長(zhǎng)核酸序列比對(duì)結(jié)果，在bt2基因找到17個(gè)SNPs位點(diǎn)，在sbe1基因找到3個(gè)SNPs位點(diǎn)(圖略)，結(jié)合親本氨基酸序列比對(duì)結(jié)果，共設(shè)計(jì)20對(duì) SNPs引物，引物情況如表2所示。

從圖9可以看出，縱軸顯示的是熒光值，橫軸表示的是溫度，由于DNA雙鏈中有SNPs存在，因此親本之間在雙鏈解開(kāi)時(shí)候的溫度有細(xì)微差異，以此將親本間的SNPs檢測(cè)出來(lái)。如圖所示，引物bt2-5129對(duì)親本紫糯96-619擴(kuò)增出的DNA熔解峰值在76.7 ℃，對(duì)H21擴(kuò)增出的DNA熔解峰值在77.2 ℃，有較為明顯的峰值差別，在對(duì)171個(gè)子代進(jìn)行分析的過(guò)程中，絕大多數(shù)后代的基因型與親本紫糯96-619相同，只有5個(gè)與親本H21相同。而部分引物如bt2-1918對(duì)親本擴(kuò)增的基因片段熔解最適溫度差異過(guò)小(0.08 ℃)，無(wú)法進(jìn)行基因分型。引物bt26271、引物bt26408擴(kuò)增出的親本基因片段熔解的最適溫度差值分別為0.18、0.16 ℃，差異較小，也不宜用于后代基因分型。

如圖10所示，引物sbe1-2240對(duì)親本紫糯96-619擴(kuò)增出的DNA熔解峰值在77.42 ℃，對(duì)H21擴(kuò)增出的DNA熔解峰值在77.02 ℃，有較為明顯的峰值差別，在對(duì)171個(gè)子代進(jìn)行分析的過(guò)程中，絕大多數(shù)后代的基因型與親本紫糯96-619相同，只有16個(gè)與親本H21相同。

如圖11所示，引物sbe1-2361對(duì)親本紫糯96-619擴(kuò)增出的DNA熔解峰值在78.33 ℃，對(duì)H21擴(kuò)增出的DNA熔解峰值在78.85 ℃，有較為明顯的峰值差別，在對(duì)171個(gè)子代進(jìn)行分析的過(guò)程中，123個(gè)后代的基因型與親本H21相同，只有48個(gè)與親本紫糯96-619相同。

圖9 引物bt2-5129對(duì)后代擴(kuò)增的高分辨率熔解曲線(xiàn)和峰值Fig.9 HRM curves and peaks of some amplication results by primers bt2-5129

圖10 引物sbe1-2240對(duì)后代擴(kuò)增的高分辨率熔解曲線(xiàn)和峰值Fig.10 HRM curves and peaks of some amplication results by primers sbe1-2240

圖11 引物sbe1-2361對(duì)后代擴(kuò)增的高分辨率熔解曲線(xiàn)和峰值Fig.11 HRM curves and peaks of some amplication results by primers sbe1-2361

3 結(jié) 論

本文首先利用直接測(cè)序法獲得bt2和sbe1基因的全長(zhǎng)序列(基因登錄號(hào)分別為KR337996、KR706462、KR706463和KR337995)，通過(guò)親本間序列比對(duì)，找到了20個(gè)SNPs位點(diǎn)，通過(guò)高分辨率熔解曲線(xiàn)(HRM)，成功對(duì)171個(gè)高世代回交群體的SNPs位點(diǎn)分型。

4 討 論

直接測(cè)序法是目前最簡(jiǎn)單的SNPs檢測(cè)方法。其原理是：通過(guò)對(duì)不同個(gè)體的同一基因或者基因片段進(jìn)行測(cè)序以及序列的比較，確定我們所研究的堿基是否變異，檢出率可達(dá)到100 %。除此之外，采用直接測(cè)序的方法還能得到SNPs的類(lèi)型以及準(zhǔn)確位置等SNPs分型所需的重要參數(shù)。變性高效液相色譜(DHPLC)技術(shù)是在SSCP基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的新技術(shù)[10]，這種方法的靈敏度和自動(dòng)化程度很高，在未知SNPs位點(diǎn)的檢測(cè)方面具有明顯的優(yōu)勢(shì)，并且適合較大片段DNA的分析。其缺點(diǎn)是只能檢測(cè)樣本有無(wú)SNPs，不能確定SNPs的類(lèi)型和位置，若想獲得準(zhǔn)確的SNPs類(lèi)型與位置還是要通過(guò)測(cè)序的方法才能得到[11-12]。

目前檢測(cè)SNPs的方法還有很多，如焦磷酸測(cè)序(pyrosequencing)，微測(cè)序(SNaPshot)、基于雜交原理的Taqman等。這些方法各有優(yōu)勢(shì)，但也存在如適宜位點(diǎn)數(shù)量少的樣本，或者準(zhǔn)確率低、費(fèi)用較高等的缺點(diǎn)[13-14]。高分辨熔解曲線(xiàn)(High Resolution Melting, HRM)于2003 年由美國(guó)Wittwer 實(shí)驗(yàn)室第一次提出[15]。這種檢測(cè)方法操作簡(jiǎn)便、快速，使用成本低，結(jié)果準(zhǔn)確，并且實(shí)現(xiàn)了真正的閉管操作而受到普遍的關(guān)注，被 廣泛用于特定突變位點(diǎn)SNPs(包括缺失、重復(fù))的篩查、基因突變掃描、等位基因頻率分析 、物種鑒定、品種鑒定 、甲基化研究 、動(dòng)植物品質(zhì)相關(guān)多態(tài)性位點(diǎn)的研究等[16-20]。

本文首先利用直接測(cè)序法獲得bt2和sbe1基因的全長(zhǎng)序列(基因登錄號(hào)分別為KR337996、KR706462、KR706463和KR337995)，通過(guò)序列比對(duì)獲得詳細(xì)地SNPs位點(diǎn)信息，同時(shí)通過(guò)HRM技術(shù)快速、準(zhǔn)確地對(duì)群體后代的基因分型。通過(guò)這2種方法的結(jié)合能高效完成大群體SNPs位點(diǎn)的篩選和分型。但在自主設(shè)計(jì)引物進(jìn)行全基因擴(kuò)增獲得全序列的過(guò)程中，遇到了以下幾個(gè)問(wèn)題：一是參考基因序列顯示某些區(qū)段GC含量較高，這會(huì)導(dǎo)致PCR擴(kuò)增不出目的片段或所得的目的片段，目的條帶不夠亮，從而影響測(cè)序的結(jié)果；二是引物除擴(kuò)增出特異性片段之外還有非特異性的片段，這對(duì)測(cè)序結(jié)果的準(zhǔn)確性有一定的影響。因此，為了獲得準(zhǔn)確的測(cè)序結(jié)果，本實(shí)驗(yàn)中每個(gè)樣品測(cè)序均進(jìn)行了3次重復(fù)，以上所得結(jié)果是3次重復(fù)比對(duì)之后的結(jié)果，準(zhǔn)確性較高。同時(shí)利用在通過(guò)HRM進(jìn)行后代群體分型的過(guò)程中，部分引物如bt2-1918、bt2-6271、bt2-6408由于親本基因片段熔解的最適溫度差值較小，無(wú)法進(jìn)行基因分型，需要通過(guò)重新測(cè)序或重新設(shè)計(jì)引物或可以解決，而有些位點(diǎn)受基因序列本身的影響很難設(shè)計(jì)出符合HRM分析的引物，因此，HRM技術(shù)還需要進(jìn)一步完善與發(fā)展，使其更加有效地分析突變位點(diǎn)。

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