尚 慧，韓樹鑫，高艷玲,，張 威，范國(guó)權(quán)，申 宇，聶先舟，呂文河*，白艷菊,2*

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030；2.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院克山分院，黑龍江 齊齊哈爾 161005；3.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物脫毒苗木研究所，黑龍江 哈爾濱 150086；4.加拿大農(nóng)業(yè)部馬鈴薯研究中心, 加拿大 弗萊德里克頓 E3B4Z7)

【研究意義】馬鈴薯作為中國(guó)第四大糧食作物，重要的經(jīng)濟(jì)和蔬菜作物，隨著其栽培面積的擴(kuò)大, 主糧化觀點(diǎn)的提出，在生產(chǎn)中提高其產(chǎn)量及品質(zhì)變得至關(guān)重要。但日益嚴(yán)重突出的病害危害問題, 嚴(yán)重影響馬鈴薯的產(chǎn)量和品質(zhì), 制約著馬鈴薯生產(chǎn)的發(fā)展。其中馬鈴薯Y 病毒(Potato virus Y, PVY)是導(dǎo)致馬鈴薯病毒病發(fā)生的重要病毒，PVY幾乎在所有的馬鈴薯種植區(qū)都有分布。PVY會(huì)導(dǎo)致馬鈴薯退化, 降低馬鈴薯產(chǎn)量，嚴(yán)重的減產(chǎn)可達(dá)80 %左右[1]。植株被PVY 侵染后，會(huì)出現(xiàn)花葉、葉脈壞死和垂葉條斑壞死等癥狀。我國(guó)PVY 帶毒率，其南部顯著高于北部，造成我國(guó)中部和南部的馬鈴薯種植區(qū)不能自行留種，必須從東北、內(nèi)蒙古等發(fā)病較輕的地區(qū)調(diào)種或直接購(gòu)買脫毒種薯, 這一舉措使生產(chǎn)成本大幅提高，形成巨大損失?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】馬鈴薯Y病毒(Potato virus Y, PVY)是馬鈴薯Y 病毒科(Potyviridae)、馬鈴薯Y 病毒屬(Potyvirus) 的代表種。PVY為正義單鏈RNA病毒，其基因組全長(zhǎng)約9.7 kb，5’末端具有基因組連接蛋白(Virus-encoded genome linked protein, VPg )，3’末端有poly (A)尾巴，5’端和3’端均有非翻譯區(qū)(Untranslational region, UTR)[2]。PVY全基因組包含一個(gè)大的開放閱讀框(open reading frame, ORF)，在基因表達(dá)時(shí)先翻譯成一個(gè)大約3062個(gè)氨基酸的多聚蛋白，再通過自身編碼的蛋白酶將多聚蛋白切割成10個(gè)成熟的蛋白。加工后的成熟蛋白從N端到C端分別為:P1，HC-Pro，P3，6K1，CI ，6K2，VPg，NIa，NIb,CP[3-4]。PVY 基因組中存在頻繁發(fā)生的基因重組，基因重組在PVY的進(jìn)化過程中是一種重要而有效的手段，這使得PVY 株系分化嚴(yán)重。根據(jù)寄主植物反應(yīng)不同，已被廣泛認(rèn)可的PVY 株系種類常見的3種分別為：普通株系(ordinary strain，PVYO)、點(diǎn)刻斜條株系(stipple streak strain，PVYC)和葉脈壞死株系(necrotic strain，PVYN)。但隨著種植區(qū)域的全球化，PVY存在頻繁變異，不斷有新的重組株系出現(xiàn)[5]，并在全球的不同地區(qū)蔓延[6]。這些新分化出的株系一般被認(rèn)為由PVYN和PVYO重組而來(lái)，主要包括PVYNTN和PVYN-Wi株系。PVYNTN及PVYN-Wi分別發(fā)現(xiàn)于匈牙利和波蘭[7]，但在很短的時(shí)間內(nèi)，在其它地區(qū)的薯塊中，2種株系亦能被檢出[8-9]。從目前田間檢測(cè)及研究來(lái)看，PVYN-Wi株系可以侵染很多的馬鈴薯品種，但在癥狀的表現(xiàn)上卻沒有PVYN嚴(yán)重，有些受侵染的植株甚至沒有癥狀表現(xiàn)[10-11]。而PVYNTN則可以導(dǎo)致具有PVY敏感性的馬鈴薯品種產(chǎn)生塊莖壞死癥狀[12]。同時(shí)，Ali等[13]研究發(fā)現(xiàn)PVY 敘利亞分離物的基因組具有明顯的PVYNTN和PVYN-Wi株系的重組特征，故將其命名為PVYNTN-NW株系。PVYNTN-NW株系可對(duì)馬鈴薯生產(chǎn)造成較嚴(yán)重的影響，研究發(fā)現(xiàn)其可使馬鈴薯塊莖產(chǎn)生PTNRD，這與PVYN-Wi株系并不相同。對(duì)PVY株系進(jìn)行科學(xué)、合理的分類、劃分，進(jìn)行及時(shí)準(zhǔn)確的鑒定，既有助于PVY的檢測(cè)檢疫，更有助于在馬鈴薯生產(chǎn)實(shí)踐中做到及時(shí)的防病、抗病，對(duì)提高馬鈴薯脫毒種薯的質(zhì)量及商品薯的產(chǎn)量有極大的幫助。隨著現(xiàn)代植物病毒病原檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，由于各種檢測(cè)方法均存在這各自的不足且人們?cè)谏a(chǎn)中的要求的提高，我們迫切的需要一種高效、穩(wěn)定并且更為靈敏的方法在生產(chǎn)中應(yīng)用，而簡(jiǎn)單的通過酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)、Ig 指示試紙法、免疫電鏡、反轉(zhuǎn)錄RT-PCR檢測(cè)、核酸斑點(diǎn)雜交(Nucleic acid spot hybridization, NASH)等方法，已不能滿足我們對(duì)PVY的檢測(cè)。【本研究切入點(diǎn)】本實(shí)驗(yàn)引入實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)(Real-Time PCR)，應(yīng)用于PVY檢測(cè)中。qRT-PCR作為目前檢測(cè)靈敏度最高(是普通RT-PCR的1000倍左右)，同時(shí)具有高特異性、定量、便捷、快速、自動(dòng)化等優(yōu)點(diǎn)的技術(shù)，廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、微生物和動(dòng)植物疾病檢疫等領(lǐng)域[14-16]。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)(qRT-PCR)，可同時(shí)成功的鑒別出基因結(jié)構(gòu)相似的PVYN-Wi和PVYNTN-NW2種株系?！緮M解決的關(guān)鍵問題】為今后更方便快捷的鑒定株系提供理論基礎(chǔ)；同時(shí)因其具有超高的靈敏度，可更快速、便捷、精準(zhǔn)的對(duì)田間疑似感染PVY的苗期樣品的鑒定提供技術(shù)支持，更好的提高馬鈴薯脫毒種薯的質(zhì)量及商品薯的產(chǎn)量。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試管苗由黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物脫毒苗木研究所保存，選擇編號(hào)BDH-2即PVYN-Wi株系，編號(hào)2013-W-369-12即PVYNTN-NW株系作為試驗(yàn)樣品。

1.2 主要試劑

RNA提取試劑盒采購(gòu)于艾德萊生物公司，各種酶制劑，dNTP等試劑采購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司、Promega公司和Invitrogen公司，PVYO、PVYN和PVY、PVX、PVS、PVM、PVA、PLRV 6種病毒的DAS-ELISA試劑盒采自Agdia公司。

1.3 DAS-ELISA檢測(cè)

對(duì)所取的新鮮葉片，進(jìn)行樣品提取，同時(shí)對(duì)PVYO、PVYN株系和PVY、PVX、PVS、PVM、PVA、PLRV 6種病毒分別取2份陰性材料(保存的凍干粉樣品)，2份陽(yáng)性材料(保存的凍干粉樣品)，進(jìn)行酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(DAS-ELISA)，每份樣品進(jìn)行3次重復(fù)，分別進(jìn)行PVYO、PVYN株系和PVY、PVX、PVS、PVM、PVA、PLRV 6種病毒檢測(cè)。

圖1 PVY株系基因組結(jié)構(gòu)多重PCR檢測(cè)的引物位置(箭頭)和預(yù)期產(chǎn)物(黑條)[7]Fig.1 Primer location (arrows) and expected products (black bar)[7]of genomic structure of PVY strains targeted by multiplex PCR assay

1.4 RNA的提取及cDNA的獲得

利用PLANT pure通用植物總RNA快速提取試劑盒(艾德萊生物)提取樣品葉片的總RNA，-20 ℃保存?zhèn)溆谩? μl總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到cDNA，反轉(zhuǎn)錄使用TAKARA公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒，操作方法見說(shuō)明書。

1.5 RT-PCR引物選擇

根據(jù)2010年Ali[7]試驗(yàn)中對(duì)序列的分析總結(jié)(圖1)，選用其文中提到的n2258[17]，o2700[7]；S5585m[17]，o6400[7]作為初步鑒定PVYN-Wi株系的特異擴(kuò)增引物，n2258[17]，o2700[7]；n7577[7]，YO3-8648[18]作為初步鑒定PVYNTN-NW株系的特異擴(kuò)增引物(表1)。

1.6 RT-PCR擴(kuò)增

利用多重RT-PCR方式完成擴(kuò)增，進(jìn)行PVY檢測(cè)，PCR擴(kuò)增采用25 μl體系，取上述反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2 μl, 加5’端引物和3’端引物(10 μmol/L)各0.5 μl，10×PCR Buffer 2.5 μl，TaqDNA聚合酶0.15 μl, dNTP(2.5 mmol/L)0.25 μl, MgCl2(2.5 mol/L)2.6 μl，補(bǔ)水至25 μl。

PCR反應(yīng)條件為：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，64 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，10個(gè)循環(huán)，94 ℃ 30 s，62 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，10個(gè)循環(huán)，94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，10個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min。PCR反應(yīng)結(jié)束后取反應(yīng)產(chǎn)物5 μl，利用1.0 %的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

表1 本研究中所用引物Table 1 Primers used in this study

1.7 qRT-PCR引物的設(shè)計(jì)及合成

參考Boonham等[19]的方法(圖2)，通過Genebank查找馬鈴薯Y病毒PVYN-Wi和PVYNTN-NW株系的全基因組序列，并參照高芳鑾等[20]對(duì)于PVY不同株系的基因組結(jié)構(gòu)的分析，最終選擇運(yùn)用GenBank:KX184816作為PVYN-Wi株系的全基因組序列，GenBank:KY848008作為PVYNTN-NW株系的全基因組序列，根據(jù)比對(duì)結(jié)果，分別設(shè)計(jì)PVYN-Wi和PVYNTN-NW株系的qRT-PCR特異性引物(表2) ，引物送由生工生物工程(上海)有限公司合成，作為實(shí)時(shí)熒光定量PCR的引物。

1.8 qRT-PCR擴(kuò)增

20 μl反應(yīng)體系中, 取上述反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2 μl， 加5’端引物和3’端引物(10 μmol/L)各0.4 μl，10×PCR Buffer 2 μl，TaqDNA聚合酶0.12 μl，dNTP(2.5 mmol/L)0.2 μl，MgCl2(2.5 mol/L)2 μl，染料(Eva-Green)1 μl，補(bǔ)水至20 μl。應(yīng)條件為：94 ℃ 5 min；92 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)；60～95 ℃測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物的熔解曲線。

圖2 PVY株系基因組序列比對(duì)[20]Fig.2 Genome sequence alignment of PVY strains[20]

表2 引物設(shè)計(jì)Table 2 Design of primers

表3 樣品的DAS-ELISA檢測(cè)Table 3 DAS-ELISA test results of samples

注：A為BDH-2(PVYN-Wistrain)的樣品(A1, A2, A3分別為3次重復(fù))； B為2013-W-369-12(PVYNTN-NWstrain)的樣品(B1,B2,B3分別為3次重復(fù))。
Note:A is the sample of BDH-2(PVYN-Wistrain; A1, A2, A3 are the three repetition of A); B is the sample of 2013-W-369-12(PVYNTN-NWstrain; B1,B2,B3 are the three repetition of B).

1.9 田間樣品的qRT-PCR檢測(cè)

通過對(duì)黑龍江地區(qū)進(jìn)行田間普查，采集具有如花葉，脈壞死、斑塊等顯著PVY癥狀的馬鈴薯葉片樣品，從中選出100份樣品用于檢測(cè)，置于-80 ℃冰箱中保存。利用所設(shè)計(jì)的qRT-PCR的引物，對(duì)留存的100份樣品進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 PVYN-Wi、PVYNTN-NW株系樣品的DAS-ELISA鑒定

利用PVYO、PVYN和PVY、PVX、PVS、PVM、PVA、PLRV 6種病毒的通用DAS-ELISA檢測(cè)試劑盒對(duì)PVYN-Wi和PVYNTN-NW株系樣品葉片的檢測(cè)結(jié)果見表3, 其中，樣品孔的OD405值大于陰性對(duì)照孔光密度值的2倍，即判為陽(yáng)性反應(yīng)。

所檢測(cè)實(shí)驗(yàn)樣品，對(duì)PVY檢測(cè)顯示為陽(yáng)性，PVX、PVS、PVM、PVA、PLRV均為陰性，可初步證明，保存的試管苗沒有受到其他病毒污染。同時(shí)，BDH-2和2013-W-369-12樣品對(duì)于PVYO檢測(cè)均表現(xiàn)為陽(yáng)性，2013-W-369-12樣品PVYN檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，BDH-2的PVYN檢測(cè)結(jié)果為陰性。

M：DNA marker;1,2,3列為BDH-2(PVYN-Wi strain)樣品的條帶； 5,6,7為2013-W-369-12(PVYNTN-NW strain)的樣品的條帶圖3 樣品的PCR檢測(cè)Fig.3 Results of PCR detection for samples

2.2 PVYN-Wi、PVYNTN-NW株系樣品的RT-PCR檢測(cè)

用選擇的相應(yīng)引物對(duì)PVYN-Wi和PVYNTN-NW株系的樣品葉片，6份樣品進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)結(jié)表明，BDH-2樣品，可以同時(shí)擴(kuò)增出約400 和800 bp左右的產(chǎn)物，與方法中的PVYN-Wi株系檢測(cè)結(jié)果一致，說(shuō)明BDH-2為PVYN-Wi株系；而2013-W-369-12樣品，則同時(shí)擴(kuò)增出約400 和1000 bp左右的產(chǎn)物，與方法中的PVYNTN-NW株系檢測(cè)結(jié)果一致，說(shuō)明2013-W-369-12的樣品為PVYNTN-NW株系 (圖3)。

2.3 PVYN-Wi、PVYNTN-NW株系樣品的qRT-PCR檢測(cè)

利用設(shè)計(jì)的PVYN-Wi和PVYNTN-NW株系的特異性引物對(duì)試驗(yàn)中的6份樣品，進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，PVYN-Wi株系的葉片樣品的溶解曲線峰值為(87.59±0.03) ℃，PVYNTN-NW株系的葉片樣品的溶解曲線峰值為(84.78±0.15) ℃(圖4～5)。

圖4 PVYN-Wi株系溶解曲線Fig.4 Dissolve curves of PVYN-Wi strains

圖5 PVYNTN-NW株系溶解曲線Fig.5 Dissolve curves of PVYNTN-NW strains

由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，PVYN-Wi和PVYNTN-NW株系溶解曲線峰值不同，表明其具有不同的溶解溫度。

2.4 樣品驗(yàn)證

對(duì)隨機(jī)采集的100份病毒癥狀的樣品，運(yùn)用本實(shí)驗(yàn)所設(shè)計(jì)的引物，進(jìn)行多重qRT-PCR檢測(cè)后，其中有32份樣品，溶解曲線峰值為87.51 ℃左右，即這32份馬鈴薯樣品，受到PVYN-Wi株系侵染；27份樣品，溶解曲線峰值為84.78 ℃左右，表明這27份馬鈴薯樣品，受到PVYNTN-NW株系侵染；同時(shí)存在9份樣品，其溶解曲線存在84.78和87.51 ℃ 2個(gè)峰值，這9份樣品可能同時(shí)受到PVYN-Wi、PVYNTN-NW株系的侵染(圖6～7)。另32份樣品，在87.51和84.78 ℃附近沒有顯著的峰值，故判定其沒有受到PVYN-Wi、PVYNTN-NW株系侵染。同時(shí)對(duì)這100份樣品進(jìn)行DAS-FLISA和RT-PCR檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果和qRT-PCR一致。

3 討 論

隨著馬鈴薯Y病毒發(fā)病面積的逐步擴(kuò)大，馬鈴薯的產(chǎn)量受到巨大影響，同時(shí)因其地理位置、氣候等原因的改變，多種變異的產(chǎn)生，新的重組株系的出現(xiàn)，使科學(xué)家對(duì)其的研究熱情也在逐步增加。

對(duì)于PVY的檢測(cè)方法：①生物學(xué)方法。通過觀察植株的相應(yīng)病害癥狀，即指示植物接種后的表象癥狀觀察及細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的觀察等。對(duì)于馬鈴薯本身，不同PVY株系在馬鈴薯品種上會(huì)引起不同的癥狀，對(duì)于葉片及葉脈可能產(chǎn)生花葉，脈壞死等，對(duì)于薯塊可能產(chǎn)生PTNRD即馬鈴薯塊莖壞死環(huán)斑病(potato tuber necrotic ringspot disease，PTNRD)[21]。另外，對(duì)于指示植物，PVY可在德伯尼煙、心葉煙、克利夫蘭煙、光曼陀羅、番茄上引起相應(yīng)的系統(tǒng)癥狀。因此可以根據(jù)這些相應(yīng)癥狀及指示植物相應(yīng)癥狀進(jìn)行檢測(cè)，但通過生物學(xué)檢測(cè)方法，獲得檢測(cè)結(jié)果所需時(shí)間長(zhǎng)，并且植物在不同的環(huán)境下會(huì)表現(xiàn)不同的癥狀，因而此方法很難用于大規(guī)模檢測(cè)，大部分情況下還需結(jié)合電鏡觀察和血清學(xué)試驗(yàn)才能做出判斷。②利用血清型劃分PVY株系。可以利用O血清型特異單抗和N血清型特異單抗將PVY株系劃分為O、N這2 組，PVYO、PVYC、PVYN-Wi、PVYN:O等株系對(duì)于O血清型特異單抗呈陽(yáng)性；PVYN、PVYZ、PVYE、PVYNTN、PVYNA-N等株系對(duì)于N血清型特異單抗呈陽(yáng)性[5,22]。但這種劃分過于寬泛，還存在部分株系對(duì)兩種抗體都表現(xiàn)為陽(yáng)性，Ali等曾報(bào)道一個(gè)敘利亞的PVY分離物(PVY-12)可同時(shí)與這2 種特異單抗反應(yīng)[9]，即本文中提到的PVYNTN-NW株系就與這2種抗體都反應(yīng)。目前市面上的許多血清型特異單抗可以和多個(gè)PVY株系反應(yīng)，并不能完全用于PVY 株系的特異鑒定[22]。如果通過血清學(xué)方法對(duì)株系進(jìn)行更好檢測(cè)劃分需要開發(fā)更優(yōu)的特異單抗。③依據(jù)基因序列特征進(jìn)行PVY 株系劃分。隨著PVY研究的深入，更多的PVY基因組序列的測(cè)定，PVY不同株系間的核苷酸序列差異逐漸明朗，最初利用PCR-RFLP(限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性)技術(shù)和核酸分子雜交技術(shù)鑒定了PVYN株系[18,23]。隨后依據(jù)各株系的特征性核苷酸位點(diǎn)差異，建立了PVY不同株系的一系列RT-PCR(反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)) 技術(shù)[24-27]。隨著研究的深入，技術(shù)的進(jìn)步，這些檢測(cè)技術(shù)在發(fā)展過程中，逐漸出現(xiàn)一些不足需要完善。隨之，qRT-PCR(實(shí)時(shí)熒光定量PCR) 技術(shù)的誕生，其優(yōu)勢(shì)顯著，操作更加便捷，在PCR精準(zhǔn)定性的基礎(chǔ)上能夠?qū)悠愤M(jìn)行定量檢測(cè)，對(duì)樣品的含毒量要求降低，在樣品中病毒含量非常少、還未表現(xiàn)明顯癥狀的情況下即可進(jìn)行檢測(cè)，可準(zhǔn)確、及時(shí)的作出早期診斷[27]，為日后的防病，控病提供數(shù)據(jù)支持，并有助于更好的提高商品薯的產(chǎn)量。

32份受PVYN-Wi株系侵染，27份受PVYNTN-NW株系侵染32 samples infected by PVYN-Wi strain, 27 samples infected by PVYNTN-NW strain 圖6 檢測(cè)樣品溶解曲線Fig.6 Dissolution curves of tested samples

9份同時(shí)受PVYN-Wi、PVYNTN-NW株系侵染9 samples infected by PVYN-Wi and PVYNTN-NW strain圖7 檢測(cè)樣品溶解曲線Fig.7 Dissolution curves of tested samples

近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的通過基因重組產(chǎn)生的亞株系，PVYNTN、PVYN-Wi、PVYN:O等重組株系，是PVYO和PVYN株系之間不同基因區(qū)段重組而成的[28]。采用本文設(shè)計(jì)的引物，對(duì)黑龍江省的樣品進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)的結(jié)果表明PVYNTN-NW株系和PVYN-Wi株系的樣品在田間的存在占較高的比例，與高芳鑾等[29]對(duì)中國(guó)14個(gè)省PVY 分離物的檢測(cè)鑒定結(jié)果相近，表明PVY 在馬鈴薯主要種植區(qū)普遍存在的多為重組株系，與沈林林等[30]采用多基因聯(lián)合方法鑒定馬鈴薯Y 病毒株系的組成的結(jié)果，重組株系已經(jīng)成為了田間的主流株系(100 %)，包括PVYNTN-NW株系SYR-I 型、PVYNTN-NW株系SYR-II 型、PVYN-Wi株系和PVYE株系的結(jié)果相一致。

同時(shí)通過田間觀察及檢測(cè)來(lái)看，PVYN-Wi株系可侵染的馬鈴薯品種較多，但癥狀普遍較輕，有些甚至沒有明顯的癥狀表現(xiàn)[10-11]。而PVYNTN和PVYNTN-NW株系則可以導(dǎo)致部分對(duì)PVY敏感性的馬鈴薯品種產(chǎn)生重花葉，脈壞死甚至塊莖壞死等癥狀[12]。PVY株系間因突變、缺失、插入、重組等原因，基因的遺傳變異呈現(xiàn)多樣化，尤其PVYN-Wi和PVYNTN-NW株系作為基因組結(jié)構(gòu)極為相似的兩種重組株系，但對(duì)馬鈴薯造成的癥狀和危害并不相同，故對(duì)馬鈴薯Y病毒，進(jìn)行精準(zhǔn)便捷的檢測(cè)，鑒別其不同株系，變得至關(guān)重要。

對(duì)于PVY病毒的研究，重組株系被認(rèn)為可能比非重組株系具有更強(qiáng)的致病力[28]，并已在世界各馬鈴薯種植區(qū)越來(lái)越流行，因此生產(chǎn)上需要密切關(guān)注這些重組株系的發(fā)展動(dòng)態(tài)。本文通過設(shè)計(jì)特異性引物，應(yīng)用多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)(qRT-PCR)，成功并同時(shí)的鑒別出PVYN-Wi和PVYNTN-NW株系，為更方便快捷的鑒定株系提供了方法，但仍有很多我們需要去探索，希望在此基礎(chǔ)上，對(duì)PVY株系的研究能夠更好的繼續(xù)深入下去。

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