姚華開，劉岳飛，張傳進，吳人敏，楊尚東，2*

(1. 廣西大學農學院，廣西 南寧 530004；2. 廣西壯族自治區(qū)農業(yè)科學院甘蔗研究所/廣西甘蔗遺傳改良重點實驗室，廣西 南寧 530007)

【研究意義】隨著經濟的發(fā)展，人們對高品質蔬菜數量的需求越來越高。規(guī)模逐年擴大的蔬菜生產中存在著種植模式單一、偏施化肥等弊端，導致菜園土壤連作障礙現象發(fā)生嚴重。同時受土地資源短缺、種植習慣、環(huán)境條件和經濟利益驅動等條件制約，目前全國各地在同一地塊上連續(xù)種植同科或同種作物的現象非常普遍[1]，廣西秋冬蔬菜主要以葫蘆科、豆科、十字花科蔬菜作物為主，其中葫蘆科作物設施生產中連作障礙危害尤為嚴重。因此，篩選對葫蘆科作物具有促生效果的間套種作物，通過生物防治的手段，有效的減輕連作障礙的發(fā)生，對蔬菜的實際生產有著積極的推動意義。【前人研究進展】長期以來，國內外研究人員從土壤物理學、化學、生物學、植物營養(yǎng)學、土壤微生物學以及生態(tài)學等多學科入手，系統(tǒng)研究了作物連作障礙發(fā)生的原因。一般認為作物發(fā)生連作障礙的主要原因包括：①土壤理化性狀劣化導致養(yǎng)分虧缺[2]；②土壤微生物群落結構變化[3]；③化感自毒作用[4]等。長期以來，研究人員通過施用生防菌調節(jié)土壤中微生物[4-5]、土壤消毒[6]以及嫁接[7]等技術措施減輕連作障礙的危害并取得了良好的效果。另外，研究還發(fā)現利用具有化感作用的十字花科、蔥蒜類及禾本科植物與主栽作物進行輪作或間套作等方式優(yōu)化種植制度，能有效減輕連作障礙對連作蔬菜的危害[8-10]。其中，蔬菜套作禾本科植物減輕連作障礙危害的機理在于提高了土壤有機質含量以及相關酶的活性，提高了作物對包括無機氮在內的營養(yǎng)成分的吸收與利用，并減少諸如枯萎病等土傳病原菌的數量[11]。但由于玉米和毛竹等禾本科植物多為高桿作物，在間套種栽培中往往容易遮光，不利于矮桿作物的光合作用。土壤微生物在土壤功能的有效發(fā)揮和生態(tài)系統(tǒng)中充當著非常重要的角色，有關土壤中大多數的化學反應和C、N及P等的循環(huán)，土壤微生物都發(fā)揮了很重要的促進作用。此外，土壤微生物數量在一定程度上能反應出土壤的質地和健康狀況[12-13]。【本研究切入點】廣西秋冬菜生產主要以葫蘆科、豆科及十字花科蔬菜作物為主，其中以葫蘆科的瓜類蔬菜設施生產中連作障礙危害尤為嚴重，但目前相關研究較少。為此，篩選以豇豆為代表的豆科作物和以紅薯為代表的旋花科作物，比較它們與葫蘆科(黃瓜、瓠瓜和南瓜)作物根際土壤生物學性狀及細菌多樣性特征差異。【擬解決的關鍵問題】探究土壤生物學性狀及細菌多樣性能否作為篩選具有促生效果作物的鑒定指標，為進一步創(chuàng)建生物多樣性豐富的葫蘆科作物根際土壤微環(huán)境，構建連作障礙的生態(tài)防控技術體系提供理論依據與技術支撐。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗于2016年2月在廣西欽州市欽北區(qū)鎂源蔬菜專業(yè)合作社基地(北緯22°41′，東經108°56′)進行，供試土壤于2016年5月下旬采集自該基地。土壤樣品分別為栽培管理條件相同的葫蘆科作物(黃瓜、瓠瓜和南瓜)、豆科的豇豆與旋花科紅薯的根際土壤，設置3次重復，未種植作物的土壤為對照。采集的土壤樣品過2 mm篩后置于4 ℃保存，用于土壤生物學性狀及細菌多樣性的測定。土壤理化性狀如表1所示。

1.2 試驗方法

1.2.1 測定指標與方法 (1)土壤生物學特性分析。土壤微生物計數選取稀釋平板法，微生物生物量C、N和P的測定，土壤中C、N及P循環(huán)相關酶β-葡糖苷酶、氨肽酶及磷酸酶活性均參考李振高等[14]的方法測定。

表1 不同作物根際土壤理化性狀Table 1 Soil physical and chemical properties of different crops rhizosphere

注：同列數據后不同小寫字母表示差異達顯著水平(P<0.05)，下同。
Note：Values followed by different lowercase letters in the same column are significantly different at 0.05 level. The same as below.

表2 不同作物根際土壤中可培養(yǎng)微生物數量Table 2 The number of microorganisms in rhizosphere soil of different crops

(2)土壤細菌群落結構分析。土壤微生物基因組總DNA提取參照趙久成[15]的方法，采用Bio-Rad公司DCode TM基因突變檢測系統(tǒng)(DCode Universal Mutation Detection System, Bio-Rad)對PCR反應產物進行分離，并用掃描系統(tǒng)掃描成圖像保存圖片。然后對切下來的目的條帶進行細菌16S rDNA片段的克隆和測序，最后的測序結果于NCBI(http://www. ncbi. nlm. nih. gov/)進行序列同源性比對與分析。

1.2.2 數據處理 試驗數據采用Excel 2003和SPSS 19.0統(tǒng)計軟件對試驗數據進行統(tǒng)計分析，平均數據用“平均數±標準差(SD)”表示。DGGE圖譜分析參照馬寧寧和李天來的方法[16]進行。

2 結果與分析

2.1 不同作物根際土壤生物學性狀特征

2.1.1 不同作物根際土壤可培養(yǎng)微生物數量 由表2可知，不同作物根際土壤中可培養(yǎng)細菌數量以紅薯為最高，其次分別為豇豆>南瓜>對照>黃瓜>瓠瓜，而且各個作物根際土壤中可培養(yǎng)細菌數量間均存在顯著差異；可培養(yǎng)真菌數量則呈現南瓜>豇豆>紅薯>黃瓜>對照>瓠瓜的趨勢，但紅薯、黃瓜、瓠瓜和對照之間不存在顯著差異；可培養(yǎng)放線菌數量呈現南瓜>紅薯>對照>黃瓜>豇豆>瓠瓜的趨勢。其中，可培養(yǎng)細菌、真菌和放線菌數量均以瓠瓜為最低，且3種葫蘆科作物中，除南瓜外，黃瓜和瓠瓜根際土壤中可培養(yǎng)細菌、真菌和放線菌數量均顯著低于相應的旋花科的紅薯；黃瓜、瓠瓜根際土壤中可培養(yǎng)細菌和真菌數量亦顯著低于豆科的豇豆。上述結果表明：不同科屬作物根際土壤環(huán)境中的可培養(yǎng)微生物數量之間極易形成顯著差異，但同科作物之間未必存在顯著差異。

2.1.2 不同作物根際土壤微生物生物量C、N和P特征 由表3可知，與對照相比，除黃瓜和豇豆根際土壤的微生物生物量氮外，不同科屬作物根際土壤微生物生物量C、N和P均顯著高于對照，這表明栽植作物有助于提高根際土壤中的微生物生物量C、N和P水平。另一方面，葫蘆科作物中，微生物生物量C以南瓜根際土壤為最高，但微生物生物量N和P卻以瓠瓜根際土壤為最高。同時，微生物生物量P在3種葫蘆科作物根際土壤之間雖呈現一定的差異，但其并不顯著。與之相比，豆科的豇豆和旋花科的紅薯根際土壤中微生物生物量C、N和P雖然不全高于葫蘆科作物，甚至低于葫蘆科作物根際土壤的相應數值，但微生物生物量P與葫蘆科作物之間均存在顯著差異。上述結果表明：栽培種植相同科的作物時，對根際土壤微環(huán)境影響的差異性不顯著(如本試驗的生物量P)，相反，異科作物根際土壤之間極易形成土壤微生物生物量差異顯著的根際微環(huán)境。

表3 不同作物根際土壤微生物生物量C、N和PTable 3 Soil microbial biomass C, N and P in rhizosphere soil of different crops (mg·kg-1)

表4 不同作物根際土壤酶活性Table 4 Soil enzyme activities in rhizosphere soils of different crops (nmol /g·min, 30 ℃)

2.1.3 不同作物根際土壤酶活性 由表4可知，與對照相比，栽植作物均導致不同作物根際土壤的酶活性發(fā)生變化，其中與土壤碳循環(huán)相關的β-葡糖苷酶的表現為：紅薯最高，其次為豇豆，對照最低，其中黃瓜、瓠瓜，南瓜的表現水平幾乎一致，屬于同一表現水平(P>0.05)。磷酸酶是催化土壤中與P相關的循環(huán)，變化趨勢和β-葡萄糖苷酶一致。氨肽酶主要參與土壤中與N有關的循環(huán)，豆科植物由于有根瘤菌與其共生，在固氮方面能體現出一定的優(yōu)勢。氨肽酶的表現為：豇豆最高，明顯高于其他處理，其次是紅薯，南瓜和瓠瓜的表現一致。其中，同屬于葫蘆科作物的黃瓜與瓠瓜之間磷酸酶活性沒有呈現顯著差異，與旋花科的紅薯之間表現出顯著差異。

2.2 不同作物根際土壤細菌多樣性特征

2.2.1 不同作物根際土壤微生物總DNA及16S rDNA基因擴增產物 提取的土壤微生物總DNA，取5 μl在1.0 %瓊脂糖凝膠電泳中進行檢測，以2000 bp的Marker做對照，由圖1可知，提取出的DNA無雜帶、拖帶現象，質量良好，大小在2300 bp左右。此外，經測量得知其OD260/OD280值介于1.8和2.0，符合預期要求[17]，可以進行下一步實驗。

M：分子標注；A：CK；B：黃瓜；C：瓠瓜；D：南瓜；E：豇豆；F：紅薯M:Marker; A:CK; B:Cucumber; C:Bottle gourd; D:Pumpkin; E:Cowpea; F:Sweet potato圖1 根際土壤總DNA的瓊脂糖電泳圖譜Fig.1 Agarose gel electrophoresis of total DNA in rhizosphere soil

2.2.2 土壤細菌群落DGGE 圖譜分析 選取變性凝膠梯度電泳(DGGE)技術分離出PCR產物，獲得位置各異、數目不一的電泳條帶(圖2)。各個泳道條帶數為11～35條不等。如表 5 所示，使用Quantity One軟件對DGGE圖譜進行數字化處理和分析，最后計算出多樣性指數(H)、均勻度(E)及豐度(S)，三者是表征土壤微生物多樣性重要的數據指標。其中，對照的細菌多樣性指數最小、豐度最低。黃瓜泳道的條帶數最多，其余作物高低順序依次表現為紅薯>南瓜>豇豆>瓠瓜。但代表3種葫蘆科作物的泳道中除了瓠瓜泳道中缺失的條帶外，三者之間的共有條帶較多，如：條帶2、3、7、12和14均為黃瓜和南瓜的共有條帶；在豇豆和紅薯泳道中出現的條帶1、8、11和13均分別為這2種作物各自擁有的特異條帶。結果表明：同科作物根際土壤中容易形成細菌優(yōu)勢種群相同的根際微環(huán)境，而異科作物更有利于形成根際土壤細菌多樣性更為豐富的根際微環(huán)境，從而更有利于作物的生長和防止病蟲害的發(fā)生。

M：分子標注；A：CK；B：黃瓜；C：瓠瓜；D：南瓜；E：豇豆；F：紅薯M:Marker; A:CK; B:Cucumber; C:Bottle gourd; D:Pumpkin; E:Cowpea; F:Sweet potato圖2 根際土壤細菌PCR擴增產物的瓊脂糖電泳圖譜Fig.2 Agarose gel electrophoresis of PCR amplified products from rhizosphere soil

A：CK；B：黃瓜； C：瓠瓜； D：南瓜；E：豇豆； F：紅薯A:CK; B:Cucumber; C:Bottle gourd; D:Pumpkin; E:Cowpea; F:Sweet potato圖3 不同作物根際土壤細菌DGGE圖譜Fig.3 DGGE profile of the soil bacteria in the rhizosphere soils of different crops under greenhouse conditions

表5 不同作物根際土壤細菌多樣性特征Table 5 Bacterial diversities in rhizosphere soil of different crops

2.2.3 細菌16S rDNA片段的序列分析 從DGGE膠中選取出來的特征條帶如圖3所示。通過進行割膠、PCR及測序等過程，獲得15個條帶的序列，將測序的結果提交至NCBI GenBank數據庫中進行檢索和同源性比對，結果如表6所示。所得序列與已知序列都在95 %的相似水平上，其中8條為不可培養(yǎng)的細菌。另外，條帶4的測序序列與已發(fā)表的序列比對，最相似序列為假單胞菌屬(Pseudomonassp.)，其次，條帶5、7、8、12和15的測序序列比對結果分別與反硝化產堿菌(Alcaligenaceaesp.)、嗜麥芽糖寡養(yǎng)單胞菌屬(Stenotrophomonasmaltophiliasp.)、嗜熱寡養(yǎng)單胞菌屬(Stenotrophomonassp.)、黃單胞菌屬(Xanthomonassp.)、木糖氧化無色桿菌(Achromobacterxylosoxidanssp.)及氫噬胞菌屬(Hydrogenophagasp.)的相似度最高。

表6 土壤細菌的DGGE回收條帶序列分析Table 6 Sequence analysis of DGGE recovery of soil bacteria

3 討 論

3.1 不同作物根際生物學性狀的比較

本研究發(fā)現不同作物根際土壤中可培養(yǎng)細菌、真菌和放線菌數量于不同作物根際土壤之間幾乎都存在著顯著差異，但同科作物之間部分科屬雖然也存在顯著差異，但同樣存在著無顯著差異現象。李曉慧等[18]的研究表明大豆、小麥和玉米3種不同作物根系的根際微生物種類存在顯著的差異；丁莎莎[19]發(fā)現不同苧麻品種根際微生物數量差異明顯，與相關學者的研究結果基本一致。這說明相同土壤和栽培管理條件下，栽植不同作物所形成的根際土壤微環(huán)境中，可培養(yǎng)微生物數量之間極易形成顯著差異水平，但同科作物根際土壤之間卻不一定能形成顯著差異水平。

本研究結果表明同科作物根際土壤微生物生物量碳和氮雖然存在著顯著差異，但微生物生物量磷沒有呈現顯著差異；與之相反，不同作物根際土壤之間的微生物生物量碳、氮和磷之間均呈顯著差異，說明不同作物有助于形成根際土壤微生物生物量差異顯著的根際微環(huán)境，與前人研究結果相似[20]。同樣，從另一側面反映了土壤微生物生物量可作為鑒定和篩選具有互補效果間套種作物組合的生物學指標之一。

本研究中，同科作物根際土壤的β-葡糖苷酶和磷酸酶活性之間均無顯著差異，氨肽酶活性在同為葫蘆科的瓠瓜與南瓜之間亦不存在顯著差異；相同的酶活性水平下，可能導致作物對同種病害的抗性趨于一致或減弱，這一現象可能就是連作容易出現生長勢變弱的根本原因之一；與之相反，異科作物根際之間，無論是β-葡糖苷酶、磷酸酶或氨肽酶活性，都容易形成差異顯著的根際微環(huán)境，這與前人的研究基本一致[20-21]，表明這3種涉及碳、氮和磷循環(huán)的酶活性不僅可有效地反映同科作物或異科作物根際土壤中氮和磷等元素的生物有效性，還可以根據不同作物根際土壤酶活性的差異水平，指示不同作物根際微環(huán)境的互補性。因此，β-葡糖苷酶、磷酸酶和氨肽酶活性可作為篩選與鑒定間套種作物之間有無互補效果的生物學指標。

3.2 不同作物科屬根際土壤細菌多樣性的比較

根據 DGGE 的分析原理，每一個條帶大致代表土壤中微生物的一個優(yōu)勢種群，DGGE中每個泳道的條帶的數量直接體現出微生物種群的數量，即豐度的大小。該種微生物數量的多少則體現在每個條帶的亮度上[22]，條帶越亮，灰度越高，則表明該種微生物數量越多。本研究發(fā)現：同科作物根際土壤中容易形成優(yōu)勢細菌種群相同的根際微環(huán)境，而異科作物根際土壤中更有利于形成細菌多樣性更為豐富的根際微環(huán)境。進一步克隆及測序結果表明：成功測序的15條帶中，有8條測序序列為不可培養(yǎng)的細菌，占總數的一半以上?？芍膬?yōu)勢細菌種群中，不可培養(yǎng)鞘氨醇盒菌屬(UnculturedSphingopyxissp.)(條帶3)、嗜麥芽糖寡養(yǎng)單胞菌屬(Stenotrophomonasmaltophiliasp.)(條帶7)和黃單胞菌屬(Xanthomonassp.)(條帶12)是瓜類蔬菜的共有優(yōu)勢細菌種屬；而嗜熱寡養(yǎng)單胞菌屬(Stenotrophomonassp.)和木糖氧化無色桿菌屬(Achromobacterxylosoxidansp.)則是紅薯根際土壤中特異的優(yōu)勢細菌種屬；不可培養(yǎng)的細菌種屬(條帶11)則是豇豆根際土壤中特異的優(yōu)勢細菌種屬。

4 結 論

作物根際土壤中涉及碳、氮、磷循環(huán)的相關酶活性和細菌多樣性指數，以及作物根際土壤中富集的優(yōu)勢細菌種屬均適宜作為鑒定不同作物根際微環(huán)境之間是否具有互補效果的生物學指標；豇豆和紅薯根際土壤生物學特性表明豇豆和紅薯均具有改良葫蘆科作物黃瓜、瓠瓜和南瓜根際土壤微環(huán)境的潛力。

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