許瑞勝，何奇松，李春英，馮淑萍，易春華，韋達(dá)有，胡麗萍，黃勝斌，胡巧云，熊 毅，馬 琳*

(1.廣西動物疫病預(yù)防控制中心，廣西 南寧 530001；2.欽州市動物疫病預(yù)防控制中心，廣西 欽州 535000；3.桂林市動物疫病預(yù)防控制中心，廣西 桂林 541002)

【研究意義】豬流行性腹瀉(Porcine epidemic diarrhea, PED)可發(fā)生在各階段豬，主要危害哺乳仔豬且具有較高的死亡率，是由豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)感染引起的一種急性傳染性腸道疾病[1]。目前，我國共有26個省(市、自治區(qū))報道過PED的發(fā)生和流行情況， PED已屬我國嚴(yán)重的豬傳染病之一[2]。由于PED的現(xiàn)場診斷困難，傳染性較強(qiáng)，且治療效果不佳，即使在一些免疫PEDV疫苗的豬場，該病也常有發(fā)生，并可導(dǎo)致育肥豬的急性死亡。因此，對PEDV流行毒株的N基因序列進(jìn)行序列分析，對了解PEDV的流行及遺傳變異情況及制定防控策略均具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】我國在1982年首次分離到PEDV[3]，PEDV的N基因由1326個核苷酸組成，編碼含有441個氨基酸的N蛋白[4]。N蛋白能促進(jìn)復(fù)制體的形成和病毒的組裝，N蛋白與磷脂及細(xì)胞膜的結(jié)合在病毒的合成過程中發(fā)揮重要作用；PEDV屬于冠狀病毒屬，其N蛋白雖然在同屬病毒之間的同源性不高，但在同種病毒之間保守性很高。在感染PEDV早期的豬群體內(nèi)可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生較高水平的抗N蛋白抗體，因此N蛋白可以作為早期快速檢測PEDV感染的一個重要指標(biāo)[5]。研究表明，N蛋白具有較多功能，它既具有免疫原性，還能識別相應(yīng)靶位點(diǎn)，誘導(dǎo)機(jī)體的T細(xì)胞及B細(xì)胞免疫反應(yīng)，還參與病毒復(fù)制和轉(zhuǎn)錄[6-10]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】近年來，由豬病毒腹瀉引起的疾病在廣西普遍發(fā)生且呈逐年上升趨勢，而目前還沒有一種非常有效的方法來防止并控制PDE的傳染與發(fā)病。【擬解決關(guān)鍵問題】通過對臨床樣品進(jìn)行檢測，并分析其流行毒株遺傳變異情況，以期為今后PEDV的深入研究及有效防控提供參考，為廣西地區(qū)PEDV的臨床診斷及疫苗的選擇提供參考。

1 材料與方法

1.1 病料來源及陽性對照

2012-2016年從廣西南寧市、賀州市、來賓市、桂平市、陸川縣、貴港市、興安縣、象州縣等7個市(縣、地區(qū))共25個豬場采集疑似感染PEDV的仔豬腸系膜淋巴結(jié)或腸樣糞便樣品共計(jì)506份。將采集的樣品與滅菌PBS按1∶5的質(zhì)量體積制成懸液，經(jīng)反復(fù)凍融3次后，10 000 r/min于冷凍離心機(jī)離心5 min，取上清于-40或-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。陽性對照為豬傳染性胃腸炎、豬流行性腹瀉、豬輪狀病毒(G型)三聯(lián)活疫苗，購自哈爾濱維科生物技術(shù)開發(fā)公司。

1.2 主要試劑

核酸自動提取試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞等購自天根生化科技(北京)有限公司，一步法提取試劑盒、DL2000 DNA Marker、膠回收試劑盒、PCR反應(yīng)試劑、pMD18-T載體、限制性內(nèi)切酶等購自寶生物工程(大連)有限公司。

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成

下載GenBank數(shù)據(jù)庫中已發(fā)表PEDV CV777株(登錄號：AF353511)的N基因序列，利用Premier 5.0及Oligo 6.0軟件設(shè)計(jì)1對特異性引物擴(kuò)增PEDV的部分N基因，引物序列見表1，引物使用的濃度為25 pmol/μl。

表1 引物序列Table 1 Sequences of the primers

1.4 病毒總RNA的提取及RT-PCR擴(kuò)增

取已處理好的病料上清液，參照核酸自動提取試劑盒(磁珠法)操作步驟提取病毒RNA，對提取的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系為25.0 μl：RNA模板15.0 μl，5×M-MLV RTase Reaction Buffer 5.0 μl，反轉(zhuǎn)錄通用引物(25 pmol/μl)2.0 μl，dNTPs(10 mmol/L)2.0 μl，Rnasin inhibitor(40 U/μl) 0.5 μl，M-MLV RTase (200 U/μl)0.5 μl。反轉(zhuǎn)錄程序?yàn)椋?2 ℃ 1 h，95 ℃ 5 min，反應(yīng)結(jié)束即后獲得cDNA。以獲得的cDNA為模板，利用設(shè)計(jì)合成的特異性引物PEDV1/PEDV2進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為25.0 μl：10×PCR Buffer 2.5 μl， dNTP Mix(2.5 mmol/L)2.0 μl，引物PEDV1、PEDV2各0.5 μl，TaqDNA聚合酶(5 U/μl)0.2 μl，加ddH2O至25.0 μl。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃ 40 s，55 ℃ 40 s，72 ℃ 40 s，進(jìn)行32個循環(huán)；最后72 ℃延伸8 min。1.0 %瓊脂糖凝膠觀察PCR檢測結(jié)果。

1.5 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的回收、克隆及鑒定

參照膠回收說明書對PCR產(chǎn)物的目的基因進(jìn)行純化回收，將其與載體pMD-18T連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5α中，涂板，挑取白色菌落接種與LB培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，提取質(zhì)粒后，對其進(jìn)行酶切鑒定，將鑒定正確的陽性質(zhì)粒送寶生物工程(大連)有限公司進(jìn)行測序。

1.6 部分N基因序列分析

運(yùn)用Lasergene DNASTAR 7.1 軟件中的MegAlign程序?qū)⑺鶞y得的目的基因序列與GenBank已發(fā)表PEDVN基因參考序列進(jìn)行核苷酸及其推導(dǎo)氨基酸同源性比較分析，并繪制遺傳進(jìn)化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 病料中PEDV N基因的檢測

應(yīng)用一步法RT-PCR檢測方法，對506份樣品進(jìn)行PEDV核酸檢測，其中PEDV陽性數(shù)為184份，陽性率為36.36 %(表2)。PEDV 陽性樣品的PCR產(chǎn)物電泳條帶大小約485 bp，其中擴(kuò)增的4份陽性樣品電泳圖見圖1。

表2 PEDV臨床樣品檢測Table 2 The results of PEDV detection

M：DL 2000 DNA Marker；1～4：陽性樣品圖1 陽性樣品的RT-PCR電泳結(jié)果Fig.1 Electrophoretogram of positive samples amplified by RT-PCR

2.2 部分N基因的RT-PCR擴(kuò)增與鑒定結(jié)果

被檢測為PEDV陽性的樣品，選取的樣品進(jìn)行N基因RT-PCR擴(kuò)增。其中選取不同豬場的86份陽性樣品進(jìn)行N基因的RT-PCR擴(kuò)增。用1.0 %的瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增后產(chǎn)物。結(jié)果顯示，片段擴(kuò)增的長度大小和預(yù)期485 bp大小相符合(圖2)；用膠回收試劑盒對目的片段的DNA進(jìn)行回收，以備后續(xù)克隆用。將重組質(zhì)粒用HindⅢ和EcoR Ⅰ進(jìn)行酶切鑒定后，獲得約485 bp大小的目的條帶(圖3)。將酶切鑒定為陽性的質(zhì)粒送寶生物工程(大連)有限公司進(jìn)行測序，測序結(jié)果顯示擴(kuò)增的N基因?yàn)?85 bp。

M：DL 2000 DNA Marker ; 1:N基因; 2:陰性對照圖2 PEDV N基因擴(kuò)增電泳結(jié)果Fig.2 The electrophoresis results of PEDV N gene amplification

M：DL 2000 DNA Marker ; 1:N基因圖3 PEDV N基因的雙酶切電泳結(jié)果Fig.3 Electrophoretogram of PEDV N gene digested by double enzyme

右上方為核苷酸序列同源性，1～21為參考毒株，22～42為部分廣西毒株Nucleotide sequence homology was in the upper right of figure.1-21:reference strains;22-42:the part of strains in Guangxi 圖4 部分N基因與參考毒株的核苷酸同源性比較Fig.4 Homology comparison on nucleotide of N gene among partial N gene fragment of PEDV and reference strains

2.3 N基因序列同源性分析結(jié)果

對86份陽性樣品進(jìn)行部分N基因測序，應(yīng)用DNASTAR生物學(xué)信息軟件對N基因的核苷酸及其推導(dǎo)氨基酸進(jìn)行比較分析。結(jié)果顯示，N基因與參考株一樣沒有核苷酸插入和缺失，只有核苷酸的突變。測序所得的86份樣品的PEDVN基因的核苷酸同源性在94.2 %～100.0 %。部分廣西毒株的N基因核苷酸同源性及與參考毒株的核苷酸同源性如圖4所示。

2.4 部分N基因遺傳進(jìn)化樹

用生物學(xué)信息軟件DNAstar中Clustal W法，從GeneBank中下載經(jīng)典的代表PEDV參考毒株與本研究的86株毒株的核苷酸繪制進(jìn)化樹圖譜(圖5)。進(jìn)化樹圖譜顯示，本研究86株毒株以及引用的參考毒株一起可以分為Cluster 1、Cluster 2、Cluster 3、Cluster 4共4個群，其中本研究的GP35-8、LC37-22、LC107-5、LC107-19和LC107-16等5株毒株分屬Cluster 2群；而另外的81株毒株屬于Cluster 3。

本研究毒株所屬的Cluster 3毒株中與Cluster 1歐洲株CV777、韓國株SM98和中國株LZC經(jīng)典毒株之間核苷酸同源性為94.6 %～96.9 %；與Cluster 2韓國株DR13、日本株83P-5、中國株CH/S和CH-XIURUMQI-2011參考毒株之間的核苷酸同源性為95.1 %～97.3 %；與Cluster 4中國株CH-GXWM-2011、CHGD-01和CH-GDQY-3-2011參考株之間的核苷酸同源性為94.4 %～98.1 %；與Cluster 3 DX、LJB-03、HuN、JS-2004-2、HB-HS、BJ2010和YT12-4參考株之間的核苷酸同源性為95.7 %～100.0 %。本研究所屬于Cluster 2的5株毒株與Cluster 1歐洲株CV777、韓國株SM98和中國株LZC參考株之間核苷酸同源性為96.1 %～97.5 %；與Cluster 2韓國株DR13、日本株83P-5、中國株CH/S和CH-XIURUMQI-2011參考毒株之間的核苷酸同源性97.9 %～100.0 %；與Cluster 3 中國早期和近年毒株DX、LJB-03、HuN、JS-2004-2、HB-HS、BJ2010和YT12-4參考株之間的核苷酸同源性為95.3 %～96.9 %；與Cluster 4中國株CH-GXWM-2011、CHGD-01和CH-GDQY-3-2011參考株之間的核苷酸同源性為95.3 %～97.3 %。上述同源性比較結(jié)果見圖4。

3 討 論

本研究對近年來廣西25個豬場的506份臨床樣品進(jìn)行PEDV核酸檢測，結(jié)果顯示，PEDV的陽性數(shù)為184份，陽性率為36.36 %；與郭旋等[11]、盧冰霞等[12]、羅六龍等[13]、毛黎紅等[14]報道基本一致，說明豬流行性腹瀉病毒仍是引起我國及我區(qū)仔豬腹瀉的一個主要病毒性病原。據(jù)有關(guān)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析顯示，近年來流行性腹瀉病毒在我國居高不下，腹瀉病毒也是目前危害我國最嚴(yán)重的疾病之一，可導(dǎo)致新生仔豬成活率低，生長緩慢或停滯。雖然現(xiàn)有疫苗并不能提供充分的免疫保護(hù)，但接種疫苗仍是目前防控該病的最好措施。

豬流行性腹瀉病毒N基因編碼病毒的核衣殼蛋白，參與病毒在感染宿主內(nèi)復(fù)制[15]。該蛋白有較強(qiáng)的抗原性，一方面誘導(dǎo)感染機(jī)體B細(xì)胞和T細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞免疫反應(yīng)，另一方面使宿主感染PEDV早期就能在機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生較高水平的抗體。吳玉璐等[16]對我國近年來部分豬場PEDV流行株的N蛋白抗原性就行分析，顯示毒株之間的核苷酸和氨基酸的同源性分別為99.8 %～100.0 %和98.8 %～100.0 %，與參考株有較高的氨基酸同源性，其中與CH/S毒株親緣關(guān)系較近，屬于一個分支，說明當(dāng)前流行株N蛋白和以前毒株N蛋白比較保守。Chen等[17]對中國部分省的32個豬場當(dāng)前流行PEDV的N基因進(jìn)行測序分析，結(jié)果顯示N基因之間的同源性大于95.0 %，和其他中國參考株同源性為95.6 %～99.7 %。毒株彼此之間同源性為100 %的毒株與至弱的參考毒株CV777、DR13和83P-5的核苷酸同源性為95.9 %～100.0 %。32株中有12株屬于1群，其中包括參考株CH/S、83P-5；14株屬于3群，包括五株中國參考株LJB/03、JS-2004-2、DX、BJ2010和HB/HS。6株(CH/GXQZ/2011、CH/GXWP/2011、CH/ZJHZ/2011、CH/HLJHH/2011)等屬于4群，和其他中國株有基因差異，也許代表著PEDV新的基因型。

86份樣品部分N基因測序分析顯示，N基因與參考毒株都沒有核苷酸插入和缺失，只有核苷酸的點(diǎn)突變。86株P(guān)EDVN基因的核苷酸同源性在94.2 %～100.0 %；其與參考株之間的核苷酸同源性在94.1 %～100.0 %。LC107-16、LC107-19與參考毒株83P-5的同源性為100.0 %。PEDV可以分為4個群，其中歐洲株CV777、韓國株SM98、中國株LZC屬于Cluster 1；韓國株DR13、日本株83P-5、中國株CH/S、CH-XIURUMQI-2011，以及包括本研究的GP35-8、LC37-22、LC107-5、LC107-19和LC107-16 五株毒株屬于Cluster 2；中國株CH-GXWM-2011、CHGD-01和CH-GDQY-3-2011等屬于Cluster 4；本研究的其他81株毒株及中國株DX、LJB-03、HuN、JS-2004-2、HB-HS等屬于Cluster 3。說明本研究的大部分毒株和我國國內(nèi)早期和近年的毒株DX、LJB-03、JS-2004-2、BJ2010等親緣關(guān)系比較近，PEDV在流行傳播的過程中N基因比較保守。該病是目前危害我國養(yǎng)豬業(yè)較為嚴(yán)重的疾病之一，其在廣西地區(qū)的豬群感染和發(fā)病必須引起高度重視。

圖5 N基因遺傳進(jìn)化樹Fig.5 Phylogenetic tree of N gene

4 結(jié) 論

PEDV是引起廣西地區(qū)規(guī)?；i場新生仔豬腹瀉的主要病原，廣西地區(qū)的PEDV可分為2個群且其N基因仍然保守。

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