王新平，王彩云，張建武

(1 洪湖市第二人民醫(yī)院，湖北洪湖433202；2 青島市即墨區(qū)健康教育所；3湖北省中南醫(yī)院 )

miRNA是由19～23個(gè)核苷酸組成的非編碼小分子RNA。已有研究證實(shí)，miRNA可通過調(diào)節(jié)藥物代謝酶活性誘導(dǎo)腫瘤化療耐藥[1]。miR-101是近年發(fā)現(xiàn)的一個(gè)腫瘤抑制miRNA，在多種惡性腫瘤中發(fā)揮類似抑癌基因作用[2]，但其是否參與胃癌化療耐藥尚不清楚。2015年8月～2017年8月，本研究觀察了miR-101對(duì)胃癌細(xì)胞化療耐藥的影響，并探討其調(diào)控機(jī)制?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料

胃癌細(xì)胞SGC-7901(以下稱SGC-7901細(xì)胞)、順鉑(DDP)耐藥胃癌細(xì)胞SGC-7901(以下稱SGC-7901/DDP細(xì)胞)，購自美國(guó)菌種保藏中心；人正常胃黏膜上皮細(xì)胞GES1(以下稱GES1細(xì)胞)，購自中國(guó)科學(xué)院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所。DDP，美國(guó)Sigma公司。miR-101 mimic(miR-101模擬物)及其陰性對(duì)照序列(mimic control)，廣州銳博生物科技有限公司。所有引物由生工生物工程(上海)股份有限公司設(shè)計(jì)合成。凝膠成像分析系統(tǒng)，鄭州博邦科貿(mào)有限公司；DYY-10C電泳儀，北京六一生物科技有限公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，美國(guó)ABI公司。MTT試劑，美國(guó)Sigma公司；Lipofectamine2000，美國(guó)Invitrogen公司；TRIzol試劑、miRNA cDNA Synthesis Kit、PrimeScript RT Reagent Kit，日本TaKaRa公司；細(xì)胞裂解液，江蘇碧云天生物技術(shù)研究所；P-糖蛋白(P-gp)抗體、c-met抗體，美國(guó)Cell Signaling Technology公司；β-actin抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠二抗，美國(guó)Santa Cruz公司；psiCHECK-2質(zhì)粒，南京金斯瑞生物科技有限公司；Dual Luciferase Assay Kit，美國(guó)Promega公司。

2 方法與結(jié)果

2.2 SGC-7901/DDP細(xì)胞相關(guān)指標(biāo)觀察 將SGC-7901細(xì)胞、SGC-7901/DDP細(xì)胞接種于含10% FBS、100 U/mL青霉素、100 mg/mL鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。為了維持SGC-7901/DDP細(xì)胞耐藥表型，SGC-7901/DDP細(xì)胞RPMI 1640培養(yǎng)基中加入0.5 μg/mL順鉑。將GES1細(xì)胞接種于含10% FBS、100 U/mL青霉素、100 mg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)時(shí)，用0.25%胰酶消化，按1∶3傳代。取傳3代、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2.1 miR-101表達(dá) 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法。取傳3代、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期GES1細(xì)胞、SGC-7901細(xì)胞、SGC-7901/DDP細(xì)胞，采用TRIzol法提取細(xì)胞總RNA，經(jīng)紫外分光光度計(jì)、瓊脂糖凝膠電泳鑒定，提取的總RNA符合實(shí)驗(yàn)要求。按miRNA cDNA Synthesis Kit逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物序列：miR-101上游引物5′-GGCTCTGAGTGGTTGAGC-3′、下游引物5′-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3′，內(nèi)參U6上游引物5′-GCTTGCGCACGAGATATAGTAAAAT-3′、下游引物5′-CCGTTGAGCAATTTGCCTGTGAT-3′。按PCR擴(kuò)增試劑盒說明配制反應(yīng)體系。PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 45 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 90 s，共30個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果顯示，GES1細(xì)胞、SGC-7901細(xì)胞、SGC-7901/DDP細(xì)胞miR-101 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為1.01±0.04、0.61±0.05、0.45±0.03，三種細(xì)胞miR-101 mRNA相對(duì)表達(dá)量?jī)蓛杀容^P均<0.05。

2.2.2 c-met 表達(dá) ①c-met mRNA表達(dá)：取傳3代、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期GES1細(xì)胞、SGC-7901細(xì)胞、SGC-7901/DDP細(xì)胞，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)其c-met mRNA相對(duì)表達(dá)量。引物序列：c-met上游引物5′-TGAACTGCATACTACGCTCAAGA-3′、下游引物5′-CGGATTCGTCACAATGTGTTC-3′，內(nèi)參β-actin上游引物5′-TGGCCCCAGCACAATGAA-3′、下游引物5′-CTAAGAGATAGTCCGCCTAGAAGCA-3′。具體步驟參照2.2.1。三種細(xì)胞c-met mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為1.04±0.07、1.57±0.15、2.76±0.24。三種細(xì)胞c-met mRNA相對(duì)表達(dá)量?jī)蓛杀容^P均<0.05。②c-met蛋白表達(dá)：采用Western blotting法。取傳3代、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期GES1細(xì)胞、SGC-7901細(xì)胞、SGC-7901/DDP細(xì)胞，采用RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白，BCA法蛋白定量合格。取部分細(xì)胞總蛋白，加入上樣緩沖液，100 ℃水浴5 min，使蛋白充分變性。取變性蛋白30 μg進(jìn)行10% SDS-PAGE(80 V恒壓30 min，120 V恒壓2 h)。電泳結(jié)束，采用濕轉(zhuǎn)法將蛋白電泳產(chǎn)物轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，轉(zhuǎn)膜條件：250 mA恒流70 min；5%脫脂牛奶封閉1.5 h，分別加入c-met一抗(1∶500)或β-actin一抗(1∶1 000)，4 ℃孵育過夜。次日加入辣根過氧化酶標(biāo)記的二抗(1∶1 000)，37 ℃孵育2 h，ECL發(fā)光，暗室中顯影、定影。采用凝膠圖像分析系統(tǒng)分析各蛋白電泳條帶灰度值。以β-actin為內(nèi)參，以目的蛋白電泳條帶灰度值與內(nèi)參蛋白電泳條帶灰度值的比值作為目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果顯示，GES1細(xì)胞、SGC-7901細(xì)胞、SGC-7901/DDP細(xì)胞c-met蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為1.07±0.02、1.78±0.13、2.88±0.21，三種細(xì)胞c-met蛋白相對(duì)表達(dá)量?jī)蓛杀容^P均<0.05。

2.2.3 MDR1 mRNA和P-gp蛋白表達(dá) ①M(fèi)DR1 mRNA表達(dá)：取傳3代、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期GES1細(xì)胞、SGC-7901細(xì)胞和SGC-7901/DDP細(xì)胞，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)MDR1 mRNA表達(dá)。引物序列：MDR1上游引物5′-TGAACTGCATACTACGCTCAAGA-3′，下游引物5′-CGGATTCGTCACAATGTGTTC-3′；β-actin上游引物5′-TGGCCCCAGCACAATGAA-3′，下游引物5′-CTAAGAGATAGTCCGCCTAGAAGCA-3′。其余步驟參照2.2.2。結(jié)果顯示，GES1細(xì)胞、SGC-7901細(xì)胞、SGC-7901/DDP細(xì)胞MDR1 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為1.02±0.04、2.91±0.21、3.21±0.22，三種細(xì)胞MDR1 mRNA相對(duì)表達(dá)量?jī)蓛杀容^P均<0.05。②P-gp蛋白表達(dá)：取傳3代、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期GES1細(xì)胞、SGC-7901細(xì)胞、SGC-7901/DDP細(xì)胞，采用Western blotting法檢測(cè)P-gp蛋白表達(dá)。一抗為P-gp一抗(1∶1 000)，二抗為辣根過氧化酶標(biāo)記的二抗(1∶1 000)，其余步驟參照2.2.2。結(jié)果顯示，GES1細(xì)胞、SGC-7901細(xì)胞、SGC-7901/DDP細(xì)胞P-gp蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為1.05±0.02、1.87±0.13、2.17±0.18，三種細(xì)胞P-gp蛋白相對(duì)表達(dá)量?jī)蓛杀容^P均<0.05。

2.3 過表達(dá)miR-101對(duì)胃癌耐藥細(xì)胞MDR1 mRNA和P-gp蛋白表達(dá)的影響

2.3.1 過表達(dá)miR-101的SGC-7901/DDP細(xì)胞模型建立 取傳3代、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期SGC-7901/DDP細(xì)胞，接種于6孔板(內(nèi)含RPMI 1640培養(yǎng)基)，每孔1×103個(gè)，隨機(jī)分為miR-101 mimic組和陰性對(duì)照組，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。常規(guī)培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁時(shí)，按Lipofectamine2000說明分別轉(zhuǎn)染miR-101 mimic和mimic control。轉(zhuǎn)染48 h，收集細(xì)胞，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)miR-101 mRNA相對(duì)表達(dá)量。具體步驟參照2.2.1。結(jié)果顯示，miR-101 mimic組miR-101 mRNA相對(duì)表達(dá)量為1.85±0.05，陰性對(duì)照組0.97±0.04，兩組比較P<0.05。表明轉(zhuǎn)染miR-101 mimic能使SGC-7901/DDP細(xì)胞miR-101過表達(dá)，即成功構(gòu)建了過表達(dá)miR-101的SGC-7901/DDP細(xì)胞模型。

2.3.2 過表達(dá)miR-101的SGC-7901/DDP細(xì)胞MDR1 mRNA和P-gp蛋白表達(dá)檢測(cè) 取2.3.1中兩組轉(zhuǎn)染48 h細(xì)胞，分別采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法、Western blotting法檢測(cè)MDR1 mRNA和P-gp蛋白表達(dá)。具體步驟參照2.2.3。結(jié)果顯示，miR-101 mimic組與陰性對(duì)照組MDR1 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為0.61±0.07、1.12±0.12，P-gp蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.31±0.02、0.94±0.03，兩組比較P均<0.05。

2.3.3 過表達(dá)miR-101的SGC-7901/DDP細(xì)胞熒光素酶載體構(gòu)建與活性檢測(cè) 利用TargetScan和miRanda在線分析軟件預(yù)測(cè)miR-101的靶向基因c-met，克隆擴(kuò)增部分c-met 3′-UTR片段：上游引物5′-CTGCAGGCCCACATCTGCCCATGACG-3′、下游引物5′-AGATATCTTTAAAATTGTCATCTGAT-3′。利用NotⅠ和XhoⅠ雙酶切產(chǎn)物，并與psiCHECK-2連接。采用Lipofectamine2000將miR-101 mimic和mimic control分別與熒光素酶報(bào)告載體共轉(zhuǎn)染SGC-7901/DDP細(xì)胞。轉(zhuǎn)染方法：將SGC-7901/DDP細(xì)胞接種于24孔板，待細(xì)胞融合80%時(shí)，將報(bào)告基因質(zhì)粒4 μg與轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)質(zhì)粒4 μg共轉(zhuǎn)染細(xì)胞；轉(zhuǎn)染8 h，按照Dual Luciferase Assay Kit說明進(jìn)行熒光素酶活性檢測(cè)。結(jié)果顯示，miR-101 mimic組熒光素酶活性為0.44±0.03，陰性對(duì)照組為1.03±0.08，兩組比較P<0.05。

3 討論

miRNA是一類內(nèi)源性非編碼小分子RNA，通過與目標(biāo)信使RNA形成RNA誘導(dǎo)的基因沉默復(fù)合物，調(diào)控相關(guān)基因表達(dá)，繼而參與多種生理和病理學(xué)過程。目前研究已證實(shí)，miRNA在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中具有重要作用。MacDonagh等[3]研究認(rèn)為，miRNA可通過調(diào)節(jié)藥物代謝酶在體內(nèi)的分布和活化程度，繼而參與化療耐藥。王中顯等[4]報(bào)道，miR-199a通過負(fù)調(diào)控mTOR表達(dá)，提高卵巢癌細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性。Wang等[5]研究發(fā)現(xiàn)，胃癌耐藥SGC-7901/DDP細(xì)胞、BGC-823/5-FU細(xì)胞miR-17-5p表達(dá)上調(diào)，其G1期細(xì)胞比例明顯減少，S期細(xì)胞比例明顯增多，導(dǎo)致細(xì)胞阻滯于G1/S期，誘導(dǎo)胃癌化療耐藥。蔡穎等[6]利用miRNA芯片篩選SGC-7901/ADR及SGC-7901細(xì)胞差異表達(dá)的miRNA，發(fā)現(xiàn)SGC-7901/ADR細(xì)胞中miR-103表達(dá)下調(diào)；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，miR-103可通過靶向負(fù)性調(diào)控Caveolin-1表達(dá)，增加SGC-7901/ADR細(xì)胞對(duì)多柔比星的敏感性，進(jìn)而逆轉(zhuǎn)胃癌耐藥。以上研究說明，miRNA可能與腫瘤放化療抵抗密切相關(guān)。

miR-101是近年發(fā)現(xiàn)的一個(gè)腫瘤抑制miRNA，在多種惡性腫瘤組織中表達(dá)下調(diào)，在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中具有類似抑癌基因作用[7]。Guo等[8]報(bào)道，通過轉(zhuǎn)染miR-101 mimic或沉默甲基化轉(zhuǎn)移酶3A，卵巢癌SKOV3細(xì)胞增殖率和穿膜細(xì)胞數(shù)明顯降低，提示miR-101可能通過負(fù)性調(diào)控甲基化轉(zhuǎn)移酶3A抑制SKOV3細(xì)胞增殖和侵襲。孫海兵等[9]研究發(fā)現(xiàn)，胃癌患者血清miR-101水平明顯降低，其術(shù)后血清miR-101水平明顯高于術(shù)前，提示血清miR-101有可能作為胃癌診斷的潛在生物學(xué)標(biāo)志物。宋雅琴等[10]報(bào)道，胃癌組織miR-101表達(dá)下調(diào)，且其表達(dá)下調(diào)與腫瘤TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，提示miR-101可能對(duì)胃癌診斷和預(yù)后評(píng)估有一定參考價(jià)值。近年研究還發(fā)現(xiàn)，miR-101低表達(dá)可能與多種惡性腫瘤的化療耐藥有關(guān)。Tian等[11]報(bào)道，替莫唑胺耐藥的膠質(zhì)瘤細(xì)胞miR-101表達(dá)下調(diào)，過表達(dá)miR-101可通過抑制糖原合成酶激酶3β逆轉(zhuǎn)替莫唑胺的耐藥性。Ye等[12]報(bào)道,miR-101可抑制上皮間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化和靶向調(diào)節(jié)ROCK2，繼而增強(qiáng)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性。在急性T淋巴細(xì)胞白血病中miR-101發(fā)揮抑癌作用，可通過靶向調(diào)控Notch1增強(qiáng)化療敏感性[13]。本研究結(jié)果顯示，與SGC-7901細(xì)胞比較，SGC-7901/DDP細(xì)胞miR-101 mRNA表達(dá)明顯降低，提示miR-101低表達(dá)可能與胃癌化療耐藥有關(guān)。

P-gp是一種跨膜糖蛋白，可通過與ATP結(jié)合將藥物從細(xì)胞內(nèi)泵出細(xì)胞外，起到“藥泵”作用[14]。有研究發(fā)現(xiàn)，P-gp高表達(dá)的胃癌患者化療后腫瘤復(fù)發(fā)率和耐藥率明顯升高[15]。MDR1屬于ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族成員之一，主要介導(dǎo)惡性腫瘤的化療耐藥[16]。本研究結(jié)果顯示，SGC-7901/DDP細(xì)胞MDR1 mRNA、P-gp蛋白表達(dá)明顯高于SGC-7901細(xì)胞，上調(diào)miR-101表達(dá)可明顯抑制MDR1 mRNA、P-gp蛋白表達(dá)，表明miR-101逆轉(zhuǎn)胃癌細(xì)胞化療耐藥可能與改變相關(guān)耐藥基因表達(dá)有關(guān)。

研究表明，在多種惡性腫瘤組織中c-met表達(dá)上調(diào)，如前列腺癌、卵巢癌、胃癌等[17～19]。已有研究證實(shí)，c-met高表達(dá)與腫瘤化療耐藥密切相關(guān)，如c-met/PI3K信號(hào)通路可介導(dǎo)乳腺癌阿霉素耐藥[20]；抑制c-met表達(dá)可通過阻斷PI3K/Akt通路，增強(qiáng)骨腫瘤對(duì)順鉑的敏感性[21]。Fujiwara等[22]研究發(fā)現(xiàn)，c-met通過調(diào)節(jié)下游PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路，參與多種腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為，如細(xì)胞增殖、侵襲和化療耐藥等。本研究結(jié)果顯示，miR-101可負(fù)性調(diào)控下游靶基因c-met，說明miR-101可能通過抑制c-met表達(dá)逆轉(zhuǎn)胃癌細(xì)胞的化療耐藥。

綜上所述，胃癌細(xì)胞miR-101低表達(dá)；miR-101可能通過抑制c-met表達(dá)逆轉(zhuǎn)胃癌細(xì)胞的化療耐藥。