張凡凡,苗 芳,王旭哲,唐開婷,馬春暉(石河子大學(xué)動物科技學(xué)院，新疆 石河子 832000)

響應(yīng)曲面優(yōu)化法(response surface methodology,RSM)是一種實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化的方法，適宜解決各類非線性數(shù)據(jù)處理的相關(guān)問題。其主要優(yōu)勢在于可對實(shí)驗(yàn)水平進(jìn)行連續(xù)的分析，而不是僅對孤立的實(shí)驗(yàn)點(diǎn)進(jìn)行，所以具有普通正交實(shí)驗(yàn)方法無法比擬的優(yōu)越性[1]。且此方法因研究的關(guān)系簡單(各因子間、因子與響應(yīng)值間)、省時(shí)準(zhǔn)確等，所以常被認(rèn)為是降低開發(fā)成本、優(yōu)化加工條件、解決生產(chǎn)過程中實(shí)際問題的一種最為有效的方法，已被廣泛地應(yīng)用于各個領(lǐng)域[2-3]。當(dāng)前，采用響應(yīng)曲面分析法主要是對發(fā)酵工藝參數(shù)和條件等進(jìn)行優(yōu)化，而少見利用此方法優(yōu)化青貯玉米外源添加菌種量和比例的相關(guān)研究。

青貯玉米原料附著多種微生物，其中有益微生物主要為同型或異性發(fā)酵乳酸菌，有害微生物多以真菌為主[4]。也有研究表明，某些真菌作為青貯添加劑添加，其不僅不會破壞原有的發(fā)酵過程，且可有效降低發(fā)酵底物的纖維素含量[5-7]。其中黑曲霉(Aspergillusniger)作為我國農(nóng)業(yè)部和美國FDA認(rèn)證的安全菌種，可產(chǎn)生活性較高的多種胞外酶，適合飼用復(fù)合酶的固體發(fā)酵[8]。綠色木霉(Trichodermaviride)作為自然界中普遍存在的真菌，其不但可以產(chǎn)生多種具有生物活性的酶系，且對植物病理生物防治具有重要的作用[9]。此外，某些細(xì)菌如枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)是α-淀粉酶和中性蛋白酶的重要生產(chǎn)菌[10]，具有抑制大腸桿菌、沙門氏菌生長，以及對植物病原真菌的溶菌等作用[11-12]。此外，上述菌種產(chǎn)生的酶系(糖化酶、纖維素酶、木聚糖酶等多種胞外酶)可將發(fā)酵底物中的多糖降解為寡糖和單糖，一方面可為菌體生長提供豐富的營養(yǎng)底物[5]，另一方面對于青貯原料，可顯著降低發(fā)酵體系內(nèi)銨態(tài)氮和總氮的比值、中/酸性洗滌纖維含量、丁酸與總酸的比值，并大幅抑制了青貯有害微生物的生長[13-15]。以往諸多研究均表明，酶系是否在青貯中發(fā)揮作用既要控制青貯發(fā)酵的環(huán)境[16]，也要充分考慮發(fā)酵菌種間的協(xié)同性。因此控制這些微生物的合理繁殖是調(diào)制優(yōu)質(zhì)青貯的重要前提之一。鑒于此，本研究擬采用響應(yīng)曲面法，探究外源添加劑同、異型發(fā)酵乳酸菌和纖維素分解菌菌群(黑曲霉、綠色木霉、枯草芽孢桿菌)復(fù)合發(fā)酵的理論最佳發(fā)酵比例和劑量，為青貯玉米發(fā)酵提質(zhì)降耗的理論研究提供基礎(chǔ)，并為我國新型青貯添加劑的開發(fā)提供依據(jù)。

1 試驗(yàn)材料與方法

1.1 主要材料

本研究主要菌種為購自中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心(Agricultural Culture Collection of China,ACCC)的植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum,ACCC 11016)、戊糖片球菌(Pediococcusacidilactici,ACCC 05481)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis,ACCC 19374)、黑曲霉(Aspergillusniger,ACCC 30134)和綠色木霉(Trichodermaviride,ACCC 30595)。購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心(China Center of Industrial Culture Collection,CICC)的布氏乳桿菌(Lactobacillusbuchneri,CICC 20293)。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

通過查閱關(guān)于添加同、異型發(fā)酵乳酸菌(LAB)發(fā)酵青貯玉米的相關(guān)文獻(xiàn)，初步確定兩類LAB的添加量[17]為1×105、3×105和5×105cfu·g-1(即5、5.48、5.70 lg cfu·g-1)，其中同型發(fā)酵乳酸菌為植物乳桿菌和戊糖片球菌等比例混合(菌種數(shù)量比為1∶1)的復(fù)合菌，異型發(fā)酵LAB為布氏乳桿菌。纖維素分解菌菌群的添加比例為，黑曲霉∶綠色木霉∶枯草芽孢桿菌分別為1∶1∶2、1∶2∶1和2∶1∶1，添加量分別為0.1、0.2和0.3%[5-6]。然后進(jìn)行響應(yīng)曲面分析，優(yōu)化各菌種比例和添加量。

1.3 指標(biāo)測定及方法

將各個菌種復(fù)壯后，接種至選擇性培養(yǎng)基中擴(kuò)繁，其中LAB采用MRS液體培養(yǎng)基[配方：酪蛋白胨10.0 g，牛肉粉8.0 g，酵母粉4.0 g，葡萄糖20.0 g，硫酸鎂0.2 g，乙酸鈉5.0 g，檸檬酸二銨2.0 g，磷酸氫二鉀2.0 g，硫酸錳0.05 g，吐溫80 1.0 g，蒸餾水1 L，pH (6.2±0.2)]，真菌Aspergillusniger、Trichodermaviride采用PDA液體培養(yǎng)基(配方：馬鈴薯提取液1 L，葡萄糖20.0 g，自然pH)，Bacillussubtilis采用LB培養(yǎng)基(配方：酵母提取物5.0 g，蛋白胨10.0 g，氯化鈉10.0 g，蒸餾水1 L，pH 7.0±0.2)。然后進(jìn)行響應(yīng)曲面優(yōu)化，設(shè)計(jì)方法為BBD(box-behnken design)，本研究中響應(yīng)值為LAB和真菌的數(shù)量，自變量分別為同型發(fā)酵LAB添加量、異型發(fā)酵LAB添加量、纖維素分解菌菌群比例和劑量，分別以A、B、C和D代表，每個自變量的3個試驗(yàn)水平(低、中、高)編碼分別為-1、0、1(表1)。然后將各個擴(kuò)繁后的菌液按照BBD設(shè)計(jì)的添加比例和量進(jìn)行混合，厭氧培養(yǎng)3 d后(35 ℃，pH 4.5)測定液體培養(yǎng)基中LAB和真菌的數(shù)量，具體采用傳統(tǒng)菌種計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)[18]，每個梯度做3個重復(fù)。取菌落數(shù)在30～300的平板作為有效計(jì)數(shù)板，菌落以肉眼可見為準(zhǔn)，每克鮮樣(FM)中微生物的數(shù)量，即菌落形成單位(cfu)，計(jì)算方法為：

微生物數(shù)量=菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)×1 000/涂布吸樣量。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)的初步整理和統(tǒng)計(jì)采用Microsoft Excel 2011軟件。采用Design Expert軟件進(jìn)行響應(yīng)曲面優(yōu)化，設(shè)通過最小二乘法擬合的二次多項(xiàng)式模型為：

式中:Y為預(yù)測響應(yīng)值，即LAB或真菌數(shù)量的預(yù)測值；xi和xj為自變量的編碼值，c0為常數(shù)項(xiàng)，ai為線性系數(shù)，bij為二次項(xiàng)系數(shù)，n為因子數(shù)(n=4)。按照BBD試驗(yàn)設(shè)計(jì)的統(tǒng)計(jì)學(xué)要求對二次多項(xiàng)式中各試驗(yàn)進(jìn)行回歸擬合，擬合后獲得回歸方程，運(yùn)用軟件中自帶功能，選取兩個預(yù)測值均為最大(Y1為LAB，Y2為真菌數(shù)量)，以此得到最佳的各水平編碼值，最終計(jì)算求得各個變量的最佳組合[1-2]。

2 結(jié)果與分析

2.1 模型建立與顯著性檢驗(yàn)分析

采用BBD設(shè)計(jì)得到變量代碼，按照變量代碼進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果測得LAB最大值為9.96 lg cfu·g-1，其代碼為1(A)、1(B)、0(C)、0(D)；最小值為7.93 lg cfu·g-1，其代碼為-1(A)、0(B)、-1(C)、0(D)，總體平均值為8.63 lg cfu·g-1，總體標(biāo)準(zhǔn)差(SD)為0.16，變異系數(shù)(CV)為1.89%。真菌測得最大值為5.23 lg cfu·g-1，其代碼為0(A)、1(B)、0(C)、1(D)；最小值為3.92 lg cfu·g-1，其代碼為1(A)、1(B)、0(C)、0(D)，總體平均值為4.49 lg cfu·g-1，總體SD為0.27，CV為6.05%(表2)。

表1 試驗(yàn)因素與編碼水平Table 1 The test factors and the coding level

纖維素分解菌依次為黑曲霉、綠色木霉和枯草芽孢桿菌。

Cellulose decomposing bacteria areAspergillusniger,TrichodermavirideandBacillussubtilis.

表2 Box-behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及乳酸菌和真菌的實(shí)際值Table 2 The actual value of lactic acid bacteria and fungi and box-behnken experiment design

利用Design Expert軟件，將表2的Y1和Y2數(shù)據(jù)按二次多項(xiàng)式模型進(jìn)行多元回歸擬合，獲得Y1和Y2對編碼自變量A、B、C和D的二次多項(xiàng)回歸方程(表3)：

Y1=8.56+0.50A+0.50B+0.07C+0.04D+0.09A2+0.11B2-0.01C2-2.58×10-3D2+0.21AB+0.06AC-0.04AD-0.04BC-0.06BD+0.08CD；

Y2=4.38-0.02A-0.05B-8.33×10-3C+0.32D-3.58×10-3A2-0.04B2-0.03C2+0.35D2-0.17AB+0.30AC-0.01AD-0.18BC+0.18BD-0.04CD。

表3 乳酸菌和真菌數(shù)量的回歸方程系數(shù)及其顯著性檢驗(yàn)Table 3 The regression equation coefficient and significance test of lactic acid bacteria and fungi number

2.2 復(fù)合發(fā)酵真菌和乳酸菌數(shù)量的響應(yīng)曲面分析

通過對Y1所繪制的響應(yīng)曲面圖及等高線圖可知(圖1)，A和B兩個因素的交互對Y1影響最大，當(dāng)A和B的代碼越接近于1，Y1的值越趨于最大值(9.96 lg cfu·g-1)。A和C、D因素的交互作用中，起主要作用的均為因素A。B和C、D因素的交互作用中，起主要作用的均為因素B。C和D兩個因素的交互對Y1的值基本無影響(P=0.36)?？傮w來看，僅A和B因素的交互作用影響顯著(P=0.02)，其余兩因素的交互作用對Y1的值影響均不大(P>0.05)(表3)。通過對Y2所繪制的響應(yīng)曲面圖及等高線圖可知(圖2)，對Y2的值起主要作用的為因素D，且因素D和其他因素的交互作用中因素D也也起到主要作用，但總體來看，除A、B因素交互作用外，其余各因素之間的交互作用對Y2的值影響均不大(P>0.05)(表3)。

圖1 4個因素兩兩交互作用影響乳酸菌數(shù)量的曲面圖及等高線圖Fig. 1 Surfaces charts and contour maps of lactic acid bacteria number on interaction with four factors

Y1表示乳酸菌數(shù)量，A為同型發(fā)酵乳酸菌添加量代碼，B為異型發(fā)酵乳酸菌添加量代碼，C為纖維素分解菌比例代碼，D為纖維素分解菌添加量代碼。下同。

Y1is the lactic acid bacteria number. A is the quantity of homofermentative lactic acid bacteria. B is the quantity of heterofermentative lactic acid bacteria. C is the quantity of cellulose decomposing bacteria proportion. D is the quantity of cellulose decomposing bacteria concentration; similarly for the following figures.

圖2 4個因素兩兩交互作用影響真菌數(shù)量的曲面圖及等高線圖Fig. 2 Surfaces charts and contour maps of fungi number on interaction with four factors

Y2表示真菌數(shù)量.

Y2is the fungi number.

最終利用軟件求出Y1和Y2均為最大值的代碼解(最優(yōu)解)為A=1.000，B=0.853，C=1.000，D=0.996，將代碼解換算成實(shí)際自變量可得，同型發(fā)酵LAB添加量為5×105cfu·g-1(5.70 lg cfu·g-1)，異型發(fā)酵LAB添加量為4.7×105cfu·g-1(5.67 lg cfu·g-1)，纖維素分解菌比例為2∶1∶1，添加量為0.3%。

3 討論

以往研究很少對多種類菌種的復(fù)合發(fā)酵進(jìn)行研究，類似研究多在發(fā)酵堆肥中使用[19-20]。本研究對LAB和纖維素分解菌復(fù)合發(fā)酵的發(fā)酵比例劑量進(jìn)行了優(yōu)化，而在實(shí)際發(fā)酵過程中，由于真菌和細(xì)菌的生長環(huán)境不同(好氧/厭氧)[21]，而在復(fù)合培養(yǎng)情況下僅能確定一種生長環(huán)境，因此本研究模擬青貯發(fā)酵初期的好養(yǎng)環(huán)境對復(fù)合菌種進(jìn)行了優(yōu)化，得到的結(jié)果能很好地為今后青貯復(fù)合發(fā)酵添加劑的開發(fā)提供理論方法。此外，由于多種菌劑的復(fù)合發(fā)酵體系比較復(fù)雜，本研究僅對其進(jìn)行了初步的探索，因此還需要繼續(xù)開展實(shí)踐研究。

本研究對復(fù)合菌種發(fā)酵體系內(nèi)的LAB數(shù)量進(jìn)行優(yōu)化，而未對傳統(tǒng)概念上認(rèn)識的pH、乳酸或乙酸含量等發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行優(yōu)化。其一方面原因?yàn)?，LAB的代謝產(chǎn)物較多，產(chǎn)生情況較為復(fù)雜，且受發(fā)酵環(huán)境和底物的影響極大，而無論其代謝產(chǎn)物種類如何，其必然受自身數(shù)量的影響[22]。另一方面，由于本研究中探究復(fù)合發(fā)酵體系，單純以某種LAB的代謝產(chǎn)物進(jìn)行優(yōu)化，并和真菌數(shù)量進(jìn)行響應(yīng)面分析，不能反映整體情況，且指標(biāo)上不具有統(tǒng)一性。另外，選取多個LAB的多種代謝產(chǎn)物進(jìn)行優(yōu)化，其操作性較差，不易進(jìn)行響應(yīng)曲面優(yōu)化。復(fù)合體系中將真菌數(shù)量作為另一個優(yōu)化指標(biāo)，其主要原因?yàn)楸狙芯窟x取的能產(chǎn)生胞外酶的微生物，其產(chǎn)酶含量與數(shù)量呈顯著正相關(guān)關(guān)系，以數(shù)量為響應(yīng)值即能很好的反映產(chǎn)酶的含量[5-6]。

眾所周知，LAB有抑制真菌生長的特性，而本研究需要真菌在青貯玉米發(fā)酵初期發(fā)揮其產(chǎn)胞外酶的特性，因此對好氧情況下真菌和LAB均達(dá)到最大值的發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化。研究發(fā)現(xiàn)，在確定的4個發(fā)酵條件中，同、異型發(fā)酵LAB的數(shù)量以及其交互作用對總體LAB數(shù)量影響最大(表3)，且當(dāng)兩類LAB數(shù)量最多時(shí)，總體LAB數(shù)量也最多，這與LAB生物學(xué)基礎(chǔ)理論相同[23]。在發(fā)酵體系內(nèi)加入的纖維素分解菌菌群的比例和劑量兩個因素對LAB數(shù)量無顯著影響(P>0.05)，也進(jìn)而證明了LAB數(shù)量并未受纖維素分解菌的抑制，這與諸多的研究結(jié)果相似，他們也都認(rèn)為在厭氧條件下真菌不會抑制LAB的生長[24-25]。另外，本研究為多種類菌種的復(fù)合發(fā)酵，因此選用的培養(yǎng)條件不可能達(dá)到所有菌種最適的生長環(huán)境，且實(shí)際生產(chǎn)中青貯玉米的發(fā)酵環(huán)境也難于控制，所以本研究僅模擬了青貯發(fā)酵初期(3 d內(nèi))的環(huán)境進(jìn)行研究[26]，這可能也是導(dǎo)致LAB生長不受真菌抑制的主要原因。本研究還發(fā)現(xiàn)，在確定的4個發(fā)酵條件中，影響真菌數(shù)量的主要因素為纖維素分解菌的添加劑量，且同、異型發(fā)酵LAB添加量的交互作用對真菌也有顯著影響(P<0.05)，而纖維素分解菌的添加比例對其無顯著影響(表3)(P>0.05)，由此也進(jìn)一步證實(shí)了LAB對真菌的抑制作用。另外，纖維素分解菌的比例和添加量的交互作用中以添加量為主導(dǎo)，其添加量越高，真菌數(shù)量越高(圖2)。這也說明了真菌添加劑量對其數(shù)量起到了決定性作用[27]。值得注意的是，當(dāng)纖維素分解菌的添加比例分別與同/異型發(fā)酵LAB添加量交互時(shí)，其產(chǎn)生了較大變異(圖2)，這可能是不同種LAB抑制真菌的種類不同所致[28]，其具體原因還有待進(jìn)一步分析研究。除此之外，當(dāng)纖維素分解菌的添加劑量分別與同/異質(zhì)型LAB添加量交互時(shí)，抑制真菌的效果異性發(fā)酵優(yōu)于同型發(fā)酵(圖2)，這表明異型發(fā)酵LAB產(chǎn)抑制真菌生長的乙酸含量高于同型發(fā)酵LAB[29-30]。

4 結(jié)論

1)LAB數(shù)量(Y1)和真菌數(shù)量(Y2)對編碼自變量A(同型發(fā)酵LAB添加量)、B(異型發(fā)酵LAB添加量)、C(纖維素分解菌比例)和D(纖維素分解菌添加劑量%)的二次多項(xiàng)回歸方程為：

Y1=8.56+0.50A+0.50B+0.07C+0.04D+0.09A2+0.11B2-0.01C2-2.58×10-3D2+0.21AB+0.06AC-0.04AD-0.04BC-0.06BD+0.08CD；

Y2=4.38-0.02A-0.05B-8.33×10-3C+0.32D-3.58×10-3A2-0.04B2-0.03C2+0.35D2-0.17AB+0.30AC-0.01AD-0.18BC+0.18BD-0.04CD。

2)響應(yīng)曲面分析法優(yōu)化試驗(yàn)條件結(jié)果為，同型發(fā)酵LAB添加量為5×105cfu·g-1，異型發(fā)酵LAB添加量為4.7×105cfu·g-1，纖維素分解菌比例黑曲霉∶綠色木霉菌∶枯草芽孢菌為2∶1∶1，添加量為0.3%。

References:

[1] 王萬中.試驗(yàn)的設(shè)計(jì)與分析.北京:高等教育出版社,2004.

Wang W Z.The Design of the Test and Analysis.Beijing:Higher Education Press,2004.(in Chinese)

[2] 方俊濤.響應(yīng)曲面方法中試驗(yàn)設(shè)計(jì)與模型估計(jì)的比較研究.天津:天津大學(xué)博士學(xué)位論文,2011.

Fang J T.Comparison for experimental designs and modeling in response surface methodology.PhD Thesis.Tianjin:Tianjin University,2011.(in Chinese)

[3] 許暉,孫蘭萍,張斌,石亞中.米曲霉固態(tài)發(fā)酵啤酒糟產(chǎn)α-淀粉酶的優(yōu)化.農(nóng)業(yè)機(jī)械學(xué)報(bào),2008,39(1):82-86.

Xu H,Sun L P,Zhang B,Shi Y Z.Optimization of producing α-amylase from spent brewing grains under solid-state fermentation byAspergillusoryzae.Transactions of the Chinese Society of Agricultural Machinery,2008,39(1):82-86.(in Chinese)

[4] 李曉暉.飼用微生物的種類和主要作用.飼料工業(yè),2002,23(2):30-32.

Li X H.Forage microbial species and the main role.Feed Industry,2002,23(2):30-32.(in Chinese)

[5] 任付平.復(fù)合微生物菌劑在全株玉米青貯中的應(yīng)用與研究.西安:西北大學(xué)碩士學(xué)位論文,2007.

Ren F P.Research and application of compound microbial additives on the whole-crop corn silage.Master Thesis.Xi’an:Northwest University,2007.(in Chinese)

[6] 周麗蓉,馮雷,崔澤周,馮琳之,馮采.降解秸稈的微生物復(fù)合菌劑及其降解秸稈的方法:CN 103194392A.2015.

Zhou L R,Feng L,Cui Z Z,Feng L Z,Feng C.The method of straw degradation with bacterial complex:CN 103194392A.2015.(in Chinese)

[7] 美合熱阿依·木臺力甫.乳酸菌與纖維素分解菌混合添加劑對青貯飼料品質(zhì)的影響研究.烏魯木齊:新疆大學(xué)碩士學(xué)位論文,2014.

Mihray·Mutallip.Effects on mixed additive ofLactobacillusand cellulose decomposition bacteria on the silage quality.Master Thesis.Urumqi:Xinjiang University,2014.(in Chinese)

[8] 劉宇,李陽,史同瑞,朱戰(zhàn)波.產(chǎn)纖維素酶黑曲霉菌的研究進(jìn)展.畜牧與獸醫(yī),2015,47(6):157-159.

Liu Y,Li Y,Shi T R,Zhu Z B.The advance of produce celluloseAspergillusnige.Animal Husbandry and Veterinary Medicine,2015,47(6):157-159.(in Chinese)

[9] 葛文中,李楠.綠色木霉應(yīng)用的研究進(jìn)展.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)學(xué)報(bào),2005,17(2):75-80.

Ge W Z,Li N.The advance of application ofTrichodermaviride.Heilongjiang August First Land Reclamation University,2005,17(2):75-80.(in Chinese)

[10] 和小黑,張文舉,魏曉燕.枯草芽孢桿菌產(chǎn)酶活性改良研究進(jìn)展.中國飼料,2014,515(15):8-10.

He X H,Zhang W J,Wei X Y.The techniques of increasing activity of the enzyme produced byBacillussubtilis.China Feed,2014,515(15):8-10.(in Chinese)

[11] 秦瑤,王葦,郭秉嬌,王熙楚,張文舉,周霞,王曉蘭.2株枯草芽孢桿菌對大腸桿菌和沙門氏菌的體外抑菌試驗(yàn)研究.中國畜牧獸醫(yī),2014,41(1):207-210.

Qin Y,Wang W,Guo B J,Wang X C,Zhang W J,Zhou X,Wang X L.Study onBacillussubtilisstrains Q4 and Q10 inhibiting the growth ofEscherichiacoliandSalmonellain vitro.Chinese Animal Husbandry and Veterinary Medicine,2014,41(1):207-210.(in Chinese)

[12] 林福呈,李德葆.枯草芽孢桿菌(Bacilllussubtilis)S9對植物病原真菌的溶菌作用.植物病理學(xué)報(bào),2003,33(2):174-177.

Lin F C,Li D B.Bacteriolysis ofBacillussubtilison plant fungal pathogens.Acta Phytopathologica Sinica,2003,33(2):174-177.(in Chinese)

[13] Sheperd A C,Maslanka M,Quinn D,Kung L J.Additives containing bacteria and enzymes for alfalfa silage.Journal of Dairy Science,1995,78(3):565-572.

[14] 萬里強(qiáng),李向林,何峰.添加乳酸菌和纖維素酶對苜蓿青貯品質(zhì)的影響.草業(yè)科學(xué),2011,28(7):1379-1383.

Wan L Q,Li X L,He F.The effect of adding lactic acid bacteria and cellulase on alfalfa silage quality.Pratacultural Science,2011,28(7):1379-1383.(in Chinese)

[15] 韓立英,玉柱,周禾.乳酸菌和纖維素酶對直穗鵝觀草青貯的改善效果.草業(yè)科學(xué),2013,30(9):1439-1444.

Han L Y,Yu Z,Zhou H.Effect of lactic acid bacteria inoculants and enzymes onRoegneriaturczaninoviisilages.Pratacultural Science,2013,30(9):1439-1444.(in Chinese)

[16] 張?jiān)?林芝,余豪闖,羅宗志,莊益芬.酶制劑和綠汁發(fā)酵液對巨菌草青貯品質(zhì)的影響.草業(yè)科學(xué),2017,34(8):1755-1761.

Zhang S,Lin Z,Yu H C,Luo Z Z,Zhuang Y F.Effect of enzyme and fermented green juice on silage quality ofPennisetumsp. Pratacultural Science,2017,34(8):1755-1761.(in Chinese)

[17] Cho S,Kang J S,Cho K J.Effect of homofermentative and heterofermentative lactic acid bacteria on the quality and aerobic stability of silage:Meta-analysis.Journal of the Korean Society of Grassland and Forage Science,2014,34(4):247-253.

[18] 陳天壽.微生物培養(yǎng)基的制造與應(yīng)用.北京:中國農(nóng)業(yè)出版社,1995.

Cheng T S.Manufacture and Application of Microbial Culture Medium.Beijing:China Agriculture Press,1995.(in Chinese)

[19] Hmouni A,Mouria A,Douira A.Biological control of tomato grey fungi with compost water extracts,Trichodermaspecies andGliocladiumspecies.Phytopathologia Mediterranea,2006,45(2):110-116.

[20] 宮玉勝,李玉成,吳旺寶,劉珊垚.嗜熱纖維素分解菌的篩選及混合發(fā)酵研究.江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué),2010,20(3):394-396.

Gong Y S,Li Y C,Wu W B,Liu S Y.Study on thermophilic cellulose decomposing bacteria screened and mixed fermentation.Jiangsu Agricultural Sciences,2010,20(3):394-396.(in Chinese)

[21] 夏新成.發(fā)酵棉籽粕菌種篩選和復(fù)合發(fā)酵工藝條件及其發(fā)酵活性產(chǎn)物研究.南京:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文,2009.

Xia X C.Study on the strains screening,optimal parameters of detoxification and active products of mixed culture solid fermentation on cotton seed meal.Master Thesis.Nanjing:Nanjing Agricultural University,2009.(in Chinese)

[22] 王旭哲.全株玉米青貯發(fā)酵及有氧穩(wěn)定期霉菌毒素動態(tài)變化研究.石河子:石河子大學(xué)碩士學(xué)位論文,2016.

Wang X Z.Study on the dynamic variation of mycotoxins during the fermentation and acobic stability of whole plant corn silage.Master Thesis.Shihezi:Shihezi University,2016.(in Chinese)

[23] 楊潔彬.乳酸菌:生物學(xué)基礎(chǔ)及應(yīng)用.北京:中國輕工業(yè)出版社,1996.

Yang J B.Lactic Acid Bacteria:Biological Basis and Application.Beijing:China Light Industry Press,1996.(in Chinese)

[24] Gourama H,Bullerman L B.Antimycotic and antiaflatoxigenic effect of lactic acid bacteria:A review.Journal of Food Protection,1995,58(11):1275-1280.

[25] 陳大歡,朱憶,蓋天欣,張柏林,韓俊華.乳酸菌對酸乳中霉菌的抑制作用研究.中國乳品工業(yè),2014,42(1):21-23.

Chen D H,Zhu Y,Gai T X,Zhang B L,Han J H.Inhibition effect of lactic acid bacteria to mold isolated from yogurt.China Dairy,2014,42(1):21-23.(in Chinese)

[26] 徐春城.現(xiàn)代青貯理論與技術(shù).北京:科學(xué)出版社,2013.

Xu C C.Silage Science and Technology.Beijing:Science Press,2013.(in Chinese)

[27] 付春麗.青貯飼料霉變規(guī)律及防霉劑篩選研究.鄭州:河南農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文,2012.

Fu C L.Study on regularity of mildew in the silage and the screening of mould inhibitor.Master Thesis.Zhengzhou:He’nan Agricultural University,2012.(in Chinese)

[28] Gerez C L,Torres M J,Valdez G F D,Rollán G.Control of spoilage fungi by lactic acid bacteria.Biological Control,2013,64(3):231-237.

[29] Filya I,Muck R E,Contreras-Govea F E.Inoculant effects on alfalfa silage:Fermentation products and nutritive value.Journal of Dairy Science,2007,90(11):5108-14.

[30] Lindseyj R,Limin K.Effects of combiningLactobacillusbuchneri40788 with various lactic acid bacteria on the fermentation and aerobic stability of corn silage.Animal Feed Science and Technology,2010,159(3-4):105-109.