雷湘蘭 孫倩 沈振國 唐滇

摘 要：本研究利用從紅樹林土壤中分離、篩選得到椰糠纖維素高效降解菌，通過菌株間拮抗研究和濾紙條降解研究，構建和篩選出具有高效降解椰糠纖維素能力的優(yōu)選復合菌系，通過對優(yōu)選復合菌系的產(chǎn)酶條件的研究，確認了其產(chǎn)酶的最佳條件。結果表明：優(yōu)選復合菌系Z-10 / B-05的纖維素降解能力優(yōu)于單一菌株，其產(chǎn)酶最佳條件是：培養(yǎng)溫度35℃，培養(yǎng)液初始pH值6.5，培養(yǎng)時間5d。在優(yōu)選產(chǎn)酶條件下，復合菌系Z-10 / B-05對椰糠、秸稈均有較好的降解效果，椰糠降解率達到36.1%。

關鍵詞：纖維素降解；復合菌系；產(chǎn)酶條件

中圖分類號：Q539+3 文獻標識碼：A DOI：10.11974/nyyjs.20180329003

纖維素是自然界中分布最廣、含量最多的一種多糖，也是一種可再生有機資源，但秸稈、椰糠等纖維素類物質較難被分解，常被焚燒或廢棄，既污染生態(tài)環(huán)境，又浪費資源。因此，提高對纖維素類物質的利用，篩選建立高效降解纖維素的菌株和菌系，具有重要意義[1-4]。

本研究利用從紅樹林中分離、篩選出的具有高效降解椰糠纖維素能力的菌株，構建了復合菌系Z-10 / B-05。通過對優(yōu)選復合菌系產(chǎn)酶條件及對不同類別纖維素發(fā)酵效果的初步研究，為纖維素的資源化利用提供菌種資源和開發(fā)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試劑：磷酸二氫鉀、硫酸鎂、硫酸銨、羧甲基纖維素鈉（carboxymethylcellulose-Na，CMC-Na）等（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司。

菌種：細菌B-05、B-09、B-13；霉菌Z-10、Z-14、Z-20，均為從紅樹林中分離、篩選出的具有高效降解纖維素能力的菌株，由海南職業(yè)技術學院熱帶農(nóng)業(yè)技術學院實驗室保藏。

培養(yǎng)基：羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基：CMC-Na 15.0g，磷酸二氫鉀1.5g，氯化鈉0.5g，硫酸鎂0.3g，蛋白胨10.0g，蒸餾水1000 mL，瓊脂18.0g，pH 6.8。

濾紙條培養(yǎng)基：硫酸銨1.0g，酵母粉0.1g，磷酸二氫鉀1.0g，硫酸鎂0.3g，磷酸氫二鉀2.0g，濾紙條（1cm×6cm），蒸餾水1000 mL。

發(fā)酵培養(yǎng)基：椰糠粉10.0g，酵母粉5.0g，氯化鈉5.0g，磷酸二氫鉀1.0g，硫酸鎂0.2g，蛋白胨5.0g，葡萄糖1.0g，蒸餾水1000 mL，pH 6.8。

椰糠液體培養(yǎng)基：椰糠粉5g，氯化鈉5.0g，硫酸鎂0.1g，磷酸二氫鉀1.0g，葡萄糖1.0g，硫酸銨2.0g，蒸餾水1000 mL，pH 6.5。

1.2 方法

1.2.1 拮抗實驗

按參照文獻[5]的實驗方法。

1.2.2 復合菌系構建方法

將菌株按細菌霉菌兩兩組合，分別接種到裝有100mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，110 r/min，35℃±1℃恒溫培養(yǎng)14d，觀察濾紙條降解情況。

1.2.3 產(chǎn)酶活性研究

纖維素酶活力（ CMC 酶活）測定參照文獻[6]實驗方法

1.2.4 復合菌系產(chǎn)酶條件研究

1.2.4.1 培養(yǎng)溫度的影響

將復合菌系接種到裝有100mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，分別置于25℃、30℃、35℃、40℃、45℃條件下，110 r/min，培養(yǎng)5d后，取樣測定其纖維素酶活力（ CMC 酶活）。

1.2.4.2 起始pH的影響

將復合菌系分別接種到起始pH為4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0的裝有00mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250mL三角瓶中。110 r/min，35℃±1℃，培養(yǎng)5d后，取樣測定其纖維素酶活力（ CMC 酶活）。

1.2.4.3 培養(yǎng)時間的影響

將復合菌系接種到裝有100mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，35℃±1℃，110 r/min，培養(yǎng)7d，每24h取樣測定其纖維素酶活力（ CMC 酶活）。

1.2.5 復合菌系發(fā)酵實驗

使用椰糠液體培養(yǎng)基時，分別用玉米秸稈、小麥秸稈、水稻秸稈替代椰糠，作為碳源。將優(yōu)選復合菌系接種到液體培養(yǎng)基，保持條件不變，在35℃±1℃、發(fā)酵6d，研究優(yōu)選復合菌系對其降解效果。

2 結果與分析

2.1 復合菌系的構建結果

2.1.1 菌株間拮抗研究

拮抗試驗結果顯示，兩兩組合的菌株未發(fā)現(xiàn)顯著拮抗作用。

2.1.2 維素降解復合菌系的構建

將細菌B-05、B-09、B-13與霉菌Z-10、Z-14、Z-20，分別混合發(fā)酵，構建纖維素降解菌系。由表1結果可知：霉菌Z-10和B-05在降解纖維素方面存在比較明顯的協(xié)同作用，菌株Z14、Z-20與B-09、B-13雖無明顯拮抗，但對濾紙的降解效果不理想。菌系Z-10 + B-05組合對濾紙的降解效果最優(yōu)，具有良好的應用潛力，作為優(yōu)選復合菌系。

2.2 復合菌系產(chǎn)酶條件研究

2.2.1 培養(yǎng)溫度的影響

圖1顯示，當溫度為35℃時，優(yōu)選復合菌系的酶活力大最大73.9 U/mL。超過40℃后，優(yōu)選復合菌系的產(chǎn)酶能力下降顯著。當溫度在35℃之前時，則優(yōu)選復合菌系的酶活隨溫度的升高而增大。

2.2.2 起始pH的影響

圖2顯示，pH6.5，優(yōu)選復合菌系產(chǎn)生的酶活最高，CMC為79.7 U/mL。優(yōu)選復合菌系在中性和弱酸性條件下均表現(xiàn)出較好的酶活性。在堿性條件下，其酶活呈明顯下降趨勢。

2.2.3 培養(yǎng)時間的影響

圖3顯示，發(fā)酵培養(yǎng)2～7d時，優(yōu)選復合菌系產(chǎn)酶處于較高水平。5d時，酶活達到最大值83.7U/mL。超過6d，酶活力逐漸下降。

2.3 纖維素降解菌復合菌系發(fā)酵實驗

優(yōu)選復合菌系對不同類別纖維素發(fā)酵6d時的降解率見表2。

表2顯示，優(yōu)選復合菌系對椰糠、秸稈類纖維素具有高效降解作用。其中，對椰糠的降解轉化率最高，降解率達到36.1% 。

3 結語

本研究構建的高效降解纖維素的最優(yōu)復合菌系Z-10 + B-05，其產(chǎn)酶最佳條件：培養(yǎng)溫度35℃，培養(yǎng)液初始pH值6.5，培養(yǎng)時間5d。在該優(yōu)化條件下，優(yōu)選復合菌系對椰糠、秸稈類纖維素，表現(xiàn)出較高的降解能力，具有的應用潛力，并為下一步研究提供了菌種資源和基礎資料。

優(yōu)選復合菌系產(chǎn)生的纖維素降解酶系及作用機制等尚完全明確，有待進一步研究和探討。

參考文獻

[1]何雋菁.纖維素酶的研究應用新進展[J].科技資訊，2006（32）：7.

[2]趙琪，李亞蘭，陳子欣，等.纖維素酶應用研究的最新進展[J].廣州化工，2014（6）：21-23.

[3]范力敏，季萍，陳曉湘，等.轉化纖維素資源生成酒精的研究 [J].環(huán)境科學學報，1990，10（3）：356-358.

作者簡介：雷湘蘭（1980-），女，講師，碩士，研究方向：食品微生物、食品加工；沈振國（1982-），男，講師，碩士，研究方向：應用生物技術。