，，，， ，*

(1.南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院泌尿外科，湖南 衡陽 421001；2.湘潭市湘潭縣人民醫(yī)院泌尿外科)

膀胱癌是一種嚴(yán)重威脅人類健康的泌尿生殖道惡性腫瘤，它的發(fā)病率在惡性腫瘤中位居第七位，全世界每年約有15萬患者死于該疾病。膀胱癌具有極強的侵襲能力，患者手術(shù)后極易復(fù)發(fā)，且生存率較低。據(jù)調(diào)查我國膀胱癌患者的數(shù)量逐年增加，故研發(fā)治療膀胱癌的藥物顯得尤為重要[1-3]。姜黃素(Curcumin)是從姜黃中提取出來的一種多酚類化合物，它具有調(diào)節(jié)炎癥、抗氧化和抗腫瘤等多種功能[4]。研究證實姜黃素具有抑制血管瘤、腎癌、前列腺癌和卵巢癌等多種惡性腫瘤的功能[4-7]，它也能誘導(dǎo)膀胱癌細(xì)胞凋亡[8]。但姜黃素抑制膀胱癌侵襲的機制尚未完全研究清楚。本研究采用不同濃度的姜黃素干預(yù)膀胱癌T24細(xì)胞，檢測其對膀胱癌T24細(xì)胞的生長和侵襲的影響，并初步探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1材料與試劑人膀胱癌T24細(xì)胞購自美國菌種保存中心(美國ATCC)，由南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院中心實驗室保存并傳代。姜黃素從美國Sigma公司購買，其純度大于99%。CCK-8細(xì)胞計數(shù)試劑盒購自日本同仁化學(xué)研究所；兔抗人金屬基質(zhì)蛋白酶2(matrix metalloproteinase 2，MMP2)和MMP9單抗購自奧博森生物技術(shù)有限公司；兔抗人蛋白激酶B(Protein Kinase B，AKT)、p-AKT、磷脂酰肌醇3-激酶(Phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)和p-PI3K抗體購自美國CST公司；小牛血清和培養(yǎng)基RPMI1640購自美國Gibco公司；DMSO、青霉素和鏈霉素等其他所用的生化試劑為分析純產(chǎn)品，購自上海生工生物公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)及處理使用含10%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)T24細(xì)胞，培養(yǎng)條件為：5% CO2、37 ℃。等T24細(xì)胞長滿培養(yǎng)瓶壁，使用0.25%胰酶進行消化并傳代；待細(xì)胞生長到對數(shù)生長期時開始進行干預(yù)實驗。使用DMSO溶解姜黃素20 mmol/L母液，并保存在-20℃，姜黃素作用終濃度參照文獻[9]，分別為0、10、20、30 和40 μmol/L，每組設(shè)3個平行。

1.3細(xì)胞增殖實驗收集培養(yǎng)好的細(xì)胞，并將其制成5×105個/mL的細(xì)胞懸液，并按照100 μL/孔接種到96孔板，37 ℃培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)24 h，然后加入終濃度為0、10、20、30 和40 μmol/L的姜黃素，每組3個平行，繼續(xù)按照上述條件培養(yǎng)72h。孵育結(jié)束后使用PBS洗滌細(xì)胞，加入新培養(yǎng)基，再在每孔加入10 μL CCK8檢測試劑，繼續(xù)培養(yǎng)1 h。使用酶標(biāo)儀檢測OD450值并按照試劑盒說明書計算細(xì)胞增殖率。

1.4細(xì)胞遷移實驗將200 μL(2.5×105個/mL)細(xì)胞懸液到加入包被了Matigel基質(zhì)膠的Transwell上室，下室加入600 μL含10%血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，將其放到培養(yǎng)箱中再培養(yǎng)24 h。取出小室，棄上室中的培養(yǎng)基，用4%多聚甲醛將濾膜固定10 min。丟棄甲醛，再用1%結(jié)晶紫進行染色3 min。擦掉未穿過Transwell小室膜的細(xì)胞，在顯微鏡高倍鏡下隨機挑選5個視野并進行計數(shù)，然后將處理組除以對照組得到抑制率。

1.5 Western Blot檢測收集對數(shù)生長期的T24細(xì)胞，并制成5×105個/mL的細(xì)胞懸液。并按照接種200 μL/孔接種到24孔板，然后分別加入終濃度為0、10、20、30 和40 μmol/L的姜黃素，將其放在37 ℃培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)24 h。5 000 rpm室溫下離心，并收集細(xì)胞。加入細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，10 000 rpm，4 ℃離心后取上清，定量后取50 μg總蛋白進行SDS-PAGE電泳。使用半干法將其轉(zhuǎn)移到PVDF膜，利用5%脫脂奶粉封閉，然后加入相應(yīng)的一抗(兔抗人MMP2、MMP9、AKT、p-AKT、PI3K和p-PI3K的抗體，同時以β-actin為內(nèi)參)，4 ℃孵育過夜。第二天用TBST將PVDF膜清洗3次，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗室溫孵育1 h。使用TBST緩沖液洗3次和TBS緩沖液洗一次，然后進行顯色并拍照。

1.6統(tǒng)計學(xué)分析使用統(tǒng)計軟件SPSS 19.0進行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差進行表示，使用單因素方差分析(ONEWAY ANOVA)比較組間的多個樣本，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1姜黃素能夠抑制T24細(xì)胞增殖分別以0、10、20、30 和40 μmol/L的姜黃素分別處理T24細(xì)胞0、24、48和72 h。實驗結(jié)果顯示與未處理組相比，姜黃素能夠明顯抑制T24細(xì)胞增殖。且隨著姜黃素濃度的遞增及處理的時間延長，T24細(xì)胞的增殖抑制率就越高，即姜黃素對T24細(xì)胞的增殖抑制具有濃度和時間依懶性(圖1)。

圖1 姜黃素處理能夠抑制T24細(xì)胞的增殖

2.2姜黃素能夠減弱T24細(xì)胞侵襲能力Transwell 侵襲實驗結(jié)果顯示使用姜黃素干預(yù)后，能夠透過上室Matrigel膠的T24細(xì)胞數(shù)量明顯要少于未處理組。終濃度為10 μmol/L的姜黃素就能有效抑制膀胱癌T24細(xì)胞的侵襲。相對于對照組細(xì)胞，處理24 h后，終濃度為10、20、30 和40 μmol/L姜黃素能夠抑制T24細(xì)胞侵襲能力。姜黃素干預(yù)后，能夠穿過Matrigel膠的細(xì)胞數(shù)量明顯小于未處理組(表1，圖2)，它們的抑制效率分別為27.4%、37.1%、58.1%和64.5%(圖3)。

表1 姜黃素抑制T24細(xì)胞的侵襲性能力

與0 μmol/L姜黃素濃度組比較，aP<0.05

圖2 姜黃素對T24細(xì)胞侵襲的影響

圖3 不同濃度的姜黃素能夠抑制T24細(xì)胞的侵襲力與對照組(0 μmol/L)相比，*P<0.05；**P<0.01

2.3姜黃素能夠下調(diào)T24細(xì)胞表達(dá)MMP2和MMP9蛋白分別使用0、10、20、30 和40 μmol/L的姜黃素干預(yù)膀胱癌T24細(xì)胞，然后使用蛋白質(zhì)印記法檢測MMP2和MMP9的表達(dá)含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，姜黃素干預(yù)后膀胱癌細(xì)胞MMP2和MMP9的表達(dá)量明顯降低，且呈濃度依懶性，姜黃素濃度越高，細(xì)胞表達(dá)MMP2和MMP9的濃度越低(圖4)。

圖4 姜黃素處理膀胱癌T24細(xì)胞能夠降低MMP2和MMP9的表達(dá)

2.4姜黃素對AKT、p-AKT、PI3K和p-PI3K表達(dá)的影響使用western blotting檢測AKT、p-AKT、PI3K和p-PI3K的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)與對照組相比，姜黃素干預(yù)24 h后能夠抑制膀胱癌細(xì)胞中p-AKT和p-PI3K的表達(dá)，但是對總AKT和PI3K的影響并不明顯(圖5)。

圖5 不同濃度的姜黃素對膀胱癌T24細(xì)胞AKT、p-AKT、PI3K和p-PI3K表達(dá)的影響

3 討 論

姜黃素是從姜黃中提取出來的一種具有多重生物學(xué)效應(yīng)的酚類物質(zhì)。研究發(fā)現(xiàn)它具有抗氧化、抗炎癥和抗腫瘤等多種功能[4]。姜黃素可以通過抑制腫瘤細(xì)胞增殖、降低腫瘤細(xì)胞侵襲力和誘導(dǎo)腫瘤凋亡等多種途徑抑制腫瘤的生長[4，10,11]。同時姜黃素具有毒性低，副作用小和抗腫瘤譜寬等特征，故作為抗腫瘤藥物具有非常廣泛的應(yīng)用前景。本實驗結(jié)果證明姜黃素能夠抑制膀胱癌T24細(xì)胞的增殖及侵襲力，這與仇煒和龍向陽等人的結(jié)果一致[10,11]。

姜黃素在抗腫瘤過程中的機制非常復(fù)雜，有研究表明姜黃素能夠通過抑制MiR-203的表達(dá)來下調(diào)AKT2和Src基因的表達(dá)而發(fā)揮抗腫瘤活性[12]。姜黃素還能下調(diào)Sp1、Sp3和Sp4等蛋白從而抑制膀胱瘤的生長，姜黃素能夠通過抑制PI3K/Akt信號通路，活化腫瘤細(xì)胞的凋亡信號，誘導(dǎo)膀胱癌EJ細(xì)胞凋亡[8]。PI3K/Akt途徑在腫瘤的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移過程中具有重要功能，磷酸化的PI3K(p-PI3K)和AKT(p-Akt)為它們的活化狀態(tài)[13]。本研究發(fā)現(xiàn)姜黃素干預(yù)后， PI3K和Akt的磷酸化水平降低，表明姜黃素能夠抑制膀胱瘤T24細(xì)胞中PI3K/Akt的活化。

抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲是治療惡性腫瘤的關(guān)鍵問題之一，膀胱癌的高侵襲性是患者術(shù)后容易復(fù)發(fā)的主要原因之一[1,2]。MMP具有降解細(xì)胞外基質(zhì)的功能，它們在腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移中起非常重要作用[14]。調(diào)查發(fā)現(xiàn)膀胱癌腫瘤患者中MMP2和MMP9的表達(dá)量要明顯高于正常組織，且與腫瘤的浸潤性密切相關(guān)。MMP2和MMP9表達(dá)量越高的患者，預(yù)后越差[15-17]。本研究通過western blotting檢測姜黃素處理T24細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)MMP2和MMP9的表達(dá)量下調(diào)，且呈濃度依賴性。這顯示姜黃素可能通過減少MMPs的表達(dá)，從而抑制膀胱癌細(xì)胞的侵襲。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)姜黃素可能通過下調(diào)P13K/AKT信號通路，降低MMP2和MMP9的表達(dá)，抑制膀胱癌T24細(xì)胞的增殖和侵襲，從而抑制膀胱癌的生長增殖，在未來的研究中，將通過動物實驗對其體內(nèi)抗腫瘤活性開展研究以進一步為臨床應(yīng)用提供實驗證據(jù)。

[1] SIDDIQUI MR,GRANT C,SANFORD T,et al.Current clinical trials in non-muscle invasive bladder cancer[J].UrolOncol,2017,35(8):516-27.

[2] VELAER KN,STEINBERG RL,THOMAS LJ,et al.Experience with sequential intravesical gemcitabine and docetaxel as salvage therapy for non-muscle invasive bladder cancer[J].CurrUrol Rep,2016,17(5):38.

[3] 蘇軍,張思維,陳萬青.中國膀胱癌死亡現(xiàn)狀及流行趨勢分析[J].現(xiàn)代泌尿科雜志,2013,18(3)：228-32.

[4] SHANMUGAM MK,RANE G,KANCHI MM,et al.The multifaceted role of curcumin in cancer prevention and treatment[J].Molecules,2015,20(2):2728-69.

[5] WANG X,DENG J,YUAN J,et al.Curcumin exerts its tumor suppressive function via inhibition of NEDD4 oncoprotein in glioma cancer cells[J].Int J Oncol,2017,51(2):467-77.

[6] DIAZ OSTERMAN CJ,GONDA A,STIFF T,et al.Curcumin induces pancreatic adenocarcinoma cell death via reduction of the inhibitors of apoptosis[J].Pancreas,2016,45(1):101-9.

[7] WAGHELA BN,SHARMA A,DHUMALE S,et al.Curcumin conjugated with PLGA potentiates sustainability,anti-proliferative activity and apoptosis in human colon carcinoma cells[J].PLoS One,2015,10(2):e0117526.

[8] TONG QS,ZHENG LD,LU P,et al.Apoptosis-inducing effects of curcumin derivatives in human bladder cancer cells[J].Anticancer Drugs,2006,17(3):279-87.

[9] 陳茜,陳麗娟,黨媛媛,等.姜黃素通過阻滯MAPK/ERK通路抑制人子宮內(nèi)膜癌HEC-1-B細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移[J].山西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報,2015,46 (8):762-8.

[10] 仇煒,沈永青,倪曉辰.姜黃素激活人膀胱癌 T24細(xì)胞自噬誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[J].河北醫(yī)藥，2015,2015(20):3054-7.

[11] 龍向陽,許武軍,謝皇,等.姜黃素抑制膀胱癌T24細(xì)胞增殖及Hsp90α的表達(dá)[J].中南醫(yī)學(xué)科學(xué)雜志,2016,44(3):283-5.

[12] SAINI S,ARORA S,MAJID S,et al.Curcumin modulates microRNA-203-mediated regulation of the Src-Akt axis in bladder cancer[J].Cancer Prev Res (Phila),2011,4(10):1698-709.

[13] TIAN B,ZHAO Y,LIANG T,et al.Curcumin inhibits urothelial tumor development by suppressing IGF2 and IGF2-mediated PI3K/AKT/mTOR signaling pathway[J].J Drug Target,2017,25(7):626-36.

[14] WIECZOREK E,JABLONOWSKI Z,TOMASIK B,et al.MMP,VEGF and TIMP as prognostic factors in recurring bladder cancer[J].ClinBiochem,2015,48(18):1235-40.

[15] 彭東濤,茍欣,何梓銘.膀胱癌組織中MMP9、MMP2與PCNA及臨床指標(biāo)的研究[J].重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報,2003,28(4):467-9.

[16] 徐海波,熊異平,余恒勇.膀胱癌組織中MMP-2、MMP-9、Survivin、Livin和VEGF表達(dá)的臨床意義分析[J].標(biāo)記免疫分析與臨床,2017,24(1)：51-4.

[17] 孟勇,柴勁.MMP-2、MMP-9含量表達(dá)與膀胱癌分期及病理分級的相關(guān)性[J].中國老年學(xué),2013,33(22)：5563-4.