前 言

本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1—2009給出的規(guī)則起草。

本標(biāo)準(zhǔn)由中華供銷合作總社提出。

本標(biāo)準(zhǔn)由全國蜂產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)化工作組（S A C/S WG2）歸口。

本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：浙江大學(xué)、中國蜂產(chǎn)品協(xié)會、農(nóng)業(yè)部蜂產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測試中心（北京）、江山福賜德蜂業(yè)科技開發(fā)有限公司、廈門思健生物科技有限公司、上海滬郊蜂業(yè)聯(lián)合社有限公司。

本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：胡福良、張翠平、鄭火青、呂澤田、李熠、徐水榮、顏鑒翔、孫德官。

引 言

本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)提請注意，聲明符合本文件時(shí)，可能涉及到第4～9章與以水楊苷和鄰苯二酚為指標(biāo)鑒別楊樹膠的原理及檢測方法相關(guān)的專利（Z L201010180675.0和Z L201310721079.2）的使用。

本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)對于該專利的真實(shí)性、有效性和范圍無任何立場。

該專利持有人已向本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)保證，他愿意同任何申請人在合理且無歧視的條款和條件下，就專利授權(quán)許可進(jìn)行談判。該專利持有人的聲明已在本文的發(fā)布機(jī)構(gòu)備案。相關(guān)信息可以通過以下聯(lián)系方式獲得：

專利持有人：浙江大學(xué)。

地址：浙江省杭州市西湖區(qū)余杭塘路866號。

請注意除上述專利外，本文件的某些內(nèi)容仍可能涉及專利，本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識別這些專利的責(zé)任。

蜂膠中楊樹膠的檢測方法反相高效液相色譜法

1 范圍

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了蜂膠中是否含有楊樹膠的反相高效液相色譜鑒別方法的原理、試劑、材料、儀器、設(shè)備和試驗(yàn)方法。

本標(biāo)準(zhǔn)適用于蜂膠及蜂膠乙醇提取物中楊樹膠的檢測。

2 規(guī)范性引用文件

下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。

GB/T6682 分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法

3 術(shù)語和定義

下列術(shù)語和定義適用于本標(biāo)準(zhǔn)。

3.1 蜂膠 propolis

工蜂采集樹脂等植物分泌物與其上顎腺、蠟腺分泌物等混合形成的膠粘性物質(zhì)。

3.2 蜂膠乙醇提取物 ethanol extracted propolis

乙醇萃取蜂膠后得到的物質(zhì)。

3.3 楊樹膠 extracted populus buds, leaves or barks

楊屬（Populus）植物的芽、葉子或樹皮等組織經(jīng)人工熬制加工，再經(jīng)乙醇提取而成的提取物。

3.4 楊樹型蜂膠 poplar type propolis

楊屬（Populus）為主要植物來源的蜂膠。

4 原理

水楊苷和鄰苯二酚廣泛存在于楊屬和柳屬植物的芽、葉子和樹皮中。當(dāng)這些芽、葉子和樹皮經(jīng)過煎煮之后，水楊苷和鄰苯二酚依然存在。而蜂膠中并不存在水楊苷和鄰苯二酚。因此可以作為蜂膠中是否摻有楊樹膠的鑒別指標(biāo)。

試樣經(jīng)75%乙醇提取后，用配有紫外檢測器的高效液相色譜儀在213 n m處檢測水楊苷和鄰苯二酚的含量，從而判斷蜂膠中是否含有楊樹膠。

5 試劑和材料

實(shí)驗(yàn)室用水應(yīng)符合GB/T6682規(guī)定的一級水。除非另有規(guī)定，所有試劑均為分析純。

5.1 甲醇：色譜純。

5.2 乙腈：色譜純。

5.3 乙醇。

5.4 磷酸。

5.5 水楊苷標(biāo)準(zhǔn)品：純度≥98%。

5.6 鄰苯二酚標(biāo)準(zhǔn)品：純度≥99%。

5.7 0.5%磷酸（5.4）溶液：量取5 m L 磷酸，用水定容至1 L。

5.8 標(biāo)準(zhǔn)貯備液：準(zhǔn)確稱取水楊苷（5.5）和鄰苯二酚標(biāo)準(zhǔn)品（5.6）各10 m g，分別用甲醇溶液（5.1）配制成1.0 m g/m L的標(biāo)準(zhǔn)溶液，于4℃冰箱保存，保持期3個(gè)月。

5.9 標(biāo)準(zhǔn)工作液：分別吸取適量的水楊苷和鄰苯二酚標(biāo)準(zhǔn)貯備液（5.8），用甲醇溶液（5.1）分別稀釋成水楊苷濃度為0.005 m g/m L、0.01 m g/m L、0.02 m g/ m L、0.04 m g/m L和0.06 m g/m L五個(gè)濃度，鄰苯二酚濃度為0.005 m g/m L、0.01 m g/m L、0.02 m g/m L、0.04 m g/m L和0.06 m g/m L五個(gè)濃度，現(xiàn)用現(xiàn)配。

5.10 濾膜：0.45 μm，有機(jī)系。

6 儀器和設(shè)備

6.1 高效液相色譜儀：配有紫外檢測器。

6.2 粉碎機(jī)。

6.3 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀。

6.4 超聲波清洗器。

7 樣品的取樣及預(yù)處理

從被檢樣品的不同部位均勻取樣50 g，冷凍，粉碎，混勻，作為備檢樣品。

8 試驗(yàn)方法

8.1 供試樣品溶液的制備

稱取2 g蜂膠試樣，用75%乙醇超聲波提取30 m i n，料液比為1︰15 (質(zhì)量∶體積)，反復(fù)提取3次，合并濾液，離心過濾后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，或者稱取1 g蜂膠乙醇提取物試樣，然后用75%乙醇超聲溶解定容至50 m L，取上清液，0.45 μm濾膜過濾，供液相色譜測定。

8.2 色譜條件

色譜柱：S e p a x H P-C18，柱長150 mm，內(nèi)徑4.6 mm，粒度5 μm；或性能相當(dāng)?shù)纳V柱。

流動相流速：1 m L/m i n。

梯度洗脫，洗脫程序參見附錄A 表A.1。

檢測波長：213 n m。

柱溫：30℃。

進(jìn)樣量：5 μL。

8.3 測定

取5 μL樣品溶液（8.1）、水楊苷和鄰苯二酚標(biāo)準(zhǔn)工作液（5.9）分別進(jìn)樣分析。

水楊苷標(biāo)準(zhǔn)品、鄰苯二酚標(biāo)準(zhǔn)品、楊樹型蜂膠、楊樹膠的色譜圖分別參見附錄B圖B.1，B.2，B.3和B.4。

8.4 結(jié)果計(jì)算

試樣中水楊苷或鄰苯二酚含量（X）以毫克每克（m g/g）表示，按式（1）計(jì)算：

式中：

CS—水楊苷或鄰苯二酚標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度，單位為毫克每毫升（m g/m L）；

V—試樣最終定容體積，單位為毫升（m L）；

AS—水楊苷或鄰苯二酚標(biāo)準(zhǔn)溶液對應(yīng)的峰高或峰面積；

A—試樣溶液對應(yīng)的峰高或峰面積；

m—樣品質(zhì)量，單位為克（g）。

將符合重復(fù)性要求的兩個(gè)獨(dú)立測定值的算術(shù)平均值作為測定結(jié)果（m g/g），保留兩位有效數(shù)字。平行試驗(yàn)相對偏差不得超過2.0%。

8.5 結(jié)果判定

本方法所檢測的水楊苷和鄰苯二酚為楊樹膠中含有而蜂膠中不含有的物質(zhì)。如果待測樣品中檢測不到水楊苷，且鄰苯二酚檢測濃度在蜂膠乙醇提取物中低于0.21 m g/g，或在蜂膠原料樣品中低于0.12 m g/g，則該樣品為未檢出楊樹膠的樣品；如果待測樣品中檢測不到水楊苷，但蜂膠乙醇提取物樣品中鄰苯二酚檢測濃度大于0.21 m g/g，或待測原料蜂膠樣品中鄰苯二酚檢測濃度大于0.12 m g/g，則該樣品判定為含有楊樹膠的樣品；如果待測樣品中檢測到水楊苷，則該樣品判定為含有楊樹膠的樣品。

9 檢測限

本標(biāo)準(zhǔn)在進(jìn)樣量為5 μL 時(shí)，蜂膠乙醇提取物中水楊苷的最低檢測限為0.065 m g/g，鄰苯二酚的最低檢測限為0.063 m g/g；蜂膠原料中水楊苷的最低檢測限為0.032 m g/g，鄰苯二酚的最低檢測限為0.031 m g/g。

附錄A（資料性附錄）

高效液相色譜梯度洗脫程序

高效液相色譜梯度洗脫程序見表A.1。

表A.1 高效液相色譜法梯度洗脫程序

附錄B（資料性附錄）

水楊苷標(biāo)準(zhǔn)品、鄰苯二酚標(biāo)準(zhǔn)品、楊樹型蜂膠、楊樹膠的色譜圖

水楊苷（標(biāo)準(zhǔn)品）色譜圖見B.1：

B.1 水楊苷（標(biāo)準(zhǔn)品）色譜圖

鄰苯二酚（標(biāo)準(zhǔn)品）色譜圖見B.2：

B.2 鄰苯二酚（標(biāo)準(zhǔn)品）色譜圖

楊樹型蜂膠色譜圖見B.3：

B.3 楊樹型蜂膠色譜圖

楊樹膠色譜圖見B.4：

B.4 楊樹膠色譜圖