蔡少康,李穎波,楊豐,樊永智,董軍立,吳群,蔡毅

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電針對2型糖尿病模型大鼠下丘腦IRS-1的影響

蔡少康1,李穎波1,楊豐2,樊永智1,董軍立1,吳群1,蔡毅1

(1.武漢市中心醫(yī)院,武漢 430000;2.湖北省云夢縣人民醫(yī)院,孝感 432000)

觀察電針對2型糖尿病(T2DM)模型大鼠下丘腦中胰島素受體底物蛋白質(zhì)-1(IRS-1)的影響。將60只Wistar大鼠隨機分為正常組15只和觀察組45只。觀察組采用高能飼料誘導造模,8星期造模成功后將觀察組隨機分為造模組、治療組和阻滯組,每組15只。治療組給予電針治療;阻滯組給予電針配合腦室灌注磷脂酰肌醇-3羥基激酶(PI3K)阻滯劑治療。治療8星期后,采用血糖儀檢測各組大鼠空腹血糖(FPG),采用ELISA法檢測空腹血清胰島素(Fins),計算胰島素抵抗指數(shù)(IAI),并采用免疫組化SABC法檢測大鼠IRS-1含量的表達。與正常組比較,造模組的FPG、Fins顯著上升(均＜0.01),IAI、IRS-1表達顯著降低(＜0.01)。與造模組比較,治療組的FPG、Fins顯著下降(均＜0.01),IAI、IRS-1表達顯著上升(＜0.01)。與阻滯組比較,治療組的FPG、Fins均顯著下降(＜0.05,＜0.01),IAI、IRS-1表達顯著上升(＜0.01)。電針可通過調(diào)節(jié)下丘腦IRS-1的表達,改善T2DM大鼠的FPG、Fins及胰島素敏感性。

針刺療法;糖尿病,2型;胰島素受體底物蛋白;血糖;血清胰島素;胰島素抵抗指數(shù);大鼠;下丘腦

據(jù)統(tǒng)計,2010年我國糖尿病患者約9千萬[1],而現(xiàn)在保守估計,患者數(shù)量應已逾1億5千萬之多。糖尿病給社會和家庭帶來較大的經(jīng)濟負擔和身心壓力,糖尿病及其并發(fā)癥的診斷、治療、后期的維持費用更是逐年遞增,病程超過10年的糖尿病患者與病程在5年之內(nèi)的患者相比,醫(yī)療費用增加了近3倍[2]。因此,尋找一種有效安全而又經(jīng)濟實用的治療方法迫在眉睫。

2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus, T2DM)又稱為非胰島素依賴型糖尿病,是指患者本身具備一定胰島分泌功能,而胰島素作用效果反而降低,造成的葡萄糖利用吸收障礙、血清葡萄糖升高的一種現(xiàn)象[3],其基本病理基礎就是存在胰島素抵抗(insulin resistance, IR)。分子生物學認為IR的病理機制之一就在于磷酸酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(PI3K/PKB,又名PI3K/Akt)通路的信號異常[4],而胰島素受體底物1(insulin receptor substrate-1, IRS-1)正是此通路的重要啟動因素[5-6]。胰島素首先與細胞膜表面胰島素受體(insulin receptor, InsR)的a亞基結合,之后可激活b亞基的酪氨酸蛋白激酶(protein tyrosine kinase, PTK),使InsR構象發(fā)生改變,然后InsR磷酸化IRS-1的酪氨酸殘基,激活底物蛋白,從而激活PI3K/Akt通路,進而推動一系列因子活動[7-8]。

近年來,針灸在T2DM的治療方面進行了大量的實驗研究[9],本研究旨在探討電針對T2DM模型大鼠之下丘腦胰島素信號分子IRS-1的影響,為針灸防治T2DM相關疾病和針灸技術推廣應用提供理論支持和實驗依據(jù),現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法[10]

1.1 實驗動物

60只SPF級雄性8周齡Wistar大鼠,平均體重為(200±20)g,由湖北省動物疫病預防控制中心提供[動物許可證號SCXK(鄂)2013-167]。

1.2 主要試劑及儀器

ELISA試劑盒(武漢谷歌生物工程有限公司,美國Sigma公司);山羊血清封閉液、免疫組化SABC相關試劑盒(北京中杉金橋公司);蘇木精、3%過氧化氫去離子水、10%水合氯醛、4%多聚甲醛、二甲苯、0.5%Txiton X-100(北京博奧森公司)。

ZS-B/S顱腦立體定位儀(國營西北光學儀器廠);ST-360酶標儀設備(上海科華生物工程有限公司);CT2-BI-2000醫(yī)學顯微圖像分析系統(tǒng)(成都泰盟);37XB倒置生物顯微鏡(上海長方光學儀器有限公司);IX71 OLYMPUS研究級電動倒置顯微鏡(上海長方光學儀器有限公司);TGL-20M臺式高速冷凍離心機(長沙平凡儀器廠);HW-2250輪轉式石蠟切片機(德國Leitz公司);YD-A生物組織攤片機(金華市益迪醫(yī)療設備廠)。

1.3 實驗方法

1.3.1 造模及分組

將60只Wistar大鼠適應性喂養(yǎng)1周,然后隨機分為正常組15只和觀察組45只。觀察組采用高能飼料(購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司)誘導造模,飼料成分為38.5%碳水化合物,15.0%蛋白質(zhì),46.5%脂肪,總熱能為5.4 kcal/g[11]。8周后大鼠尾靜脈采血檢測空腹血糖(fasting plasma glucose, FPG)及空腹血清胰島素(fasting insulin, Fins),據(jù)參考文獻[12]計算胰島素抵抗指數(shù)(insulin activation indices, IAI),即IAI=ln(1/FBG×Fins),凡IAI與正常組比較顯著降低者(＜0.05)為造模成功。然后將觀察組隨機分為造模組、治療組和阻滯組,每組15只。

①正常組,標準飲食,不予造模及電針治療;②造模組,高能飲食,不予電針治療;③治療組,造模后給予電針治療;④阻滯組,造模后給予電針治療,同時給予腦室內(nèi)灌注PI-3K阻滯劑Wortmannnin。

1.3.2 電針治療

取足三里、三陰交、關元、中脘穴。穴位定位參照華興邦等[13]制定的《實驗動物穴位圖譜》。常規(guī)消毒后,采用0.30 mm×25 mm毫針直刺2～4 mm,然后接G6805-2A型電針治療儀(同側足三里和三陰交1對電極,關元和中脘1對電極),采用連續(xù)波,頻率為1 Hz。留針10 min。每周治療5次,共治療8周。

1.3.3 腦室灌注

大鼠先用10%水合氯醛(30 mg/kg)腹腔麻醉后固定于腦立體定位儀,頭頂備皮消毒后,皮膚切開1.5 cm以暴露囟門,于中位顱蓋骨前囟后0.8 mm處鉆孔2 mm,將不銹鋼導管(長18.0 mm,外徑0.64 mm,內(nèi)徑0.39 mm)插入鉆孔并留置,再將帶帽不銹鋼制導絲(長17.0 mm,直徑0.33 mm)插入導管并封閉,用牙科粘合劑固定上述裝置。然后縫合皮膚,用碘酒消毒并肌肉注射青霉素;隔日取出管芯并用人工腦脊液清洗。

灌注方法具體操作為,先抽出管芯,將微量注射器、聚氯乙烯導管(內(nèi)徑0.3 mm)及不銹鋼導管依次相連,再行Wortmannin注射[14-15](規(guī)格為50 nmol/L,劑量為3 mg/kg,藥速為1mL/min)。注射完后留針8～10 min,再緩慢退針以防藥物返流。

1.4 觀察指標

1.4.1 FPG

實驗第8周和第16周各組大鼠尾靜脈取血,用強生穩(wěn)步血糖儀及試紙測試。

1.4.2 Fins

實驗第8周和第16周各組大鼠尾靜脈采血,按ELISA試劑盒步驟操作,采用酶標儀的方法檢測,使用不同梯度的標準品計算出不同樣本的值。

1.4.3 IRS-1[16-17]

大鼠下丘腦灌注取材,固定,脫水透明,石蠟包埋并切片,貼片烤片,脫蠟水化;采用免疫組化SABC法,0.3% Txiton X-100處理20 min后PBS沖洗,3%甲醇-H2O2室溫孵育10 min后PBS沖洗,微波輻射、檸檬酸鹽緩沖液45 min、蒸餾水洗5 min×3次后PBS沖洗,滴加10%正常山羊血清、濕盒內(nèi)37℃孵育約30 min,滴加一抗、二抗,滴加SABC適量后PBS沖洗,滴加DAB顯色,蘇木精復染,梯度乙醇脫水,封片拍照。每組切片隨機挑選4個進行200倍拍照。應用Image-Pro Plus6.0軟件分析照片的累積光密度值(IOD值),IOD值越大表示陽性表達越強,每組所有照片的平均IOD值代表該組的IOD值。

1.5 統(tǒng)計學方法

采用SPSS19.0軟件進行統(tǒng)計分析。符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差表示,采用單因素方差分析,方差齊性時用檢驗進行兩兩比較,方差不齊時用秩和檢驗,組間比較用-檢驗。

2 結果

2.1 各組大鼠實驗第16周FPG、FINS及IAI比較

實驗第16周,與正常組比較,造模組FPG、Fins顯著上升(均＜0.01),IAI顯著降低(＜0.01);與造模組比較,治療組FPG、Fins顯著下降(均＜0.01),且IAI顯著升高(＜0.01);阻滯組FPG、Fins、IAI與造模組比較,差異均無統(tǒng)計學意義(＞0.05);與阻滯組比較,治療組FPG、Fins均顯著下降(＜0.05,＜0.01),且IAI顯著上升(＜0.01)。詳見表1。

表1 各組大鼠實驗第16周FPG、FINS及IAI比較(±s)

注:與正常組比較1)＜0.01;與造模組比較2)＜0.01;與阻滯組比較3)＜0.01,4)＜0.05

2.2 各鼠大鼠下丘腦IRS-1免疫組化切片結果比較

由圖1可見,免疫組化圖片染色為棕黃色胞漿染色,如箭頭所指即為陽性細胞,其中正常組陽性表達最高,造模組和阻滯組皆表達較少,治療組表達居中。

注:A為標準組,B為造模組,C為治療組,D為阻滯組

2.3 各組大鼠實驗第16周IRS-1平均光密度值(IOD)表達比較

表2 各組大鼠實驗第16周IRS-1平均光密度值(IOD)表達比較 (±s)

注:與正常組比較1)＜0.01;與造模組比較2)＜0.01;與阻滯組比較3)＜0.01

實驗第16周,與標準組比較,造模組的IRS-1顯著下降(＜0.01);與造模組比較,治療組和阻滯組的IRS-1均顯著上升(＜0.01);與阻滯組比較,治療組的IRS-1顯著上升(＜0.01)。

3 討論

中醫(yī)學很早已對T2DM的發(fā)病原因及臨床特點作出論述[18-19],正如《素問·奇病論》:“此肥美之所發(fā)也,此人必數(shù)食甘美而多肥也,肥者令人內(nèi)熱,甘者令人中滿,故其氣上溢,轉為消渴?！逼洳∫虿C主要在于陰津虧損,燥熱偏盛,且以陰虛為本,燥熱為標;其病變臟腑主要在肺、脾、腎。本病治療宜標本兼顧,補先后天精氣之本、瀉臟腑肥甘之濁[20]。

《素問遺篇·刺法論》:“正氣存內(nèi),邪不可干。”足三里為胃經(jīng)合穴,胃腑之下合穴,針之可調(diào)理脾胃,補益氣血生化之源,固護后天之本;關元為任脈腧穴,也是足三陰經(jīng)與任脈交會穴,為元陰、元陽關藏出入之所,針之可益精補氣,扶助人體先天之本[21]。金代醫(yī)學家張子和認為:“邪去則正安。”中脘和三陰交兩穴通腑清臟、以除濁本,其中中脘為胃之募穴、八會穴之腑會,處任脈之上,針之可健脾利水、和胃降逆;三陰交為足太陰脾經(jīng)腧穴、足三陰交會穴,針之可滋陰清熱、益氣祛濕[22]。諸穴合用,共奏攻補兼施、標本同治之功。

有研究[23]表明,T2DM的發(fā)生與胰島素分泌不足和胰島素抵抗密切相關,而IRS-1是葡萄糖代謝PI3K/Akt通路的重要環(huán)節(jié)[24],IRS-1基因敲除小鼠的PI3K活性明顯降低,下游物質(zhì)含量逐級遞減,最終誘導T2DM。Kido Y等[25]發(fā)現(xiàn)T2DM患者,特別是明顯IR傾向者,外周靶組織如骨骼肌、肝臟、脂肪中可發(fā)現(xiàn)IRS-1表達降低,而IRS-3、IRS-4等表達升高,說明IRS-1的減低與T2DM的發(fā)生呈正相關,刺激恢復IRS-1的表達對治療T2DM有積極意義。相關研究[26-27]表明,下丘腦是中樞調(diào)控機體胰島素敏感性的重要部位,電針可以有效調(diào)節(jié)IR大鼠下丘腦神經(jīng)肽Y和Leptin受體(肥胖基因編碼產(chǎn)物)的表達,從而改善IR狀態(tài)。同時有研究[28]表明,藥物和電針方法可提高IRS-1蛋白的表達,從而達到一定的糖尿病治療效果,并且電針較之于傳統(tǒng)降糖藥療效更佳,且無不良反應,這也為糖尿病的治療提供了新的思路。

本實驗結果顯示,電針可顯著增加T2DM大鼠中樞IRS-1水平,緩解IR以阻遏糖尿病的進程。筆者推測該電針法可能促進了PI3K/PKB通路的修復進程,讓處于IRS-1下游的分子數(shù)量增加,以重新強化級聯(lián)效應,從而達到治療糖尿病的目的。阻滯組的對照即是最好的說明,當經(jīng)歷PI3K阻滯劑的大鼠,即使應用了合理治療也無法改善IR狀況,因為通路已被不可逆地阻斷。

至于該針刺法如何介入PI3K/PKB通路,可以影響該通路中哪些信號分子,對諸如此類的分子進行怎樣的調(diào)節(jié),還有待于進一步的研究。另外,每個疾病的惡化和治療均有多條信號通路的參與,那么電針能否激發(fā)其他通路代償性開放以及有效促進類似于IRS-1的多個因子在數(shù)量及活性上得到有效恢復,也有待于進一步的探索和研究。

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Effect of Electroacupuncture on Hypothalamic IRS-1 in a Rat Model of T2DM

-1,-1,2,-1,-1,1,1.

1.,430000,; 2.’,432000,

To investigate the effect of electroacupuncture on hypothalamic insulin receptor substrate 1 (IRS-1) in a rat model of type 2 diabetes mellitus (T2DM).Sixty Wistar rats were randomized to a normal group (15 rats) and an observation group (45 rats). In the observation group, a rat model of T2DM was made by high-energy diet induction. After the model was successfully made 8 weeks later, the observation group was randomized to model making, treatment and blocker groups, 15 rats each. The treatment group received electroacupuncture and the blocker group, electroacupuncture plus intraventricular perfusion of phosphatidylinositol 3-hydroxyl kinase (PI3K) blocker. After 8 weeks of treatment, fasting plasma glucose (FPG) was measured using a glucometer, fasting insulin (Fins) was determined by ELISA, insulin resistance index (IRI) was calculated and IRS-1 expression was examined by SABC immunohistochemistry assay in every group of rats.FPG and Fins increased significantly (both＜0.01) and IRI and IRS-1 expression decreased significantly (＜0.01) in the model making group compared with the normal group. FPG and Fins decreased significantly (both＜0.01) and IRI and IRS-1 expression increased significantly (＜0.01) in the treatment group compared with the model making group. FPG and Fins decreased significantly (＜0.05,＜0.01) and IRI and IRS-1 expression increased significantly (＜0.01) in the treatment group compared with the blocker group.Electroacupuncture can improve FPG, Fins and insulin sensitivity by regulating hypothalamic IRS-1 expression in T2DM rats.

Acupuncture therapy; Diabetes mellitus, Type 2; Insulin receptor substrate proteins; Plasma glucose; Insulin; Insulin resistance index; Rats; Hypothalamus

1005-0957(2018)03-0330-05

R2-03

A

10.13460/j.issn.1005-0957.2018.03.0330

2017-11-12

湖北省武漢市重點項目(WX17B02)

蔡少康(1985—),男,住院醫(yī)師

蔡毅(1980—),男,副主任醫(yī)師,Email:517221634@qq.com