劉鑫宇，賀彥宇，彭創(chuàng)，彭沙勇，劉蘇來，楊平洲

（湖南師范大學第一附屬醫(yī)院/湖南省人民醫(yī)院 肝膽外科，湖南 長沙 410005）

肝內(nèi)膽管細胞癌（intrahepatic cholangiocarcinoma，ICC）是一種來源于二級以上分支肝內(nèi)膽管上皮細胞的肝臟原發(fā)性惡性腫瘤,發(fā)病率逐年增高，中位生存時間為18個月[1-3]。雖然ICC病因尚不明確，但伴隨著實驗技術(shù)的發(fā)展，研究[4-6]發(fā)現(xiàn)黏蛋白3（MUC3）、黏蛋白4（MUC4）等可評價腫瘤患者的預后。本研究通過應用免疫組織化學的方法檢測38例結(jié)石相關(guān)膽管細胞癌中MUC3、MUC4的表達，目的在于探討以結(jié)石為誘因而產(chǎn)生的ICC在進展過程中，患者生存預后與MUC3及MUC4之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 標本與試劑

收集湖南省人民醫(yī)院2006年6月—2016年6月間來源于肝臟外傷及肝血管瘤行手術(shù)切除的正常膽管組織24例，因清除結(jié)石而行肝部分切除的膽管組織44例，行肝部分切除、最終病理確診為結(jié)石相關(guān)ICC的38例存檔蠟塊，全部患者入選前均未經(jīng)放化療及中醫(yī)中藥等治療，均行根治性切除手術(shù)，研究中術(shù)后隨訪死亡病例均為本疾病所致，排除非本疾病死亡病例。鼠抗人MUC3多克隆抗體，工作濃度為1:200，鼠抗人MUC4多克隆抗體，工作濃度為1:200，SP免疫組織化學檢測試劑盒（SP-0024，6.0ML），上述試劑均從北京博奧森公司購買。

1.2 方法

組織切片，染色（步驟：按SP免疫組化產(chǎn)品所介紹方式進行），烤片，去蠟，脫水，內(nèi)源性過氧化物酶滅活30 min，修復抗原；一抗4 ℃冰箱過夜；二抗經(jīng)30 min孵育，上述相關(guān)步驟進行后均以蒸餾水及MPBS分別沖洗3 min×3次。DAB顯色，復染，沖洗，脫水，透明，封片，顯微鏡下觀察及拍照。陽性對照以預試驗證實為陽性的組織切片，陰性對照以PBS代替一抗。

1.3 結(jié)果判斷

MUC3及MUC4染色在膽管上皮細胞胞漿中出現(xiàn)黃色或棕黃色遂判定結(jié)果為陽性。以半定量方法對實驗結(jié)果進行判斷：染色強度逐漸遞減為3分（棕褐色）、2分（棕黃色）、1分（淺黃色）、0分（無色）；以染色細胞所占的百分比定義染色范圍進行評分，按總細胞中陽性細胞所占比例分5組：＞75%為4分，≤75%為3分，≤50%為2分，＜25%為1分，無表達細胞為0分。陽性細胞所占比例得分與染色強度得分乘積為免疫組化結(jié)果，≥1分為陽性，0分為陰性。

1.4 隨訪

主要以住院病歷，門診電話等方式獲得患者預后資料，隨訪時間截止日期為2016年11月，自行手術(shù)切除后第1天為起始計算生存時間，隨訪終止點為對患者進行最后1次隨訪的時間或患者死亡時間，統(tǒng)計其手術(shù)后生存時間及相關(guān)情況。

1.5 統(tǒng)計學處理

計數(shù)資料應用χ2檢驗及確切概率法檢測，應用SPSS 17.0統(tǒng)計數(shù)據(jù)包軟件行數(shù)據(jù)處理，制作生存曲線及生存率的計算應用Kaplan-Meier法，生存時間差異應用Log-rank檢驗進行比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 結(jié)石相關(guān)ICC患者隨訪結(jié)果

38例肝內(nèi)膽管細胞癌患者術(shù)后門診及電話隨訪至2016年11月，隨訪結(jié)束點為患者最后1次隨訪時間或死亡時間，最終隨訪成功35例，92.1%的隨訪率，隨訪中位時間為33（16～62）個月。至隨訪截止日，有11例患者存活。

2.2 組織形態(tài)學及免疫組化檢測

正常膽管組織、因清除結(jié)石而行肝部分切除的膽管組織、結(jié)石相關(guān)ICC組織中MUC3表達陽性率各為79.2%、56.8%、36.8%，在3種組織中MUC3表達陽性率差異有統(tǒng)計學意義（P=0.005）；正常膽管組織、因清除結(jié)石而行肝部分切除的膽管組織、結(jié)石相關(guān)ICC中MUC4表達陽性率各為29.2%、79.5%、86.8%，在3種組織中MUC4表達陽性率差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）（圖1）（表1）。

圖1 組織形態(tài)學及免疫組化檢測 A-C：HE染色（×100）；D-F：MUC3免疫組化檢測（×400）；G-I：MUC4免疫組化檢測（×400）Figure 1 Histomorphological and immunohistochemical determination A–C: HE staining (×100); D–F: Immunohistochemical staining for MUC3 (×400); G–I: Immunohistochemical staining for MUC4

表1 MUC3和MUC4在不同組織中的表達[n（%）]Table 1 MUC3 and MUC4 expressions in different types of tissues [n (%)]

2.3 MUC3和MUC4的表達與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系

ICC患者年齡、性別、腫瘤大小與MUC3及MUC4的表達均無明顯關(guān)系（均P＞0.05），而腫瘤組織學分級、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均與MUC3及MUC4表達有關(guān)（P＜0.05）；此外，有無門靜脈浸潤與MUC3表達無關(guān)（P＞0.05），而與MUC4的表達有關(guān)（P＜0.05）（表2）。

2.4 MUC3和MUC4的表達與ICC患者生存時間的關(guān)系

38例結(jié)石相關(guān)ICC患者中，MUC3的陽性和陰性表達者分別為14和24例，MCU4的陽性和陰性表達者分別為33和5例。MUC3陽性及陰性組術(shù)后中位總生存期各為28、19個月，1、3、5年生存率各為92.9%、42.8%、14.3%和79.2%、33.3%、4.2%，MUC3陽性表達組術(shù)后生存率較陰性組高（P=0.026）；MUC4陽性及陰性組術(shù)后中位生存期各為21、44個月，1、3、5年生存率各為81.8%、30.3%、0.06%和100.0%、80.0%、40.0%，MUC4陽性表達組術(shù)后生存率較陰性表達組低（P=0.04）（圖2）。

表2 MUC3和MUC4表達與結(jié)石相關(guān)ICC臨床病理參數(shù)的關(guān)系[n（%）]Table 2 Relations of MUC3 and MUC4 expressions with clinical variables of hepatolithiasis-associated ICC[n (%)]

圖2 結(jié)石相關(guān)ICC患者的生存曲線 A：不同MUC3表達患者比較；B：不同MUC4表達患者比較Figure 2 Postoperative survival curves of patients with hepatolithiasis-associated ICC A: Comparison between patients with different MUC3 expressions; B: Comparison between patients with different MUC4 expressions

3 討 論

MUC3是黏多糖組成的糖蛋白家族中的一員，是人體部分凝膠狀分泌物的關(guān)鍵組成部分，主要生理作用包括提供潤滑、保護黏膜及作為細胞信號通路等[7-8]。在關(guān)于人類乳腺癌[9]等研究中，多次揭示MUC3的膜性表達是一個潛在的預后不良特征。但同樣有研究[10]顯示，MUC3是健康組織細胞中的成分，在正常的膽管組織、不伴肝硬化的肝細胞癌、膽管癌及胰腺導管腺癌組織中也可表達[11-12]。據(jù)相關(guān)報道[13]，在肝內(nèi)膽管及膽囊細胞中，控制MUC3表達基因的生物學機制非常復雜，并且在結(jié)石相關(guān)ICC中的相關(guān)機制尚不清楚。

本研究中，MUC3多在正常膽管組織細胞中表達，在結(jié)石引起炎癥的膽管細胞中MUC3表達降低，在結(jié)石相關(guān)ICC組織細胞中MUC3表達明顯降低，提示腫瘤的發(fā)生與MUC3含量相關(guān)。MUC3具有保護細胞防止被破壞的作用，而炎癥抑制了MUC3的表達，其表達降低使細胞防御功能受損導致炎癥損傷更重，最終在結(jié)石引起的惡變中起到作用。同時，患者年齡、性別、腫瘤大小、門靜脈有無浸潤與MUC3表達無關(guān)，而腫瘤組織學分級、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與MUC3表達有關(guān)，術(shù)后總生存中位時間在MUC3表達陽性組是28個月，同時1、3、5年生存率在MUC3陽性表達組各為92.9%、42.8%、14.3%，生存率比MUC3表達陰性組更高（P=0.026），提示更高的MUC3表達與更好的預后相伴隨。

MUC4與MUC3相似，也是黏多糖組成的糖蛋白家族中的一員，但與MUC3的區(qū)別是，MUC4通常在某些正常組織，如呼吸道、胃、小腸、結(jié)腸和乳腺中發(fā)現(xiàn)[14-16]。它作為受體酪氨酸激酶ErbB2的一種新型的膜內(nèi)配體被證實[17]。通過形成與受體結(jié)合的MUC4復合物及MUC4的跨膜亞基對ErbB2的特異性結(jié)合，從而誘導ErbB2的酪氨酸磷酸化[18-19]。此外，MUC4的過度表達可以促進腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移，因為其可引起組織紊亂及降低腫瘤細胞與其他細胞和細胞外基質(zhì)的黏附[20-21]。另據(jù)報道[22-23]，在腫瘤細胞上的MUC4會將表面位點掩蓋在細胞毒性免疫細胞上，從而幫助腫瘤細胞從免疫攻擊中逃脫。綜上所述的特點和機制解釋了當MUC4陽性或高表達時，患者總生存期更短的原因。

本研究中，相較于正常膽管組織及因清除結(jié)石切除的膽管組織，MUC4更多于結(jié)石相關(guān)ICC的膽管組織中表達，提示MUC4作為促進因素存在于膽管細胞的癌變過程中，而細胞在結(jié)石引起的炎癥中，MUC4也表達出高陽性率，提示慢性炎癥也可使MUC4表達增強，從而導致惡變的產(chǎn)生。同時，患者年齡、性別、腫瘤大小與MUC4表達程度無關(guān)，而腫瘤組織學分級、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及門靜脈有無浸潤與MUC4表達有關(guān)，術(shù)后總生存中位時間在MUC4表達陽性組是21個月，同時1、3、5年生存率在MUC4陽性表達組各為81.8%、30.3%、0.06%，生存率比MUC4表達陰性組更低（P=0.04），提示更高的MUC4的表達與結(jié)石相關(guān)ICC患者更低的生存率相伴隨。

總結(jié)，結(jié)石相關(guān)ICC的發(fā)展往往是多因素的結(jié)果[24-25]，其中MUC3的更低表達及MUC4的更高表達與結(jié)石相關(guān)ICC的進展、侵襲及轉(zhuǎn)移緊密相關(guān)；檢測結(jié)石相關(guān)ICC組織中MUC3和MUC4的表達程度，可判斷結(jié)石相關(guān)ICC患者預后及作為選擇臨床治療手段的相關(guān)指標。

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