鄭兵兵，付曉偉，陳海敏，杜鵬程，張軍，胡雙輝，熊美雪，方路

（1. 南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院 肝膽胰外科，江西 南昌 330006；2. 江西省共青城市人民醫(yī)院 普通外科，江西 共青城 332020）

膽管癌（CCA）是來(lái)自膽管上皮的惡性腫瘤。膽管癌的發(fā)生率在過(guò)去10年都有增高的趨勢(shì)，但是在個(gè)別地區(qū)膽管癌的發(fā)生率在過(guò)去10年卻翻了一番。其預(yù)后差，5年無(wú)瘤生存率僅為12.8%，中位生存時(shí)間僅1.5年[1-2]。膽管癌占消化系統(tǒng)惡性腫瘤的3%，是第二最常見(jiàn)的主要肝膽腫瘤[3]。膽管癌患者初始癥狀取決于腫瘤位置。肝內(nèi)膽管癌通常表現(xiàn)為非特異性疾病的晚期階段[4]。通常，膽管癌患者中僅在少數(shù)患者（15%～30%）中實(shí)現(xiàn)細(xì)胞學(xué)診斷[5-6]。一般來(lái)說(shuō)，膽管癌患者病死率高，因?yàn)樵谠\斷時(shí)已經(jīng)到了晚期[7]。不同系統(tǒng)癌癥預(yù)后影響因素包括TNM分期、手術(shù)切緣狀態(tài)等被用來(lái)作為膽管癌患者手術(shù)后的預(yù)后指標(biāo)[8-12]。但膽管癌的發(fā)生與發(fā)展的機(jī)制尚未完全探明[13-15]。尋找膽管癌新的、有效的早期診斷生物學(xué)指標(biāo)和預(yù)測(cè)膽管癌發(fā)生轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)以及預(yù)后的分子標(biāo)志物顯得十分必要。

靶向Xklp2靶蛋白（targeting protein for xenopus kinesin-like protein 2，TPX2）是一種嚴(yán)格受細(xì)胞周期調(diào)控的微管相關(guān)蛋白，在有絲分裂紡錘體形成過(guò)程中發(fā)揮重要作用[16]。研究發(fā)現(xiàn)TPX2在肝癌、胃癌、胰腺癌、肺癌、宮頸癌、膀胱癌、食管鱗狀細(xì)胞癌中都存在過(guò)表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞基因的的損傷、中心體異常擴(kuò)增及細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡，阻滯細(xì)胞周期于G2/M期，并與腫瘤分化、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)相關(guān)[17-23]。但有關(guān)TPX2在膽管癌癌組織中的表達(dá)水平及膽管癌中的表達(dá)水平與臨床預(yù)后的關(guān)系未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。因此，本研究應(yīng)用免疫組化技術(shù)和Western blot技術(shù)檢測(cè)膽管癌患者癌組織和癌旁組織中的TPX2蛋白的表達(dá)情況，收集因膽管癌手術(shù)的患者的臨床病理資料，探尋其在膽管癌的發(fā)生與發(fā)展過(guò)程中的可能作用。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源

收集2010年1月—2012年1月期間在南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院肝膽外科行膽管癌切除術(shù)且術(shù)后均經(jīng)病理科2位病理科醫(yī)師證實(shí)為膽管癌的60例患者的癌組織和非癌組織（膽管或肝臟）標(biāo)本。在距腫瘤邊緣1 cm以?xún)?nèi)且無(wú)壞死的腫瘤組織取膽管癌組織，在距腫瘤邊緣至少3 cm的組織取非癌組織，經(jīng)病理證實(shí)無(wú)腫瘤細(xì)胞。所有患者術(shù)前均未經(jīng)過(guò)放、化療。癌細(xì)胞分化為高、中、低，膽管癌的臨床分期根據(jù)美國(guó)癌癥聯(lián)合委員會(huì)（AJCC）的TNM分期為I～I(xiàn)V期。

1.2 主要試劑及儀器

小鼠抗人TPX2單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)BioLegend公司（B159993），一抗稀釋液購(gòu)自武漢市博士的生物工程有限公司，通用型二步檢測(cè)法試劑盒（PV-6000）、二氡基聯(lián)苯胺（DAB）顯色劑均購(gòu)自北京中杉生物技術(shù)有限公司。

1.3 免疫組化檢測(cè)

膽管癌癌組織和癌旁組織經(jīng)10%中性甲醛固定24 h，石蠟包埋后，切成約3 μm切片。石蠟切片經(jīng)60 ℃烤片1.5 h，脫蠟，水化，高壓抗原修復(fù)10 min，3%過(guò)氧化氫阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶30 min，孵育一抗（1:200）4 ℃過(guò)夜，次日二抗孵育1 h，DAB)顯色，蘇木精復(fù)染后封片。

1.4 免疫組化結(jié)果判定

由2位病理科醫(yī)師獨(dú)立閱片；TPX2蛋白的表達(dá)部位為細(xì)胞核，陽(yáng)性細(xì)胞核被染色為淺棕色至深褐色，其染色強(qiáng)度評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)以陽(yáng)性細(xì)胞核占全部細(xì)胞核的百分率界定，具體為：無(wú)核染色為（-）；核染色≤10%為（+）；11%～30%為（++）；31%～50%為（+++）；＞50%為（++++）；（++）以上被判定為陽(yáng)性表達(dá)。

1.5 Western blot檢測(cè)

取收集的標(biāo)本出來(lái)清洗好，放入勻漿器中于冰上加入含蛋白酶體抑制劑的RIPA蛋白裂解液，裂解，于4 ℃ 10 000r/min離心15 min，取上清液。加入抽提試劑，在4 ℃冰箱靜置，加入2×上樣緩沖液，95 ℃ 5 min煮沸變性。10%聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉2 h。一抗4 ℃孵育過(guò)夜，使用對(duì)應(yīng)屬性的二抗孵育1 h，ECL發(fā)光試劑盒顯影，暗室中X光片曝光成像。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 17.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，病理相關(guān)性分析采用Pearson檢驗(yàn)，以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

圖1 免疫組化檢測(cè)TPX2蛋白（×400） A：膽管癌組織TPX2蛋白陽(yáng)性表達(dá)；B：癌旁組織TPX2蛋白陰性表達(dá)Figure 1 Immunohistochemical staining for TPX2 protein (×400) A: Positive expression of TPX2 protein in cholangiocarcinoma tissue;B: Negative expression of TPX2 protein in adjacent tissue

2 結(jié) 果

2.1 膽管癌癌組織與癌旁組織TPX2蛋白表達(dá)水平的檢測(cè)

運(yùn)用免疫組化檢測(cè)60例膽管癌癌組織與癌旁組織TPX2蛋白表達(dá)水平，結(jié)果顯示，在膽管癌癌旁組織中TPX2蛋白陽(yáng)性表達(dá)率為8.3%（5/60），在膽管癌癌組織中TPX2蛋白陽(yáng)性表達(dá)率為46.7%（28/60），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖1）。同時(shí)隨機(jī)選取4對(duì)膽管癌患者的標(biāo)本的癌組織和癌旁組織提取組織蛋白，通過(guò)Western blot檢測(cè)膽管癌癌組織與癌旁組織TPX2蛋白表達(dá)水平，結(jié)果顯示TPX2蛋白在癌組織中表達(dá)水平高于癌旁組織（圖2）。

圖2 Western blot檢測(cè)TPX2的蛋白表達(dá)量Figure 2 Western blot analysis for TPX2 protein expression level

2.2 TPX2蛋白的表達(dá)水平與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系

分析免疫組化TPX2蛋白的表達(dá)水平與對(duì)應(yīng)患者臨床數(shù)據(jù)的病理參數(shù)之間的關(guān)系。結(jié)果顯示：TPX2蛋白的表達(dá)水平與TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及患者生存有關(guān)（均P＜0.05）。但是與患者的性別、年齡、腫瘤大小、病理分化程度、CA19-9表達(dá)水平等無(wú)關(guān)（均P＞0.05）（表1）。

2.3 TPX2蛋白的表達(dá)水平與膽管癌患者術(shù)后生存期的關(guān)系

對(duì)術(shù)后60例患者獲隨訪(fǎng)，隨訪(fǎng)時(shí)間12～48個(gè)月。Kaplan-Meier生存曲線(xiàn)顯示術(shù)后生存時(shí)間TPX2蛋白陽(yáng)性組比TPX2蛋白陰性組生存時(shí)間明顯縮短。兩組患者總生存率的比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（2年生存率：27.6%vs.78.4%，3年生存率：14.3%vs.59.5%，均P＜0.05）（圖3）。

表1 TPX2蛋白表達(dá)與膽管癌患者臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系[n（%）]Table 1 Relations of TPX2 protein expression with clinical factors of cholangiocarcinoma patients [n (%)]

圖3 TPX2陽(yáng)性患者（28例）和陰性患者（32例）生存曲線(xiàn)比較Figure 3 Comparison of the survival curves between patients with positive TPX2 expression (28 cases) and those with negative TPX2 expression (32 cases)

3 討 論

早期診斷和完全手術(shù)切除為膽管癌患者提供了治愈的機(jī)會(huì),但目前缺乏早期篩查和診斷膽管癌有效方法，對(duì)于膽管癌晚期患者尚無(wú)有效的治療方法[24]。膽管癌被認(rèn)為是一種對(duì)放、化療不敏感的腫瘤。膽管癌比其他胃腸道腫瘤對(duì)化療敏感性差[25-26]。分子蛋白的鑒定和基因序列的測(cè)定可以幫助臨床醫(yī)生早期篩查和診斷膽管癌的患者，也為晚期癌癥患者提供靶向治療。TPX2是微管相關(guān)蛋白。TPX2過(guò)表達(dá)促進(jìn)微管形成。TPX2可從細(xì)胞核逃逸以調(diào)節(jié)非有絲分裂細(xì)胞的微管細(xì)胞骨架[27]。TPX2可以作為影響細(xì)胞周期的獨(dú)立因素。TPX2的過(guò)表達(dá)與胰腺癌的分級(jí)，浸潤(rùn)，淋巴轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)[19]。目前認(rèn)為T(mén)PX2可能通過(guò)影響細(xì)胞增殖、周期、凋亡及遷移和侵襲能力來(lái)影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展[17-23]。當(dāng)用TPX2siRNA干擾細(xì)胞TPX2蛋白表達(dá)時(shí)，促進(jìn)細(xì)胞的凋亡；將細(xì)胞周期阻滯于G2/M期而不能進(jìn)行正常的有絲分裂；抑制細(xì)胞的遷移和侵襲能力[17-25]。然而TPX2表達(dá)在膽管癌中罕有研究。

本研究中，在膽管癌癌旁組織中TPX2蛋白陰性表達(dá)率為91.7%（55/60），在膽管癌癌組織中TPX2蛋白陽(yáng)性表達(dá)率為46.7%（28/60）；通過(guò)Western blot技術(shù)檢測(cè)膽管癌癌組織與癌旁組織TPX2蛋白表達(dá)情況，結(jié)果示：TPX2蛋白在膽管癌組織中的表達(dá)水平顯著高于癌旁組織。說(shuō)明TPX2蛋白在膽管癌組織中高表達(dá)。運(yùn)用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分析TPX2蛋白與患者臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系，結(jié)果示：TPX2蛋白的表達(dá)水平與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 、TNM分期以及患者生存期有關(guān)；與年齡、性別、病理分化程度、CA199和腫瘤大小無(wú)關(guān)。術(shù)后無(wú)瘤生存時(shí)間TPX2蛋白陽(yáng)性組比TPX2蛋白陰性組無(wú)瘤生存時(shí)間明顯縮短。因此本研究可以得出結(jié)論：膽管癌患者癌組織中TPX2高表達(dá)提示預(yù)后不良。

綜上所述，本研究顯示TPX2膽管癌組織中處于高表達(dá)，是膽管癌患者術(shù)后發(fā)生轉(zhuǎn)移 、復(fù)發(fā)的危險(xiǎn)因素。TPX2可能是評(píng)價(jià)膽管癌患者預(yù)后的一個(gè)潛在生物學(xué)指標(biāo)，TPX2有可能作為分子標(biāo)記成為膽管癌免疫治療的潛在靶點(diǎn)。其影響膽管癌的發(fā)生和發(fā)展的具體機(jī)制尚不清楚，還需要多實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)行驗(yàn)證。

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