曹 綱 鄭美娟 郭金玲 田毅紅 呂育財(cái) 余華順 姚 鵑 龔大春

(1. 三峽大學(xué) 生物催化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 湖北 宜昌 443002； 2. 安琪酵母股份有限公司 酶制劑事業(yè)部， 湖北 宜昌 443002)

手性(R)-1-苯乙醇及其衍生物不僅是合成很多如(R)-沙丁胺醇、(R)-托莫西汀等手性藥物的中間體，而且也是重要的手性砌塊，廣泛應(yīng)用于精細(xì)化學(xué)品、天然產(chǎn)品等合成中[1-2]．目前，合成(R)-1-苯乙醇的方法主要有化學(xué)不對(duì)稱法、生物拆分、酶催化和整細(xì)胞催化4種方法．化學(xué)不對(duì)稱合成方法因?yàn)槠浯呋瘎﹥r(jià)格昂貴，光學(xué)選擇性低，底物轉(zhuǎn)化率在49%～64%之間，很難滿足市場(chǎng)要求[3-4]．生物拆分有手性試劑拆分[5]、酶法拆分[6]和整細(xì)胞拆分[7]，手性拆分劑價(jià)格和酶制劑昂貴，拆分工藝復(fù)雜，轉(zhuǎn)化率最多達(dá)到50%．而酶催化[8-10]和整細(xì)胞催化[11-12]制備(R)-1-苯乙醇已經(jīng)成為主要方法，具有成本低、原子經(jīng)濟(jì)、立體選擇性高等優(yōu)點(diǎn)．整細(xì)胞催化與酶催化相比具有操作簡(jiǎn)單，不用添加輔酶等優(yōu)勢(shì)．目前主要是采用假絲酵母[13]和解脂耶氏酵母[14]，但存在細(xì)胞生長(zhǎng)慢、底物容量小(100 mmol/L以下)、制備效率偏低等問(wèn)題．

本文根據(jù)乳酸克魯維酵母(Kluyveromyceslactics)具有營(yíng)養(yǎng)簡(jiǎn)單、生長(zhǎng)快、分泌蛋白能力強(qiáng)、不產(chǎn)生內(nèi)毒素和對(duì)人類安全[15]等優(yōu)點(diǎn)，用于苯乙酮的生物轉(zhuǎn)化．?dāng)M通過(guò)單因素和正交實(shí)驗(yàn)，研究Kluyveromyceslactics整細(xì)胞催化苯乙酮制備(R)-1-苯乙醇的工藝，期望能提高苯乙酮的底物容量和轉(zhuǎn)化率，為綠色生物加工放大提供一定的參考．

1 材料與主要儀器

1.1 菌種

Kluyveromyceslactics，實(shí)驗(yàn)室保藏菌種，培養(yǎng)溫度：25～30℃．

1.2 種子培養(yǎng)基

活化YPD培養(yǎng)基(g/L)為葡萄糖10，蛋白胨10，酵母浸粉5;斜面培養(yǎng)基(g/L)為葡萄糖10，蛋白胨10，酵母浸粉5，瓊脂粉20．

1.3 基礎(chǔ)培養(yǎng)基

轉(zhuǎn)化苯乙酮的基礎(chǔ)培養(yǎng)基(g/L)：酵母浸粉10，蔗糖24，磷酸二氫鉀1.5，七水合硫酸鎂1.0．

1.4 主要儀器

高效液相色譜儀LC5090(福立儀器有限公司)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器RE-52A4(上海亞榮生儀器廠)；CHIRALCEL OB-H手性柱 Particle Size：5 μm，Dimensions:Φ4.6 mm×250 mm．

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 Kluyveromyces lactics生長(zhǎng)培養(yǎng)基優(yōu)化

2.1.1 碳源優(yōu)化

選擇葡萄糖、乳糖等5種主要碳源，以各種碳源含碳量為基礎(chǔ)，按照等摩爾碳使用量原則進(jìn)行設(shè)計(jì)，其他培養(yǎng)基不變，攪拌轉(zhuǎn)速為100 rmp，培養(yǎng)溫度為30℃，采用表1進(jìn)行試驗(yàn)，發(fā)酵24 h后，測(cè)定實(shí)際菌體重量，確定Kluyveromyceslactics生長(zhǎng)所需要的最佳碳源．

表1 碳源添加量對(duì)克魯維乳酸酵母生長(zhǎng)的影響(單位：g/L)

2.1.2 氮源優(yōu)化

選用優(yōu)化的碳源種類和用量，其他培養(yǎng)條件不變，選擇酵母浸膏、牛肉膏等6種氮源按照表2進(jìn)行試驗(yàn)，確定Kluyveromyceslactics生長(zhǎng)所需要的最佳氮源．

表2 不同氮源添加量對(duì)克魯維乳酸酵母生長(zhǎng)的影響(單位：g/L)

2.1.3 克魯維乳酸酵母的生長(zhǎng)曲線

根據(jù)最佳碳源和氮源，測(cè)定乳酸克魯維酵母的生長(zhǎng)曲線，了解其對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，為生物催化添加底物時(shí)間提供依據(jù)．

在這方面，北海市2010年制定了《北海市建筑市場(chǎng)信用管理辦法》，并編制了配套使用的《不良行為和良好行為記錄認(rèn)定標(biāo)準(zhǔn)》，對(duì)在北海市從事建筑活動(dòng)的施工、監(jiān)理單位和從業(yè)人員給予日常行為記分，每年初根據(jù)上三年的行為進(jìn)行一次綜合信用評(píng)價(jià)分級(jí)。把評(píng)價(jià)結(jié)果量化為企業(yè)投標(biāo)得分，使建筑企業(yè)施工現(xiàn)場(chǎng)的表現(xiàn)和建筑市場(chǎng)的招投標(biāo)市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力有效地結(jié)合起來(lái)，實(shí)現(xiàn)了“兩場(chǎng)聯(lián)動(dòng)”，促使企業(yè)不再重投標(biāo)、輕工程管理。有利于信譽(yù)良好、實(shí)力雄厚、施工現(xiàn)場(chǎng)管理表現(xiàn)好的企業(yè)中標(biāo)，有利于引導(dǎo)建筑業(yè)企業(yè)注重標(biāo)后管理，逐步形成“守信者榮、失信者恥、無(wú)信者憂”的社會(huì)氛圍，從而推動(dòng)北海市建筑業(yè)的發(fā)展和工程建設(shè)水平的提高。

2.2 克魯維乳酸酵母整細(xì)胞催化工藝優(yōu)化

2.2.1 不同催化方式的比較研究

為了研究苯乙酮的生物催化工藝，選取先培養(yǎng)24 h后靜息催化、分別培養(yǎng)10 h和18 h后一次添加苯乙酮催化3種方式進(jìn)行試驗(yàn)，100 mL培養(yǎng)液中苯乙酮總添加量為3 g，濃度為249 mmol/L(添加前用少量正己烷溶解)，催化轉(zhuǎn)化12 h后，用正己烷萃取，分液后，取有機(jī)層，用無(wú)水硫酸鈉干燥，過(guò)濾，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后，用甲醇(色譜純)定容，采用高效液相和手性柱測(cè)定(R)-1-苯乙醇化學(xué)收率和光學(xué)收率，確定最適宜催化方式．

2.2.2 整細(xì)胞催化工藝優(yōu)化

選取最適宜催化方式，選取碳源、氮源、補(bǔ)料方式等5因素4水平進(jìn)行16次正交試驗(yàn)(見(jiàn)表3)，整細(xì)胞催化24 h．為了保證菌體具有一定的通透性，試驗(yàn)中添加了少量十二烷基磺酸鈉．采用2.2.1的后續(xù)處理方法，進(jìn)行(R)-1-苯乙醇化學(xué)收率和光學(xué)收率測(cè)定，并采用正交分析軟件，以(R)-1-苯乙醇產(chǎn)率為目標(biāo)，確定最佳催化工藝條件．

表3 苯乙酮整細(xì)胞催化五因素四水平表設(shè)計(jì)

表4 苯乙酮整細(xì)胞催化L16(45)正交實(shí)驗(yàn)表設(shè)計(jì)

注：A1～A4根據(jù)最佳碳源種類和最大菌濃對(duì)應(yīng)的量進(jìn)行設(shè)計(jì)；B1～B4根據(jù)最大氮源和最大菌濃對(duì)應(yīng)的量進(jìn)行設(shè)計(jì)，E1～E4分別代表在菌體生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期后一次添加底物、每隔6 h 2次添加底物、每隔4 h 3次添加底物、每隔2 h 6次添加底物．

通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)直觀分析和方差分析，確定最佳整細(xì)胞催化工藝條件和顯著影響因素．

2.3 (R)-1-苯乙醇光學(xué)純度和產(chǎn)率的測(cè)定

將轉(zhuǎn)化的發(fā)酵液采用2.2.1的方法處理，定容后，利用高效液相色譜儀CHIRALCEL OB-H手性柱，流動(dòng)相為正己烷∶異丙醇=9∶1，柱溫：30℃條件下，采用外標(biāo)法測(cè)定(R)-1-苯乙醇的化學(xué)收率和光學(xué)收率，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm，進(jìn)樣量為10 μL．

苯乙酮標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間為9.485 min，(R)-1-苯乙醇的保留時(shí)間為6.908 min，(S)-1-苯乙醇的保留時(shí)間為11.816 min(如圖1所示)．

圖1 苯乙酮、苯乙醇的HPLC圖譜

(R)-1-苯乙醇的光學(xué)收率=

3 結(jié)果與討論

3.1 乳酸克魯維酵母生長(zhǎng)特性研究

3.1.1 碳源的優(yōu)化

按照2.1.1的方法，采用葡萄糖、蔗糖等5種碳源，在不同濃度下進(jìn)行試驗(yàn)．結(jié)果如圖2所示．

圖2 不同碳源對(duì)乳酸克魯維酵母生長(zhǎng)影響

實(shí)驗(yàn)表明，Kluyveromyceslactics在木糖中生長(zhǎng)最慢，而對(duì)二糖乳糖、蔗糖利用較好，其中在蔗糖中生長(zhǎng)最快，因此蔗糖是Kluyveromyceslactics生長(zhǎng)的最佳碳源．在蔗糖用量為23.8 g/L時(shí)，菌體干重最大，菌體濃度最高，再增加蔗糖用量，會(huì)導(dǎo)致菌體生長(zhǎng)的滲透壓過(guò)高，不利于菌體生長(zhǎng)，其菌體濃度反而下降，同時(shí)也會(huì)帶來(lái)更多殘?zhí)鞘Ｓ?，不環(huán)保也不經(jīng)濟(jì)．

3.1.2 氮源的優(yōu)化

按照2.1.2的方法，采用酵母浸膏、牛肉膏等6種氮源選用不同濃度，固定蔗糖為23.8 g/L的條件下進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果如圖3所示．試驗(yàn)表明：Kluyveromyceslactics對(duì)硫酸銨和尿素等無(wú)機(jī)氮利用很緩慢，而對(duì)酵母浸粉和酵母浸膏利用較好，牛肉膏和蛋白胨次之．通過(guò)優(yōu)化，在酵母浸粉10 g/L條件下，菌體濃度最高，再增加用量，殘氮會(huì)增加，菌體濃度增加緩慢．

圖3 不同氮源對(duì)乳酸克魯維酵母生長(zhǎng)影響

3.1.3Kluyveromyceslactics生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

在蔗糖23.8 g/L，氮源酵母浸粉10 g/L，磷酸二氫鉀2 g/L，七水合硫酸鎂1.5 g/L的條件下，30℃培養(yǎng)，每隔2 h測(cè)定一次菌體干重，繪制生長(zhǎng)曲線．結(jié)果表明：乳酸克魯維酵母在10 h之前生長(zhǎng)較慢，10 h后進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，在18 h菌體濃度達(dá)到最大，進(jìn)入平臺(tái)期(如圖4所示)．本曲線測(cè)定為整細(xì)胞催化工藝提供依據(jù)．

圖4 乳酸克魯維酵母Kluyveromyces lactics生長(zhǎng)曲線

3.2 不同催化方式的比較研究

為了研究乳酸克魯維酵母Kluyveromyceslactics對(duì)苯乙酮的催化能力，按照2.2.1的方法對(duì)苯乙酮的生物催化方式進(jìn)行了研究，結(jié)果見(jiàn)表5．實(shí)驗(yàn)表明，兩種方式對(duì)苯乙酮整細(xì)胞催化后產(chǎn)生的(R)-1-苯乙醇的光學(xué)收率影響不大，但(R)-1-苯乙醇化學(xué)收率有較大差異，邊培養(yǎng)邊添加苯乙酮進(jìn)行整細(xì)胞催化收率比靜息細(xì)胞催化提高38.5%，在酵母對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后期18 h時(shí)一次添加比在10 h對(duì)數(shù)生長(zhǎng)前期加入好，可提高25%的產(chǎn)率．因此，后續(xù)工藝優(yōu)化實(shí)驗(yàn)采用18 h后添加苯乙酮的整細(xì)胞催化方式．

表5 不同催化方式對(duì)苯乙酮的乳酸克魯維酵母整細(xì)胞催化的影響

3.3 苯乙酮的整細(xì)胞動(dòng)態(tài)催化工藝優(yōu)化

按照2.2.2的方法，按照分批添加底物苯乙酮的方法，底物苯乙酮總?cè)萘坎蛔?，保持?49 mmol/L．利用Kluyveromyceslactics進(jìn)行5因素4水平的正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化，結(jié)果見(jiàn)表6．

表6 苯乙酮的乳酸克魯維酵母正交試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)以上正交實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，結(jié)合直觀分析表，可知5個(gè)因素對(duì)結(jié)果的影響大小順序?yàn)椋篍>A>B>C>D，苯乙酮添加方式對(duì)結(jié)果影響最大，方差分析顯示，碳源用量和苯乙酮添加方式為顯著性影響因素，F(xiàn)比值分別為11.165和22.468，大于F臨界=9.28(a=0.05)．Kluyveromyceslactics動(dòng)態(tài)催化苯乙酮制取(R)-1-苯乙醇的最優(yōu)工藝為A2、B3、C1、D2、E3，即蔗糖23.0 g/L，酵母浸粉10.0 g/L，磷酸二氫鉀2.0 g/L，七水合硫酸鎂1.50 g/L，培養(yǎng)18 h后每隔4 h添加一次底物，催化效果最好．通過(guò)分批添加，有效減少了苯乙酮對(duì)酵母細(xì)胞的毒性，提高了轉(zhuǎn)化率．

3.4 轉(zhuǎn)化苯乙酮效率的驗(yàn)證試驗(yàn)

在最優(yōu)的整細(xì)胞催化工藝條件下，苯乙酮的容量為249 mmol/L，在蔗糖23.0 g/L，酵母浸粉10.0 g/L，磷酸二氫鉀2.0 g/L，七水合硫酸鎂1.50 g/L，培養(yǎng)18 h后，每隔4 h添加一次底物，整細(xì)胞催化(R)-1-苯乙醇化學(xué)收率可以達(dá)到95%，光學(xué)收率為99.5%，是目前利用酵母整細(xì)胞催化制備(R)-1-苯乙醇效果最好的方法．研究發(fā)現(xiàn)，如果進(jìn)一步提高底物濃度至300 mmol/L時(shí)，由于細(xì)胞耐受度有限，化學(xué)收率會(huì)有一定程度下降，只能達(dá)到70%左右．

4 結(jié) 論

在充分研究乳酸克魯維酵母Kluyveromyceslactics生長(zhǎng)特性的基礎(chǔ)上，對(duì)苯乙酮制備(R)-1-苯乙醇的整細(xì)胞催化工藝進(jìn)行了研究．結(jié)果表明，乳酸克魯維酵母Kluyveromyceslactics培養(yǎng)18 h后添加苯乙酮細(xì)胞催化比靜息細(xì)胞催化效率高38.5%，在5因素4水平的優(yōu)化條件下，采用蔗糖23.0 g/L，酵母浸粉10.0 g/L，磷酸二氫鉀2.0 g/L，七水合硫酸鎂1.50 g/L，培養(yǎng)18 h后每隔4 h添加一次苯乙酮，苯乙酮的容量控制為249 mmol/L，30℃條件下生物催化24 h得到的(R)-1-苯乙醇化學(xué)收率最高，可以達(dá)到95%，光學(xué)收率達(dá)到99.5%，是目前酵母細(xì)胞催化裝載濃度最高的(R)-1-苯乙醇制備方法，具有一定的應(yīng)用前景．后期要進(jìn)一步通過(guò)微生物育種，提升底物耐受力，不斷提高底物容量，并保證催化效率90%以上，使該工藝更加具有經(jīng)濟(jì)性．

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