劉婷

（國家知識產(chǎn)權(quán)局專利局審查協(xié)作廣東中心，廣東廣州 511363）

1 微藻柴油的優(yōu)勢

目前，全球1/5的二氧化碳排放來自交通部門。預(yù)計到2050年，全球道路上輕型機(jī)動車的數(shù)量將增加到20億輛[1]，減排前景并不樂觀。由于供應(yīng)量的減少，原油的成本將不斷增加，從而使天然來源的燃料生產(chǎn)更為可行。由于CO2等氣體的釋放，化石燃料的持續(xù)使用將進(jìn)一步加劇氣候變化。生物柴油是從微藻油中提煉出來的，因此，在不久的將來，生物質(zhì)微藻油將替代石化石油，成為可生物利用的生物柴油。生物柴油是由甘油三酯或游離脂肪酸與短鏈醇酯交換制備的單烷基酯，具有在常規(guī)柴油機(jī)中很少或不需要改性的能力，而且已被證明比石化柴油的生態(tài)毒性少。研究結(jié)果表明，濃度大于3%（W/W）的柴油對土壤微生物具有毒性，而生物柴油在整個土壤飽和時是無毒的[2]。隨著環(huán)境問題日益被關(guān)注，這些因素在生物柴油的可接受性中起著重要的作用。第一代生物燃料已經(jīng)問世一個多世紀(jì)，生物柴油目前在美國由大豆生產(chǎn)。生物柴油的來源包括菜籽油、動物脂肪、棕櫚油、玉米油、廢食用油和麻風(fēng)樹油。植物油在燃料生產(chǎn)中的應(yīng)用一直備受爭議，如需要耕地等資源，耕地的數(shù)量可能不足以滿足指定區(qū)域的燃料需求，并會極大地影響糧食安全。目前，全球可用耕地的1%用于農(nóng)作物生物燃料（第一代生物燃料）的生產(chǎn)，這種燃料僅滿足1%的全球燃料需求[3]。從替代來源的研究來看，微藻生產(chǎn)生物柴油被譽為最合適的石化柴油替代品。微藻是世界上最大的生命類群自養(yǎng)微生物。微藻的生長率較高[4]，可以迅速積累比陸地植物更多的脂質(zhì)，其脂質(zhì)作為中性脂質(zhì)儲存。微藻油和廢生物質(zhì)為生物柴油原料提供了良好的潛在來源。

不同于油料作物，微藻的生長周期非常短，其在一個年份能夠進(jìn)行多次連續(xù)的收獲[5]。微藻具有較高的太陽轉(zhuǎn)化率，脂質(zhì)生產(chǎn)率較高。微藻產(chǎn)生的脂質(zhì)通常是中性脂質(zhì)，具有高水平的飽和度，使其成為生物柴油生產(chǎn)的合適原料。微藻生長速度快，繁殖時間短。微藻在24 h內(nèi)將生物量增加1倍，有些物種的繁殖時間短于3.5 h，即每天多生物量分裂。微藻理論產(chǎn)量可以達(dá)到47000～308000 L/hm2生物柴油。相比之下，棕櫚油每年可以生產(chǎn)5 950 L/h·m2的生物柴油[6]。微藻比植物需要更少的培養(yǎng)用新鮮水源。微藻栽培可以在非耕地中，在微咸水中發(fā)生，從而減少對生產(chǎn)糧食作物所需資源的侵占，同時減少對其他環(huán)境影響。不需要使用除草劑或殺蟲劑之類的化學(xué)物質(zhì)，從而降低成本和環(huán)境影響[7]。此外，這些微生物需要相當(dāng)少的土地，據(jù)估計只需要含油作物2%的土地就能生產(chǎn)和含油作物同樣數(shù)量的生物柴油。微藻可以有效地去除廢水中的磷酸鹽和硝酸鹽。廢水可以成為培養(yǎng)生產(chǎn)生物燃料的微藻的理想基質(zhì)，同時使微藻成為廢水的三級處理手段。一些微藻生產(chǎn)有價值的副產(chǎn)品，其形式為蛋白質(zhì)、色素、生物聚合物和含有二十二碳六烯酸和類胡蘿卜素的碳水化合物，包括商業(yè)或醫(yī)藥用途的抗氧化劑物質(zhì)。與油料作物相比，微藻與采油和運輸有關(guān)的成本較低，可以使用提取后殘余的生物質(zhì)作為肥料或生產(chǎn)其他高能產(chǎn)品來提高經(jīng)濟(jì)性。微藻生物柴油在環(huán)境方面十分有利，因為它是一種車用中性燃料，由大氣二氧化碳的光合固定產(chǎn)生[8]。微藻生物柴油具有與石化相似的性能，包括密度、黏度、閃點、冷流和熱值。生物柴油的其他潛在來源中，沒有一個像微藻柴油替代石油、柴油一樣在可持續(xù)性方面是現(xiàn)實的，這主要是由于使用其他原料引起的環(huán)境影響。熱解作為生物柴油生產(chǎn)的另一種方法，以微藻生物作為原料比木質(zhì)纖維素生物質(zhì)更具成本效益，微藻中含有更多的細(xì)胞脂質(zhì)、多糖和蛋白質(zhì)，它們更容易熱解并導(dǎo)致更高質(zhì)量的生物柴油生產(chǎn)[9]。

2 微藻利用所面臨的挑戰(zhàn)

微藻、微藻柴油的分離是使用微藻生產(chǎn)生物柴油的主要挑戰(zhàn)之一。儲存脂質(zhì)的微藻通常是單細(xì)胞的，密度低，在懸浮液中難以被分離。微藻脂質(zhì)大規(guī)模提取過程復(fù)雜，仍處于發(fā)展階段，目前正在進(jìn)行研究以解決這些問題。在開放池塘系統(tǒng)中生長的微藻易于接觸細(xì)菌，細(xì)菌污染競爭營養(yǎng)物質(zhì)和氧化有機(jī)物質(zhì)，可能導(dǎo)致培養(yǎng)物的腐敗。異養(yǎng)細(xì)菌的控制可以通過提高pH值來實現(xiàn)。在藻類積水系統(tǒng)中普遍發(fā)現(xiàn)的需氧菌的最適pH為8.3，使pH超過這個水平能夠有效地抑制，從而通過影響氮吸收效率來防止競爭[10-11]。開放系統(tǒng)也易受到原生動物和浮游動物形式的捕食者的攻擊，這些生物能在相對短的時間（2～3天）中破壞藻類密度。浮游動物可以在48 h內(nèi)將微藻密度降低90%，而水蚤可以在幾天內(nèi)將微藻密度降低99%[12]?？刂七@些生物的方法有多種，如過濾、離心、低溶解氧（DO）、激素的應(yīng)用和游離氨的增加。然而，這些方法的缺點是過濾困難，因為微藻物種的大小，例如小球藻，使分離很困難。大規(guī)模離心需要高昂的資本和昂貴的能源投入。據(jù)估計，每公頃每年需要6～8 t硝酸鹽，相當(dāng)于大田作物需求量的55～111倍。通過使用廢水作為生長基質(zhì)，可減輕相關(guān)成本。同時，使用生物柴油作為燃料，它易受到細(xì)菌氧化，隨后導(dǎo)致儲罐的內(nèi)部腐蝕。大量的甘油會作為副產(chǎn)品產(chǎn)生，很可能會淹沒市場，從而使價格降低。在酯交換過程中使用的甲醇目前來源于原油。這些挑戰(zhàn)可以通過改進(jìn)生物柴油儲存罐的設(shè)計等措施來克服，可以通過引入生物精煉廠的概念來克服精煉過程中較高的成本需求，其中通過生物質(zhì)轉(zhuǎn)化為能量，從而使生產(chǎn)過程無廢料。大量生產(chǎn)的甘油可用于制造價值更高的產(chǎn)品，或在第三世界國家中以肥皂和蠟燭的形式造福社會。作為生物煉制概念的一部分，可以有效地利用甘油作為發(fā)酵原料生產(chǎn)甲烷。生物柴油在未來有可能成為100%的生物燃料[13]。

3 微藻生產(chǎn)油脂的篩選

篩選產(chǎn)油微藻是優(yōu)化生物柴油生產(chǎn)的重要部分。某些菌株如Botryococcus braunii具有高的脂質(zhì)儲存潛力（高達(dá)75%的脂質(zhì)/g干細(xì)胞重量），但這伴隨著低生產(chǎn)率。適度的脂質(zhì)積累水平（20%～50%），產(chǎn)脂率較高的微藻培養(yǎng)物是大規(guī)模培養(yǎng)優(yōu)選的菌種。除了脂質(zhì)代謝的因素，脂質(zhì)分布在特定的環(huán)境條件下生長的能力也需要被考慮。脂質(zhì)的分布受營養(yǎng)、加工和滴定條件的影響，選擇標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)以多種因素為基礎(chǔ)，包括生長速率、脂類數(shù)量和質(zhì)量、對環(huán)境變化的強(qiáng)適應(yīng)性和優(yōu)選營養(yǎng)素和養(yǎng)分吸收率的測定[14]。為了獲得高的收油率，必須確定在正常條件下產(chǎn)生的油量。從規(guī)模經(jīng)濟(jì)的角度來看，產(chǎn)量優(yōu)化非常重要。可以通過限制控制生長的一個或多個變量來誘導(dǎo)靜息期的微藻，如限制氮、磷或硅[15]。微藻適應(yīng)環(huán)境變化通常是通過脂質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化和合成各種在用于抵抗環(huán)境變化的化合物來完成的[16]，這可能是微藻在承受壓力的條件下過度產(chǎn)生脂肪酸的原因。因此，可以通過氮饑餓或其他應(yīng)激因素誘導(dǎo)或增強(qiáng)脂質(zhì)含量營養(yǎng)不足，如將培養(yǎng)環(huán)境中的硅耗盡可能誘導(dǎo)細(xì)胞脂質(zhì)含量的增加。通過硅饑餓可以使硅藻Navioua pelliculosa增加60%的脂質(zhì)含量。據(jù)報道，在干重的基礎(chǔ)上，脂質(zhì)組分可以高達(dá)70%～85%。這樣的高脂質(zhì)含量超過大多數(shù)陸地植物的含量。

某些硅藻具有通過某種機(jī)制迅速從碳?xì)浠衔锓e累轉(zhuǎn)變?yōu)橹|(zhì)積累的能力。硅藻在微藻脂質(zhì)生產(chǎn)中的應(yīng)用極具潛力。在生長的早期階段，產(chǎn)生大量極性脂質(zhì)和多不飽和的C16和C18脂肪酸。這與在接近生長靜止期時產(chǎn)生的主要脂質(zhì)不同，其通常由中性飽和的18-1和16:0長鏈脂肪酸組成。然而，脂質(zhì)成分的變化一般取決于藻的種類，比如藍(lán)綠色微藻在生長周期中的組成變化相對較小。溫度和光在產(chǎn)生脂質(zhì)的類型中也起作用。光照促進(jìn)了Euglena gracils 和Chlorella vulgaris中多不飽和C16和C18脂肪酸，以及單和雙半乳糖基甘油二酯、鞘脂和磷酸甘油酯的產(chǎn)生。用Monochrysis lutheri合成多不飽和C18脂肪酸，Dunaliella salina的脂肪酸組成的變化都可以通過低溫條件下的生長來實現(xiàn)[17]。

水環(huán)境中鹽含量變化所引起的應(yīng)力可以影響微藻細(xì)胞內(nèi)含有的脂質(zhì)量。在1 mol/L NaCl中生長的鹽水微藻細(xì)胞內(nèi)脂類和三酰甘油（67%和56%脂質(zhì)）含量顯著高于0.5 mol/L NaCl（60%和40%脂質(zhì)）的培養(yǎng)物。據(jù)報道，Dunaliella salina細(xì)胞響應(yīng)于增加的NaCl濃度分泌甘油[17]。

不同種類的微藻產(chǎn)生的脂肪酸不同，需要進(jìn)行脂質(zhì)的驗證。有些脂肪酸比其他脂肪酸更適合于生物柴油的酯交換反應(yīng)。大多數(shù)微藻油富含多不飽和脂肪酸，具有4個或更多的雙鍵。與這種程度的多不飽和有關(guān)的問題是，這些脂肪酸和脂肪酸甲酯（FED）在儲存過程中易氧化，它們在生物柴油中的可利用性比較低。大規(guī)模培養(yǎng)所需的菌株在規(guī)模較大的培養(yǎng)條件下，必須產(chǎn)生適宜的油脂。然而，這是難以確定的，因為開放系統(tǒng)的模擬依賴于許多因素，不能準(zhǔn)確地在實驗室中被執(zhí)行。微藻生長需要豐富的營養(yǎng)基質(zhì)，利用更便宜的可用底物如廢水的可能性，可以使該方法在經(jīng)濟(jì)上更可行。

4 篩選培養(yǎng)基的選擇

微藻的生產(chǎn)需要氮和磷等重要無機(jī)營養(yǎng)物。微藻類已知的營養(yǎng)需求不僅包括營養(yǎng)成分的種類，而且還包括所提供的營養(yǎng)物質(zhì)的濃度。因此，微藻生長培養(yǎng)基通常由氮源、磷酸鹽和金屬螯合劑組成的營養(yǎng)素組成。鐵一般以微量營養(yǎng)素的形式供應(yīng)。小球藻已知在營養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基中生長相當(dāng)好，在1.25 g/L KNO3的WATANABE培養(yǎng)基中小球藻的生長狀態(tài)很好。培養(yǎng)條件的改變可以作為一種操縱代謝途徑的機(jī)制，從而導(dǎo)致細(xì)胞功能的重新定向，以生產(chǎn)所需的產(chǎn)品，如中性脂質(zhì)。營養(yǎng)過于豐富的培養(yǎng)基可能會導(dǎo)致營養(yǎng)毒性引起的死亡。篩選培養(yǎng)基中的營養(yǎng)條件，理想地應(yīng)該是將營養(yǎng)濃度范圍從低到高依次進(jìn)行篩選，以便排除潛在的營養(yǎng)缺乏或過量的營養(yǎng)供應(yīng)。應(yīng)注意，過多的添加酵母提取物和其他可能支持細(xì)菌生長的成分會引起細(xì)菌的生長。細(xì)菌的過度生長可通過誘導(dǎo)缺氧條件或引起培養(yǎng)毒性引起微藻死亡。

全球能源危機(jī)迫使人們尋求替代和環(huán)境友好的能源。在過去的20年里，注意力轉(zhuǎn)向研究開發(fā)和優(yōu)化生物燃料技術(shù)。在這方面，微藻中的生物柴油顯示出作為一種合適的替代物的潛力。然而，實驗室中試結(jié)果顯示，大規(guī)模商業(yè)應(yīng)用仍然存在著很多障礙，包括菌種選擇、種子培養(yǎng)、生物量和油脂產(chǎn)量優(yōu)化，生物反應(yīng)器的配置、物理化學(xué)參數(shù)和脂質(zhì)提取、優(yōu)化等最重要的環(huán)節(jié)。因此，實現(xiàn)微藻柴油完全替代石化柴油仍有許多的努力要做。