李靖靖 李紅梅

摘要：普那霉素是一種新型的抗生素，對大多數革蘭氏陽性菌和部分革蘭氏陰性菌有強烈的抑制作用，是萬古霉素的替代藥物。對1株普那霉素產生菌Streptomyces pristinaespiralis LS15進行了Genome Shuffling的育種研究。首先，利用亞硝基胍對LS15進行誘變，涂布鏈霉素抗性平板并搖瓶篩選獲得了6株普那霉素產量提高的菌株，提高幅度為24.1%～30.3%；然后將該6株菌混合后培養(yǎng)制備原生質體，以紫外滅活、熱滅活作為遺傳標記進行了三輪Genome Shuffling育種，搖瓶篩選獲得了1株普那霉素產量大幅提高的融合子GS3-26，為2.15 g/L，比原始菌株提高了91.5%。融合子GS3-26與原始菌LS15相比，其胞內酶HK，PK，AK，CS等酶活均有不同程度的提高，是普那霉素產量提高的原因之一。

關鍵詞：普那霉素；Genome Shuffling；鏈霉素

中圖分類號：TQ465 文獻標志碼：A doi：10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2018.03.017

文章編號：1671-9646（2018）03a-0055-04

Abstract：Pristinamycin is a new kind of antibiotics，which can inhibit majority of gram-positive bacteria and some gram-negative bacteria，being considered as the replacement of vancomycin. In this paper，Genome Shuffling was adopted to breeding pristinamycin-producing strain Streptomyces pristinaespiralis LS15. Firstly，LS15 was suffered from NTG mutation and coated on agar plate with streptomycin，then six mutants with higher pristinamycin production were selected by shaker flask fermentation，ranging from 24.1% to 30.3%. Three rounds of Genome Shuffling were carried out based on protoplast fusion by UV and heat inactivation as genetic marker. Finally one fusion named GS3-26 was selected with the highest pristinamycin production of 2.15 g/L，which was 91.5% over the original strain. Enzyme activity such as HK，PK，AK，CS，etc in GS3-26 were higher than those in initial strain LS15，which was one reason for the increased production.

Key words：pristinamycin；Genome Shuffling；streptomycin

近年來，隨著臨床上抗生素的普遍應用，很多感染性病菌的耐藥性也逐漸增強，致使抗生素的劑量不斷加大，如耐青霉素的肺炎球菌、耐萬古霉素的腸球菌、耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌等[1-2]。因此，迫切需要新型的抗生素來抵抗這些耐藥菌株的感染，而普那霉素則成了新型抗生素的首選。普那霉素屬于革蘭氏陽性菌素類抗生素，由始旋鏈霉菌發(fā)酵產生，可以通過與核糖體結合從而抑制蛋白的合成，對大多數革蘭氏陽性菌和部分革蘭氏陰性菌有較強的抑制作用，是萬古霉素的替代藥物[3]。更重要的是，對普那霉素制劑的臨床應用證明，只有極少數的細菌會對其產生微弱的耐藥性，因此普那霉素在抵抗多重耐藥菌方面起到了重要作用，具有廣闊的市場前景[4]。

目前，國內對普那霉素的研究較少，菌株發(fā)酵尚處于較低的水平，一般效價不超過2 000 U/mL，發(fā)酵單位不超過1 500 mg/L[3]。為了進一步提升普那霉素的發(fā)酵水平，降低生產成本，試驗對1株普那霉素產生菌Streptomyces pristinaespiralis LS15進行了Genome Shuffling的育種研究，以進一步提升其發(fā)酵能力，為后續(xù)研究工作提供性能優(yōu)良的菌株。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

普那霉素產生菌S. pristinaespiralis LS15，土壤中篩選并由鄒平縣綜合檢驗檢測中心保藏。

瓊脂培養(yǎng)基：可溶性淀粉 10 g/L，黃豆餅粉 2 g/L，酵母抽提物 1 g/L，瓊脂 20 g/L，初始pH值7.0，121 ℃滅菌20 min。

再生培養(yǎng)基：瓊脂培養(yǎng)基中加入蔗糖105 g/L。

發(fā)酵培養(yǎng)基：酵母抽提物6 g/L，葡萄糖 30 g/L，KH2PO4·2H2O 1.2 g/L，（NH4）2SO 48 g/L，K2HPO4·2H2O 1.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.8 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.05 g/L，ZnSO4·7H2O 0.05 g/L，pH值7.0，115 ℃滅菌20 min。

1.2 試驗方法

1.2.1 亞硝基胍（NTG）誘變

在分析天平上稱取NTG 30 mg，用 pH值7.0的無菌磷酸鹽緩沖液30 mL溶解，則NTG溶液質量濃度為1 mg/mL。刮取1環(huán)孢子，用無菌磷酸緩沖液10 mL混合振蕩，分散均勻，再將孢子質量濃度稀釋為107～108個/ mL。吸取孢子懸液及NTG溶液各2 mL，于試管中混合均勻，則NTG的終質量濃度為0.5 mg/mL，將試管置于30 ℃水浴中，每隔10 min取樣0.5 mL，稀釋100倍后涂布平板。

1.2.2 發(fā)酵培養(yǎng)

從瓊脂培養(yǎng)基上刮取孢子2環(huán)，無菌條件下接入50 mL/250 mL的種子培養(yǎng)基中，于30 ℃，200 r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)30 h。每株菌接入3個搖瓶，普那霉素產量取三者的平均值。

1.2.3 原生質體制備及融合

（1）各NTG突變株的孢子接入發(fā)酵培養(yǎng)基， 于30 ℃，200 r/min條件下培養(yǎng)30 h。

（2）吸取種子液10 mL轉入無菌離心管中，以轉速5 000 r/min離心5 min。

（3）將上清液倒掉，加入10 mL無菌水，振蕩洗滌菌體，重復離心棄上清液，再改用10 mL PB高滲液洗滌菌體2次，最后加入5 mL PB液，混勻菌絲體。

（4）用質量濃度為5 mg/mL溶菌酶制備原生質體，在30 ℃條件下保溫90 min，期間每隔10 min輕輕振蕩混勻。

（5）將原生質體分成2份，1份在70 ℃條件下保溫30 min鈍化，1份在紫外線下照射60 min鈍化。

（6）2份原生質體再次混合均勻，以5 000 r/min轉速離心15 min，倒掉上清液，加入PB高滲液1 mL，用移液槍輕輕吹洗沉淀，使其分散均勻。

（7）加入質量分數為40%的PEG6000 溶液3 mL，輕輕吹洗，使其混合均勻，然后將懸液置于37 ℃水浴中15 min，進行原生質體融合。

（8）用PB高滲液稀釋懸液，雙層瓊脂法涂布再生平板。

1.3 發(fā)酵液中普那霉素含量測定

高效液相色譜法測定發(fā)酵液中普那霉素含量[3]。

1.4 酶活測定

己糖激酶（Hexokinase，HK）、丙酮酸激酶（Pyruvate kinase，PK）、天冬氨酸激酶（Aspartokinase，AK）、檸檬酸合成酶（Citrate synthase，CS）的酶活測定參照相關文獻[5-8]。

2 結果與分析

2.1 NTG誘變劑量的確定

NTG是一種烷化劑，具有多個活性烷基，它們容易取代DNA中的活潑氫原子，使DNA分子上的堿基和部分磷酸被烷化，DNA復制時導致堿基配對發(fā)生錯誤而引發(fā)突變，因而素有“超誘變劑”之稱。試驗采用質量濃度為0.5 mg/mL的NTG溶液對S. pri-stinaespiralis LS15的孢子處理不同時間，以不經誘變的孢子作為對照，涂布瓊脂平板計算誘變致死率。

NTG誘變S. pristinaespiralis LS15孢子的致死率曲線見圖1。

根據圖1可以看出，隨著NTG處理時間的延長，菌株孢子的致死率也隨之增加，一般選擇致死率為80%左右為宜，所以將NTG的處理時間確定為70 min。

2.2 鏈霉素抗性濃度的確定

普那霉素是一種次級代謝產物，在放線菌產次級代謝產物的誘變研究中，“核糖體工程育種”是普遍采用的一種方法。微生物的核糖體是蛋白和酶的合成機器，其某些特定位點會被一些抗生素所結合從而降低活性，如鏈霉素、慶大霉素、利福霉素等，但是當編碼核糖體的基因發(fā)生突變后，核糖體不再與抗生素結合，或者即使結合了也不會降低活性，菌株表現(xiàn)出抗性，從而導致次級代謝產物的過量合成[9-10]?；谏鲜鲈?，試驗選取鏈霉素作為抗性指標對S. pristinaespiralis LS15進行誘變篩選。

S. pristinaespiralis LS15對鏈霉素的抗性見表1。

當鏈霉素質量濃度達到4 mg/mL時幾乎完全抑制了S. pristinaespiralis LS15的生長。

2.3 誘變及篩選

根據以上的試驗結果，對S. pristinaespiralis LS15進行了基于鏈霉素抗性的NTG誘變及搖瓶篩選。采用質量濃度為0.5 mg/mL的NTG溶液對孢子處理70 min后，涂布梯度范圍為0～10 mg/mL的鏈霉素抗性平板。在前期試驗中已經證實S. pristinaespiralis LS15對鏈霉素的臨界質量濃度為4 mg/mL，但經過NTG誘變后，在梯度平板的中上部（可以認為鏈霉素的質量濃度范圍為5～10 mg/mL）有部分菌株能夠生長，說明該區(qū)域的菌株獲得了鏈霉素抗性，屬于突變菌株，證明了NTG誘變的有效性。

菌株在鏈霉素抗性平板上呈梯度分布見圖2。

從高質量濃度鏈霉素的區(qū)域挑選了生長速度較快的50個單菌落，轉接到常規(guī)瓊脂培養(yǎng)基中上培養(yǎng)，使其正常產孢子。每株菌接入3個搖瓶進行發(fā)酵，測定普那霉素含量以篩選正向突變菌株。最終獲得了6株普那霉素搖瓶產量提高的菌株，分別為1.42， 1.39，1.41，1.46，1.41，1.43 g/L，相比于初始菌株的1.12 g/L提高幅度為24.1%～30.3%。該結果說明不僅NTG誘變是有效的，以鏈霉素作為抗性指標也是切實可行的，該6株產量提高菌株可以作為后續(xù)的Genome Shuffling育種的出發(fā)菌株。

NTG誘變后篩選出的普那霉素產量提高菌株見圖3。

2.4 Genome Shuffling育種

將NTG誘變篩選得到的6株普那霉素產量提高菌株的孢子分別接入發(fā)酵培養(yǎng)基，培養(yǎng)30 h后獲得種子。將6株菌的菌絲混合后制備原生質體，按照既定的方法進行原生質體的滅活、融合及再生，該過程為第1輪Genome Shuffling。

菌絲及原生質體的形態(tài)見圖4。

在第1輪Genome Shuffling的原生質體再生過程中，選取再生速度、生長速度及菌絲孢子化速度較快的50個單菌落轉接常規(guī)瓊脂培養(yǎng)基，使其正常產孢子，然后每株菌接入3個搖瓶進行發(fā)酵，測定普那霉素含量以篩選產量提高菌株并最終獲得了4株，搖瓶產量分別為1.62，1.69，1.61，1.66 g/L。將這4株菌作為出發(fā)菌株，再次接種培養(yǎng)制備原生質體，重復第1輪Genome Shuffling的過程，搖瓶篩選獲得了5株普那霉素產量進一步提高的菌株，分別為1.92， 1.89，1.94，1.94，1.86 g/L。再次重復進行第3輪Genome Shuffling，最終又篩選得到了2株普那霉素產量提升的融合子，搖瓶產量分別為2.06，2.15 g/L，相比于出發(fā)菌株的1.12 g/L提高幅度高達91.5%。

Genome Shuffling選育S. pristinaespiralis LS15的過程見圖5。

2.5 高產融合子與初始菌株的胞內酶活測定

為了初步解釋Genome Shuffling育種獲得的融合子S. pristinaespiralis GS3-26相比初始菌株LS15高產普那霉素，試驗選取了菌株代謝途徑中的一些關鍵酶進行了酶活測定，這些酶有糖酵解途徑（EMP途徑）中的己糖激酶（Hexokinase，HK）和丙酮酸激酶（Pyruvate kinase，PK），二氨基庚二酸途徑（DAP途徑）中的天冬氨酸激酶（Aspartokinase，AK）和三羧酸循環(huán)過程中（TCA）的檸檬酸合成酶（Citrate synthase，CS）。GS3-26與LS15在發(fā)酵培養(yǎng)基中分別培養(yǎng)30 h后，相同處理方式下測定4種酶的活力。

菌株S. pristinaespiralis LS15與GS3-26的酶活比較見表2。

普那霉素的分子骨架由很多氨基酸殘基聚合而成，因此菌體細胞中氨基酸的合成對于普那霉素的產量有重要的影響[4]，而氨基酸的合成主要來自TCA循環(huán)。從表2的酶活比較中可以看出，高產融合子GS3-26的CS酶活在相比LS15提高了55.2%，CS作為TCA循環(huán)中的第1個關鍵酶，其酶活增強說明TCA循環(huán)在GS3-26中得到了強化。賴氨酸主要由DAP途徑合成，而DAP途徑中的關鍵酶AK在GS3- 26中的活性也提高60.7%。TCA循環(huán)的增強勢必需要上游EMP途徑的增強，通過酶活比較可知，EMP途徑中的HK與PK也確實有不同程度的酶活提升。

3 討論

Genome Shuffling，也叫基因組改組或者基因組重排，該法首先以傳統(tǒng)方法誘變菌株，篩選獲得若干表型提高的突變株，然后將這些菌株混合后進行原生質體融合，并且重復多輪次，因而使各突變基因隨機發(fā)生重組，最后篩選出目標菌株。Genome Shuffling育種的高效性已經在提高泰樂菌素[11]、羥基酸（HCA）[12]、原始霉素[13]、ε -聚賴氨酸[14]產量等研究中得到了驗證，在提高乳酸菌的耐葡萄糖、耐乳酸能力，提高酵母菌耐高溫、耐乙醇能力等方面也發(fā)揮了巨大的作用[15]。從理論上而言，Genome Shuffling是整個基因組水平上的循環(huán)重組，可以將多個親株的優(yōu)良性狀通過多輪的隨機融合集中于同一個細胞中，與基因/代謝工程相比，其突出優(yōu)點是不必了解整個基因組的序列數據和代謝網絡的信息。本研究中，作者采用亞硝基胍誘變結合鏈霉素抗性對S. pristinaespiralis LS15產普那霉素進行了3輪Genome Shuffling育種，最終獲得的融合子GS3-26，搖瓶發(fā)酵產量達到2.15 g/L，比原始菌株提高了91.5%，再次證明了Genome Shuffling育種的高效性，后續(xù)研究工作需要聚焦于培養(yǎng)基優(yōu)化及發(fā)酵工藝調控方面，以進一步提升普那霉素的發(fā)酵水平。

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