李 豪，李 鵬，嚴(yán) 潔，解文利，周開亞

(南京師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，江蘇省生物多樣性與生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210023)

千百年來(lái)，地球上的萬(wàn)物早已適應(yīng)地球晝夜交替的周期性變化，從細(xì)菌到哺乳動(dòng)物，幾乎所有生物體內(nèi)的生理活動(dòng)和外在行為都表現(xiàn)出其自身的節(jié)律行為[1]。這種生物節(jié)律行為是生物體普遍存在的生命現(xiàn)象，參與多種生命活動(dòng)的調(diào)控，對(duì)幾乎所有生物體中的生化、生理和行為過(guò)程都產(chǎn)生深遠(yuǎn)的影響。最初人們猜想，這種節(jié)律行為是有機(jī)體對(duì)周圍環(huán)境的變化產(chǎn)生的進(jìn)化結(jié)果，但后來(lái)的一系列試驗(yàn)證明當(dāng)無(wú)外界因素存在或一直處于黑暗的狀態(tài)下，生物體內(nèi)的各種活動(dòng)依然具有一定的節(jié)律行為。由此可見，節(jié)律行為是由生物內(nèi)在的生物鐘所控制的[2]。

生物鐘一直是人們研究的焦點(diǎn)之一，它是生命對(duì)地球光照以及溫度等環(huán)境因子周期變化長(zhǎng)期適應(yīng)而演化的內(nèi)在自主計(jì)時(shí)機(jī)制[3]，賦予生命預(yù)測(cè)時(shí)間和環(huán)境變化的能力，以協(xié)調(diào)體內(nèi)的生命過(guò)程如代謝、生理和行為等[4]。生物鐘機(jī)制的研究早在20世紀(jì)60年代就深入到分子水平，隨著生物鐘在自然界各級(jí)生物中存在的事實(shí)相繼被證實(shí)[5]，與生物鐘相關(guān)的基因隨后也相繼被分離鑒定出來(lái)。最早分離鑒定的生物鐘基因是1971年Konopka等[6]用化學(xué)突變劑乙基甲磺酸處理果蠅后，在單突變?nèi)旧w中發(fā)現(xiàn)的。至今已在哺乳動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)了10余個(gè)晝夜節(jié)律鐘基因，分別是Period (Per1、Per2、Per3)、隱花色素(Cry1、Cry2)、Clock (circadian locomoter output cycle kaput)、Bmal1 (brain and muscle ARNT-like-1)、Timeless、NPAS2 (Neuronal PAS domain protein 2)和CK1ε (casein kinase 1 isoform ε)等[7]。其中Timeless基因是一個(gè)非常重要的時(shí)鐘基因，該基因不僅對(duì)各種生物多種活動(dòng)節(jié)律具有協(xié)同進(jìn)化關(guān)系[8]，同時(shí)對(duì)哺乳動(dòng)物胚胎及生長(zhǎng)發(fā)育[9-12]、癌癥發(fā)生發(fā)展和診療[13-15]等方面也發(fā)揮著重要的作用。它在動(dòng)物器官發(fā)生的初期廣泛表達(dá)于大腦、心臟、肝胰腺、肺、胃等器官，如果缺失該基因，則會(huì)引起胚胎致死現(xiàn)象[12,16]。

近些年無(wú)脊椎動(dòng)物中眾多物種，如埃及伊蚊(Aedesaegypti)[17]、雙斑蟋(Gryllusbimaculatus)[18]、家蠶(Bombyxmori)[19]、小灶衣魚(Thermobiadomestica)[20]等的Timeless基因研究被相繼報(bào)道，其中研究最多的是果蠅Timeless基因。此外，人[21-22]及一些模式生物如小鼠(Musmusculus)[11-12,23]、斑馬魚(Daniorerio)[24-25]等的Timeless基因也有較多研究報(bào)道。目前生物鐘基因研究多集中在以下3個(gè)方面：(1)發(fā)現(xiàn)生物鐘新基因和新調(diào)節(jié)機(jī)制；(2)發(fā)現(xiàn)新鐘控基因和鐘控生命過(guò)程；(3)生物鐘在醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用[4]。迄今甲殼類動(dòng)物的Timeless基因研究少見報(bào)道，尤其是對(duì)甲殼動(dòng)物生物鐘基因在其整個(gè)生命過(guò)程中的作用還研究較少。中華絨螯蟹(Eriocheirsinensis)原產(chǎn)于我國(guó)北緯24°以北的中國(guó)黃海海岸水域。其自然分布于我國(guó)黃海、渤海以及東海沿海城市和內(nèi)陸各省的通海河流中，是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)蟹類，其幼體階段包括5個(gè)溞狀幼體時(shí)期和1個(gè)大眼幼體時(shí)期，從大眼幼體期開始進(jìn)入淡水生活，隨后生長(zhǎng)進(jìn)入仔蟹期，經(jīng)多次蛻殼發(fā)育至成蟹[26]。野生的中華絨螯蟹一生有兩次洄游，即索餌洄游和生殖洄游[27]。本研究通過(guò)分析中華絨螯蟹Timeless基因在成蟹、扣蟹(未性成熟)不同性別個(gè)體的不同組織中的基因表達(dá)譜，同時(shí)探究中華絨螯蟹Timeless基因在幼體不同發(fā)育階段的相對(duì)表達(dá)情況，以了解該基因在中華絨螯蟹幼體不同發(fā)育階段和在成蟹、扣蟹雌雄個(gè)體不同組織間的mRNA表達(dá)時(shí)相，以期為進(jìn)一步研究中華絨螯蟹Timeless基因在其洄游過(guò)程中的調(diào)控作用提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

試驗(yàn)用中華絨螯蟹溞狀幼體Ⅰ期、溞狀幼體Ⅱ期、溞狀幼體Ⅲ期、溞狀幼體Ⅳ期、溞狀幼體Ⅴ期、大眼幼體、仔蟹Ⅰ期、仔蟹Ⅱ期、仔蟹Ⅲ期樣品和扣蟹(體質(zhì)量約20 g)、成蟹(體質(zhì)量約100 g)樣品均取自江蘇南通中華絨螯蟹苗種養(yǎng)殖場(chǎng)和江蘇泰州興化中堡中華絨螯蟹養(yǎng)殖場(chǎng)。幼體不同發(fā)育時(shí)期樣本分別取不超過(guò)30 mg置于加有RNA保護(hù)試劑的EP管中，用手術(shù)剪充分剪碎樣品后于-20 ℃保存?zhèn)溆?。扣蟹樣品取回后在?shí)驗(yàn)室養(yǎng)殖間飼養(yǎng)2周，24 h不間斷充氧，室溫維持在約25 ℃；日投喂食物一次，更換水一次；2周后在活潑健康的個(gè)體中隨機(jī)挑選3只雌性蟹和3只雄性蟹，并分別取眼柄、肝胰腺、鰓、胃、肌肉、腸、性腺(卵巢、精巢)和心等8個(gè)組織。成蟹樣品取回后直接解剖，同樣取眼柄、肝胰腺、胃、卵巢、精巢等8個(gè)組織，所有組織均加RNA保護(hù)試劑并剪碎混勻，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 儀器和試劑

三氯甲烷(南京丁貝生物科技有限公司)、RNA提取試劑盒：TransZolTMUP Plus RNA Kit(TransGen Biotech)、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒：PrimescriptTMRT reagent Kit Perfect Real Time (TaKaRa)、熒光分光光度計(jì)(Thermo NanDrop 2000/2000C)、冷凍型離心機(jī)(Eppendorf 5417R)、PCR儀(Applied Biosystems VeritiTMThermal Cycler)、全自動(dòng)數(shù)碼凝膠圖像分析系統(tǒng)(Tanon-3500)，熒光定量PCR儀(ABI Step One PlusTM)。所有引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 總RNA的提取與cDNA的合成

取凍存的幼體中華絨螯蟹以及扣蟹、成蟹8個(gè)組織(眼柄、肝胰腺、鰓、胃、肌肉、腸、性腺、心臟)樣品，經(jīng)勻漿器研磨后參照RNA提取試劑盒(TransGen Biotech)操作說(shuō)明書進(jìn)行總RNA的提取，經(jīng)熒光分光光度計(jì)測(cè)定濃度和純度，同時(shí)用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)各總RNA的完整性。檢測(cè)RNA質(zhì)量可用后，取各組織總RNA量1 μg用于合成cDNA第一鏈，合成后的cDNA用于半定量及熒光定量試驗(yàn)。各組織剩余RNA均于-80 ℃超低溫冰箱存放備用。

cDNA反應(yīng)體系：5× Prime Script RT Master Mix (for Real Time)，4 μL；Easy Dilution (for Real Time PCR)，2 μL；Total RNA(質(zhì)量濃度100 ng/μL)，1 μL；RNease Free deionized H2O，13 μL；總反應(yīng)體積為20 μL。反應(yīng)條件：37 ℃，15 min；85 ℃，5 s。合成的cDNA測(cè)濃度后于-80 ℃超低溫冰箱存放。

1.2.2 引物設(shè)計(jì)和PCR擴(kuò)增反應(yīng)

采用Primer premier 5.0軟件根據(jù)本課題組前期已獲得的中華絨螯蟹轉(zhuǎn)錄組中Timeless基因序列(數(shù)據(jù)暫未發(fā)表)，設(shè)計(jì)半定量試驗(yàn)引物TIM-F/TIM-R以及熒光定量引物qTIM-F/qTIM-R。以中華絨螯蟹的β-actin基因作為內(nèi)參并根據(jù)該基因序列設(shè)計(jì)半定量引物β-actin-F/β-actin-R。熒光定量?jī)?nèi)參引物Qβ-actin-F/Qβ-actin-R引用參考文獻(xiàn)[28]。所有引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物信息見表1。

PCR反應(yīng)體系：cDNA模板0.7 μL，上下游引物(10 μmol/L)各0.4 μL，Mix混合液10 μL，滅菌超純水8.5 μL，總反應(yīng)體積為20 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30個(gè)循環(huán)，然后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。取PCR反應(yīng)產(chǎn)物3 μL經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

表1 中華絨螯蟹Timeless基因半定量和熒光定量表達(dá)分析所用引物

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測(cè)

成蟹和扣蟹時(shí)期組織的Timeless基因表達(dá)量檢測(cè)：根據(jù)設(shè)計(jì)好的引物(表1)對(duì)兩個(gè)時(shí)期樣本的各組織(眼柄、肝胰腺、鰓、胃、肌肉、腸、卵巢/精巢、心臟)中Timeless基因的表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)。本試驗(yàn)樣品和內(nèi)參均設(shè)計(jì)了3次生物學(xué)重復(fù)和3次技術(shù)重復(fù)。熒光定量PCR反應(yīng)體系為20 μL：SYBR?Premix Ex-TaqTMⅡ(2×)，10 μL；上游引物和下游引物(10 μmol/L)，各0.8 μL；ROX Reference DyeⅡ(50×)*3，0.4 μL；cDNA模板(總量約80 ng)，1.0 μL；雙蒸水，7 μL。反應(yīng)程序95 ℃，30 s；然后進(jìn)入40個(gè)循環(huán)：95 ℃，5 s；60 ℃，30 s；最后95 ℃，15 s；60 ℃，1 min；95 ℃，15 s。反應(yīng)結(jié)束后將熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果導(dǎo)出。

幼體不同發(fā)育階段的Timeless基因表達(dá)量檢測(cè)：用同樣的方法和PCR程序檢測(cè)中華絨螯蟹Timeless基因在其9個(gè)不同發(fā)育階段(溞狀幼體Ⅰ期、溞狀幼體Ⅱ期、溞狀幼體Ⅲ期、溞狀幼體Ⅳ期、溞狀幼體Ⅴ期、大眼幼體、仔蟹Ⅰ期、仔蟹Ⅱ期和仔蟹Ⅲ期)的表達(dá)情況。

1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

導(dǎo)出的試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCt方法[29]計(jì)算目的基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量并作圖，成蟹和扣蟹時(shí)期將精巢和卵巢組織中Timeless基因的相對(duì)表達(dá)量設(shè)定為參照，幼體的9個(gè)發(fā)育階段將溞狀幼體Ⅰ期的Timeless基因相對(duì)表達(dá)量設(shè)定為參照。用SPSS 21.0軟件進(jìn)行單因素方差分析和LSD法多重比較，采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，顯著性由t檢驗(yàn)得出，顯著性水平為α=0.05。成蟹和扣蟹的不同組織間及幼體不同時(shí)期間P<0.05表示為基因表達(dá)差異顯著(圖表中用*表示)。

2 結(jié)果與分析

2.1 Timeless基因的半定量試驗(yàn)分析

PCR反應(yīng)結(jié)束后，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，獲得長(zhǎng)度約250 bp的片段，然后回收目的產(chǎn)物，并用引物qTIM-F/qTIM-R對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。結(jié)果驗(yàn)證了該基因的正確性。

2.2 熒光定量試驗(yàn)分析

經(jīng)熒光定量PCR分析，Timeless基因廣泛地表達(dá)于中華絨螯蟹幼體不同的發(fā)育階段以及成蟹、扣蟹的不同組織中。

2.2.1 成蟹、扣蟹不同性別、不同組織間的Timeless基因表達(dá)差異分析

以qTIM-F/qTIM-R為目的基因引物，Qβ-actin-F/Qβ-actin-R為內(nèi)參基因，采用熒光定量PCR技術(shù)檢驗(yàn)中華絨螯蟹Timeless基因在扣蟹和成蟹時(shí)期不同性別的眼柄、肝胰腺、鰓、胃、肌肉、腸、性腺、心臟8種組織間的表達(dá)情況，結(jié)果見圖1、圖2。以性腺(精巢、卵巢)組織的mRNA表達(dá)量為參照，無(wú)論是雌蟹還是雄蟹，在扣蟹時(shí)期，Timeless基因都是在肝胰腺和肌肉組織中的表達(dá)量最高，與其他組織表達(dá)均呈顯著差異(P<0.05)，在眼柄、鰓、胃、腸和性腺的表達(dá)量次之且相對(duì)較為接近，在心臟中的表達(dá)量最低。而在成蟹時(shí)期，Timeless基因僅在肝胰腺中的表達(dá)量最高，與其他各組織表達(dá)均呈差異顯著(P<0.05)。且在該時(shí)期的雄性個(gè)體中，Timeless基因在除肝胰腺外的其他7個(gè)組織中表達(dá)量接近，而雌性的其他7個(gè)組織中表達(dá)量則稍微有些差異，但差異不顯著。

值得注意的是扣蟹時(shí)期不同性別之間的組織表達(dá)無(wú)顯著差異(P>0.05)，而成蟹時(shí)期Timeless基因在不同性別相同組織間的表達(dá)差異顯著：在眼柄組織中，雌蟹Timeless基因表達(dá)量明顯高于雄蟹(P<0.001)；而在肌肉、腸、心臟3個(gè)組織中，雄蟹的Timeless基因表達(dá)量也顯著高于雌性的基因表達(dá)量，雌雄個(gè)體間肌肉組織中Timeless基因表達(dá)存在極顯著差異(P<0.01)，在腸和心臟中表達(dá)呈顯著差異(P<0.05)。

圖1 中華絨螯蟹Timeless基因在雌、雄成蟹不同組織中的mRNA表達(dá)情況1：眼柄；2：肝胰腺；3：鰓；4：胃；5：肌肉；6：腸；7：性腺(卵巢、精巢)；8：心臟.不同小寫和大寫字母分別表示雌蟹和雄蟹中表達(dá)量的差異水平顯著(P<0.05)；內(nèi)參基因：β-actin；n=3；*為P<0.05，**為P<0.01，***為P<0.001.下同.

圖2 中華絨螯蟹Timeless基因在雌、雄扣蟹不同組織中的mRNA表達(dá)情況

2.2.2 Timeless基因在幼體不同發(fā)育階段的表達(dá)差異分析

用同樣的引物和方法對(duì)中華絨螯蟹Timeless基因在幼體9個(gè)發(fā)育時(shí)期的mRNA表達(dá)情況進(jìn)行了檢測(cè)(圖3)。以溞狀幼體Ⅰ期的基因表達(dá)量設(shè)為參照，發(fā)現(xiàn)從溞狀幼體Ⅰ期到溞狀幼體Ⅳ期Timeless基因的表達(dá)量基本呈穩(wěn)步上升趨勢(shì)，但增幅不大，至溞狀幼體Ⅴ期時(shí)表達(dá)量突然激增，達(dá)到了最高值，與其他發(fā)育時(shí)期均呈顯著差異(P<0.05)。然后在大眼幼體時(shí)期的表達(dá)量又急劇下降，達(dá)到最低值，之后在仔蟹時(shí)期的表達(dá)量又呈穩(wěn)步上升趨勢(shì)。

3 討 論

Timeless基因是重要內(nèi)源性的生物鐘基因之一，在生物體內(nèi)周期性表達(dá)，對(duì)生物節(jié)律、細(xì)胞周期、胚胎發(fā)育、癌癥發(fā)生發(fā)展和診療等發(fā)揮著重要的生物學(xué)作用。本研究采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析了中華絨螯蟹Timeless基因在幼體不同發(fā)育階段及在扣蟹、成蟹不同性別個(gè)體不同組織中的表達(dá)情況。

現(xiàn)已證實(shí)，多種外周組織如心、肝、腎、骨骼肌，乃至體外培養(yǎng)的細(xì)胞中均有生物鐘基因的表達(dá)[30-36]。本研究檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，Timeless基因無(wú)論在中華絨螯蟹幼體發(fā)育時(shí)期還是在扣蟹、成蟹不同性別個(gè)體的眼柄、肝胰腺、鰓、胃等8個(gè)不同組織中均有表達(dá)，這與Timeless基因在其他動(dòng)物中的表達(dá)情況類似。

圖3 中華絨螯蟹Timeless基因在幼蟹不同發(fā)育時(shí)期的mRNA表達(dá)情況1：溞狀幼體Ⅰ期；2：溞狀幼體Ⅱ期；3：溞狀幼體Ⅲ期；4：溞狀幼體Ⅳ期；5：溞狀幼體Ⅴ期；6：大眼幼體；7：仔蟹Ⅰ期；8：仔蟹Ⅱ期；9：仔蟹Ⅲ期.

3.1 Timeless基因在成蟹、扣蟹時(shí)期的作用

從酵母到人類，生物鐘和能量代謝都存在著緊密的偶聯(lián)關(guān)系[37]，在本研究中發(fā)現(xiàn)，在扣蟹時(shí)期無(wú)論是雌性個(gè)體還是雄性個(gè)體，Timeless基因在肝胰腺組織和肌肉組織中的表達(dá)量均較高，在其他幾個(gè)組織中表達(dá)量較低，到成蟹時(shí)期Timeless基因主要在肝胰腺大量表達(dá)。眾所周知，肝胰腺是十足目甲殼類動(dòng)物脂類儲(chǔ)存和脂類加工的主要器官[38-40]，其脂質(zhì)含量高，脂類新陳代謝十分旺盛，是能量提供和代謝的中心，對(duì)甲殼動(dòng)物的生長(zhǎng)和發(fā)育以及生殖都有著重要的作用，而Timeless基因在肝胰腺組織中高量表達(dá)表明該生物鐘基因在中華絨螯蟹新陳代謝過(guò)程中起著十分重要的作用，也表明其參與了中華絨螯蟹的生長(zhǎng)和發(fā)育。中華絨螯蟹的扣蟹至成蟹時(shí)期是生殖洄游的關(guān)鍵階段，大眼幼體以及尚未性成熟的幼蟹溯河上遷，幼蟹一面上遷，一面不斷地覓食、生長(zhǎng)和發(fā)育；幼蟹中一部分侵入江河的支流、溝渠以及湖泊等較淺的水域里生活，另一部分則分散到江河的沿岸帶，并繼續(xù)上遷，一直可持續(xù)到夏季[27]，這需要強(qiáng)有力的肌肉和能量支持。幼蟹在上遷過(guò)程中經(jīng)多次脫皮才完全變?yōu)槌尚返男螤畈⑦_(dá)到成熟，一般到第二、三年成熟，再洄游到河口交配產(chǎn)卵，產(chǎn)卵后的親蟹即老死在海中[41]，幼體的上遷完全受其自身新陳代謝的調(diào)控。中華絨螯蟹洄游過(guò)程中肌肉收縮、生殖腺生長(zhǎng)合成新的物質(zhì)等需要不斷地消耗大量能量，例如上遷過(guò)程中，幼蟹要適應(yīng)滲透環(huán)境變化而消耗能量，幼蟹逆流而上爬越閘、壩、堤以及魚柵等多種障礙亦需消耗大量能量。Timeless基因在肝胰腺和肌肉組織中的高量表達(dá)說(shuō)明該時(shí)鐘基因在中華絨螯蟹生殖洄游過(guò)程中對(duì)其運(yùn)動(dòng)的調(diào)控起重要作用。另外肌肉與肝胰腺組織一樣是重要的儲(chǔ)能組織，該基因在這兩個(gè)組織的高量表達(dá)也與這兩個(gè)組織的理化性質(zhì)特性相一致。中華絨螯蟹成蟹性成熟后可借助水流，順流而下，赴河口淺海交配生殖[27]，這時(shí)期其肌肉受到的選擇壓力大大減少，賈小燕[42]的研究表明，中華絨螯蟹雌性親蟹在生殖洄游過(guò)程中主要以脂肪作為供能物質(zhì)，本研究中發(fā)現(xiàn)中華絨螯蟹Timeless基因在成蟹肝胰腺組織中的表達(dá)量極顯著高于在其他組織的表達(dá)量也進(jìn)一步表明Timeless基因在肝胰腺供能過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

3.2 Timeless基因在中華絨螯蟹幼體發(fā)育時(shí)期的作用

中華絨螯蟹從胚胎開始至溞狀幼體期都生活在咸淡水中(鹽度約20)，然后在溞狀幼體后期至大眼幼體，幼蟹會(huì)從生活鹽度較高的海水逐漸調(diào)節(jié)至淡水環(huán)境生活，在此過(guò)程中中華絨螯蟹幼體會(huì)經(jīng)過(guò)變態(tài)發(fā)育不斷蛻皮生長(zhǎng)，在大眼幼體期經(jīng)歷滲透壓生理適應(yīng)，并逐漸適應(yīng)淡水生活。本研究中發(fā)現(xiàn)中華絨螯蟹Timeless基因在幼體9個(gè)發(fā)育時(shí)期均有表達(dá)，且該基因在溞狀幼體前4個(gè)時(shí)期的表達(dá)量相近并呈穩(wěn)步上升趨勢(shì)，這些發(fā)育時(shí)期間的Timeless基因表達(dá)差異顯著，其在溞狀幼體Ⅴ期mRNA表達(dá)激增，但在大眼幼體期表達(dá)又顯著下降，然后其在仔蟹時(shí)期的表達(dá)又呈穩(wěn)步上升趨勢(shì)。已有研究表明哺乳動(dòng)物Timeless基因與其生長(zhǎng)發(fā)育和細(xì)胞發(fā)育周期有關(guān)[9-12,43-44]。其中Xiao等[9]的研究表明，在哺乳動(dòng)物胚胎發(fā)育時(shí)期，Timeless基因的功能高度保守，在器官發(fā)生的初期，該基因廣泛表達(dá)于大腦、肺、心臟、肝、胃和尿生殖嵴等器官，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)Timeless表達(dá)水平的動(dòng)態(tài)變化對(duì)肺的發(fā)育是至關(guān)重要的。Li等[10]研究表明，Timeless基因在小鼠上皮形成、腎發(fā)生和其他上皮器官形成中有重要作用。而Liu等[45]在黑腹果蠅中的研究結(jié)果表明，Timeless基因?qū)υ诠壍纳L(zhǎng)調(diào)控也起重要的作用，消除該基因?qū)?huì)引起總睡眠的減少及中斷，從而進(jìn)一步影響果蠅的生長(zhǎng)發(fā)育，以及繁殖和存活能力等。這些試驗(yàn)與本研究都表明Timeless基因在不同物種的幼體發(fā)育時(shí)期具有重要的生理調(diào)控性。

3.3 小結(jié)

總之，越來(lái)越多試驗(yàn)證據(jù)表明生物鐘系統(tǒng)在各種生命基本過(guò)程起到不可或缺的調(diào)節(jié)作用，其系統(tǒng)中的關(guān)鍵基因Timeless尤為重要。在本研究中，中華絨螯蟹Timeless基因在不同發(fā)育階段以及性成熟的扣蟹、成蟹不同組織間的這種獨(dú)特表達(dá)模式，初步表明該基因參與了中華絨螯蟹的幼體生長(zhǎng)發(fā)育和細(xì)胞發(fā)育及生理適應(yīng)調(diào)控，具體的作用還需要進(jìn)一步研究驗(yàn)證。

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