卓 鋒 孟 振 常 輝 婁彥華 魏開斌

(1.泰山醫(yī)學(xué)院附屬泰山醫(yī)院骨科診療部，山東 泰安 271000； 2.新汶礦物集團中心醫(yī)院，山東 新泰 271200)

脊髓損傷后神經(jīng)再生和功能康復(fù)是目前困擾醫(yī)學(xué)界的世界難題，其中干細胞移植是目前治療脊髓損傷的研究熱點[1]。人臍帶間充質(zhì)干細胞(human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells,HUC-MSCs)具有生長速度快、免疫原性低、移植后存活時間長等特性，具有廣闊的應(yīng)用前景[2-3]。本研究擬通過靜脈途徑移植 HUC-MSCs觀察其能否經(jīng)血液到達脊髓損傷的局部，觀察療效并探討其神經(jīng)修復(fù)的機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物及主要試劑、儀器

Wistar大鼠60只(清潔級8周齡)，體重200～220 g，雌雄不限，山東濟寧魯抗醫(yī)藥公司實驗動物中心提供。超凈工作臺和Impactor Model Ⅱ打擊器(蘇州凈化設(shè)備廠)；FBS 、胰蛋白酶、DMEM培養(yǎng)基(GIBCO 公司，美國)；流式抗體包括CD34、CD29、CD44、CD90、CD105、HLA-DR(BD Pharmingen 公司，美國)；小鼠抗5-溴脫氧尿嘧啶核苷(5-bromodeoxyuridine，Brdu)單克隆抗體(Millipore, USA)，5-溴脫氧尿嘧啶核苷(5-bromodeoxyuridine,Brdu.invitrogen,USA)，兔抗膠質(zhì)酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)多克隆抗體(Sigma 公司，美國)，兔抗神經(jīng)原特異性烯醇化酶(neuron-specific enolase，NSE)多克隆抗體(Sigma 公司，美國)，TRITC標記的山羊抗兔IgG抗體(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，F(xiàn)ITC標記的山羊抗小鼠IgG抗體(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。

1.2HUC-MSCs的分離、培養(yǎng)與傳代

取產(chǎn)婦新鮮臍帶(足月順產(chǎn)、健康)，用0.9%氯化鈉(自配1∶1000的青霉素和鏈霉素)沖洗臍帶表面血跡，剔除臍動靜脈，將剩余組織即華通膠剪成1 mm×1 mm×1 mm大小的組織塊，接種在24孔培養(yǎng)板，放置37 ℃溫箱，1.5 h后添加DMEM培養(yǎng)液(包含1∶100青霉素和鏈霉素)，培養(yǎng)板置于37 ℃、5%CO2飽和濕度的孵箱內(nèi)培養(yǎng)。9 d左右全量換液，12～15 d開始傳代培養(yǎng)，每3天傳1代。倒置相差顯微鏡下觀察細胞生長情況。

1.3HUC-MSCs的鑒定及標記

取培養(yǎng)的第3代及第5代細胞，吸取表面的培養(yǎng)液，PBS洗2次，然后用0.3%胰蛋白酶消化，再次用PBS洗滌后制成濃度為3.0×106個/ml的單細胞懸液，分別加入CD34-PE、 CD29-FITC、CD44-PE、CD90-PE、CD105-FITC、HLA-DR-FITC單抗各10 μl，4 ℃孵育30 min，流式細胞儀開始檢測。用PBS代替一抗作為陰性對照。另取部分第5代細胞，當達到50%融合時加入終濃度為10 μg/ml的BrdU，37 ℃、5%CO2飽和濕度的孵箱避光孵育3 d，用0.125%胰蛋白酶-EDTA消化配制細胞懸液以備用。

1.4脊髓損傷動物模型的制備及分組

取Wistar大鼠60只，麻醉成功后備皮、消毒，以T10椎體棘突為中心，切開并剝離兩側(cè)椎旁肌，咬除T10棘突及椎板，暴露部分硬脊膜后應(yīng)用Impactor Model Ⅱ打擊器打擊，大鼠出現(xiàn)一過性的后肢痙攣及尾巴擺動提示造模成功，給予依次縫合。術(shù)后人工排尿、排便等常規(guī)護理，注意保溫，定期消毒房間。將造模成功的大鼠隨機分為3組，每組20只。A組為細胞靜脈移植組，B組為DMEM靜脈移植組，C組為空白對照組。A組1周后經(jīng)大鼠尾靜脈緩慢推注1×106的HUC-MSCs懸液200 μl；B組同A組方法推注DMEM 200 μl；C組造模后未作其他處理，作為空白對照組。

1.5觀測指標

1.5.1大鼠后肢運動功能評價 分別在每組移植后的第1 d及1周、2周、3周、4周、6周、8周、10周、12周隨機取2只大鼠，利用BBB評分法，觀察5 min來評價大鼠后肢運動的功能恢復(fù)情況。

1.5.2組織學(xué)觀察 分別在每組移植后第3周、8周、12周隨機取2只大鼠，麻醉成功后，灌注生理鹽水和40 g/L中性多聚甲醛。成功取出大鼠1.5 cm的脊髓標本，標記頭尾端及損傷的中心位置，40 g/L中性多聚甲醛固定24 h后脫水并石蠟包埋制成標本。其中一半標本行石蠟縱切片，HE染色觀察損傷區(qū)空洞形成和周圍細胞增生情況。另一半標本連續(xù)石蠟橫切片，每組每個標本取6張切片行免疫組織化學(xué)染色觀察。分別添加一抗：小鼠抗BrdU 抗體和兔抗膠質(zhì)酸性蛋白多克隆抗體)或兔抗神經(jīng)原特異性烯醇化酶多克隆抗體；二抗：TRITC標記的山羊抗兔IgG抗體，F(xiàn)ITC標記的山羊抗小鼠IgG抗體，然后4’6-二脒基-2-苯基吲哚(4’,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)復(fù)染細胞核，設(shè)立PBS替代的陰性對照。熒光倒置顯微鏡觀察BrdU標記細胞的存活、分化以及損傷區(qū)星形膠質(zhì)細胞的增生情況。

1.6統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS18.0統(tǒng)計軟件進行分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法；檢驗水準α=0.05。

2 結(jié) 果

2.1HUC-MSCs形態(tài)學(xué)觀察及鑒定

倒置顯微鏡下觀察組織塊培養(yǎng)5～6 d后可見少量細胞，形態(tài)較??；10 d左右可見大多數(shù)組織塊周圍長出大量細胞，多為長梭形、紡錘形(圖1a)；12～15 d時細胞顯著增多，形態(tài)細瘦，類似成纖維樣細胞，呈放射狀或漩渦狀分布。傳代培養(yǎng)的第5代細胞大小均一、形態(tài)規(guī)則，與原代細胞大體一致(圖1b)。流式細胞儀檢測第3、5代細胞顯示，表面標志CD34、HLA-DR呈陰性表達，表面標志CD29、CD44、CD90、CD105呈陽性表達。

a：原代細胞培養(yǎng)10 d；b:第5代細胞培養(yǎng)2 d

2.2大鼠后肢運動功能評價

造模前大鼠雙后肢BBB評分均為21分；造模后均呈現(xiàn)雙后肢癱瘓狀態(tài)，術(shù)后1 d BBB評分0～1分，各組BBB評分隨時間逐漸上升。術(shù)后第3周，A組BBB評分均高于B、C組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；B、C組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組大鼠術(shù)后各時間點雙后肢BBB評分

注：*與A組比較，P<0.05；#與B組比較，P<0.05。

2.3組織學(xué)觀察

2.3.1HE染色 術(shù)后3周、8周、12周，A、B、C組標本染色后見局部結(jié)構(gòu)紊亂，灰質(zhì)區(qū)域大量膠質(zhì)瘢痕增生；神經(jīng)纖維排列紊亂，細胞方向無序，神經(jīng)元包體萎縮，部分組織液化形成空洞。放大相同倍數(shù)下的12周標本，可見A組瘢痕及空洞較其他兩組減少。見圖2。

2.3.2免疫熒光組織化學(xué)染色 第3周，A組在損傷局部可見BrdU標記的hUC-MSCs，標記細胞主要集中在損傷的中心及脊髓的背側(cè)。第8周可見BrdU標記的hUC-MSCs大部分集中在損傷脊髓實質(zhì)周圍。第3周、8周、12周，B、C組均未見BrdU標記的hUCMSCs。免疫組織化學(xué)染色A組各時間點均未觀察到NSE、GFAP染色陽性細胞，即未見到hUC-MSCs向神經(jīng)細胞或神經(jīng)膠質(zhì)細胞方向分化。見圖3。

第3周時A組可見損傷區(qū)周圍星形膠質(zhì)細胞大量增生；8周時星形膠質(zhì)細胞數(shù)量減少；12周時可見脊髓損傷局部星形膠質(zhì)細胞減少，并且形成膠質(zhì)瘢痕，A組形成的膠質(zhì)癱痕面積較B組、C組減少。見圖4。

圖2 術(shù)后12周各組HE染色觀察(倒置顯微鏡×100)

a：A組細胞BrdU標記陽性(熒光顯微鏡×100)；b:B組細胞BrdU標記陰性(熒光顯微鏡×100)；c：A組NSE染色陰性(熒光顯微鏡×200)；d:A組GFAP染色陰性(熒光顯微鏡×400)

圖3 術(shù)后3周各組免疫組織化學(xué)染色觀察

圖4 術(shù)后12周各組脊髓損傷區(qū)周圍星形膠質(zhì)細胞增生情況觀察(熒光顯微鏡×200)

3 討 論

hUC-MSCs來源充足，易于擴增，自我更新強、分化潛能高，具有廣闊的應(yīng)用前景[3]。本實驗采用組織塊培養(yǎng)法，簡便易行，培養(yǎng)了大量大小均一、形態(tài)規(guī)則的成纖維樣細胞，經(jīng)流式細胞儀鑒定表明，第3代和第5代細胞表達一致，陽性表達CD29、CD73、CD90、CD105，而CD14、CD19、CD34、CD45、HLA-DR呈陰性，鑒定結(jié)果與MSCs特定的表面抗原一致。細胞移植治療脊髓損傷取得部分療效，機體的免疫排斥反應(yīng)是一個重要問題。本實驗未使用任何免疫抑制劑，將細胞懸液注射入大鼠體內(nèi)未發(fā)現(xiàn)明顯免疫排斥反應(yīng)。流式細胞儀檢測結(jié)果表明，hUC-MSCs的HLA-DR呈陰性，也說明了細胞免疫原性低的特點。學(xué)者Lin等[4]研究將hUC-MSCs誘導(dǎo)的神經(jīng)細胞，移植至大鼠體內(nèi)，未發(fā)現(xiàn)明顯排斥反應(yīng)。 目前細胞移植方法很多，如局部移植、腹腔移植、蛛網(wǎng)膜下腔移植和靜脈移植等。局部移植、腹腔移植以及蛛網(wǎng)膜下腔移植可能會產(chǎn)生附加風險，靜脈移植具有簡便易行、創(chuàng)傷小、可重復(fù)性強等優(yōu)點。目前對于MSCs移植的細胞數(shù)目尚無統(tǒng)一定論，靜脈移植細胞多了易導(dǎo)致靜脈的栓塞，太少達不到治療效果。本實驗將濃度為1×106細胞移植，A組的BBB評分從術(shù)后3周開始顯著高于B、C組，術(shù)后12周，HE染色表明脊髓空洞減小，免疫熒光顯示膠質(zhì)癱痕面積減少，說明hUC-MSCs能夠抑制空洞的形成和膠質(zhì)瘢痕的增生，從而促進大鼠脊髓損傷神經(jīng)功能的恢復(fù)。靜脈移植細胞治療脊髓損傷，需要通過血-脊髓屏障，向損傷的脊髓部位發(fā)生定向遷移。血-腦屏障或血-脊髓屏障為了維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定性，從而阻止外來毒素進入腦(脊髓)內(nèi)。脊髓損傷后暫時性破壞了血-脊髓屏障，在急性炎性期后至膠質(zhì)瘢痕形成前，形成一短暫的移植時間窗[5-7]。學(xué)者Maikos等[8]發(fā)現(xiàn)時間窗是1周左右。本試驗也是術(shù)后1周移植hUC-MSCs，結(jié)果表明細胞經(jīng)靜脈移植能夠透過血-脊髓屏障，到達脊髓損傷區(qū)域。研究認為，MSCs經(jīng)靜脈移植后能透過血-脊髓屏障發(fā)生定向遷移機制為[9-12]：①在脊髓損傷的急性期脊髓缺血、缺氧，會導(dǎo)致血-脊髓屏障固有結(jié)構(gòu)破壞，大量釋放炎性細胞因子和血管活性物質(zhì)，在一定短時間內(nèi)大大增加血-脊髓屏障的通透性；②血-腦屏障或血-脊髓屏障存在固有的薄弱環(huán)節(jié)，例如垂體、脈絡(luò)叢、松果體、腦室邊緣等；③脊髓損傷后炎性因子刺激血管內(nèi)皮細胞，MSCs表達的黏附分子和細胞黏附分子之間相互作用，從而特異性結(jié)合MSCs和血管內(nèi)皮細胞、基膜；④脊髓損傷后局部分泌一些能夠和MSCs表面的受體、抗體相結(jié)合的炎性細胞因子，發(fā)生一系列炎性反應(yīng)，從而對MSCs產(chǎn)生趨化作用。本實驗表明，經(jīng)靜脈移植的細胞能夠通過血-脊髓屏障，并且在損傷部位存活并發(fā)揮神經(jīng)修復(fù)功能。

總之，本研究為hUC-MSCs移植治療脊髓損傷提供了一種新的移植方法，為臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。但靜脈移植的細胞數(shù)量、數(shù)量與療效有無累積效果，以及移植后對其他臟器的影響等問題需進一步探索和研究。

[1] Parekkadan B,Milwid JM.Mesenchymal stem cells as therapeutics[J].Annu Rev Biomed Eeg,2010,12:87-117.

[2] Koh S,Kim N,Yin HH,et al.Human umbilical tissue-derived cells promote synapse formation and neurite outgrowth via thrombospondin family proteins[J].J Neurosci,2015,35:15649-15665.

[3] Jones E，Yang x. Mesenchymal stem cells and bone regeneration:current status[J].Injury，2011，42(6):562-568.

[4] Lin YC， Ko TL， Shih YH， et al. Human umbilical mesenchymal stem cells promote recovery after ischemic stroke [J] . Stroke，2011， 42(7) : 2045-2053.

[5] Takeuchi H， Natsume A， Wakabayashi T， et al. Intravenously transplanted human neural stem cells migrate to the injured spinal cord in adult mice in an SDF-1- and HGF-dependent manner[J]. Neurosci Lett，2007，426 (2):69-74.

[6] Keirstead HS， Nistor G， Bernal G， et al. Human embryonic stem cell-derived oligodendrocyte progenitor cell transplants remyelinate and restore locomotion after spinal cord injury[J]. JNeurosci，2005，25(19):4694-4705.

[7] Okano H， Ogawa Y， Nakamura M， et al. Transplantation of neural stem cells into the spinal cord after injury[J].Semin Cell Dev Biol，2003，14(3):191-198.

[8] Maikos JT， Shreiber DI. Immediate damage to the blood-spinal cord barrier due to mechanical trauma[J].J Neurotrauma，2007，24(3): 492-507.

[9] Blanc K， Immunomodulatory effects of fetal and adult mesenchymal stem cells[J].CytothaPy，2003，5(6):485-589.

[10] Zhang W D， Smith C， Howlett C， et al.Inflammatory activation of human brain endothelial eells by hyPoxic in vitro is mediated by IL-l[J]. Cereb Blood Flow Metab， 2000， 20(6):967-978.

[11] KoPen GC， prockop DJ， PhirmeyDG. Marrow stromal cells migrate throughout forebrain and cerebellum，and they differentiate into astrocytes after injection into neonatal mouse brainst[J]. Proc Natl Acad Sci USA， 1999， 96(19):10711-10716.

[12] Ji JF， He BP， Dheen ST， et al. Interactions of chemokines and chemokine receptors mediate the migration of mesenehymal stem cells to the impaired site in the brain after hypoglossal nerve injury[J]. Stem Cells，2004，22(3):415-427.