梁楚欣，于榮敏，朱建華

（暨南大學藥學院，廣東 廣州 510632）

長春花[Catharanthus roseus(L.) Don]為夾竹桃科長春花屬多年生藥用植物。迄今已從長春花中分離得到生物堿達130余種，大多數(shù)為萜類吲哚生物堿（terpenoid indole alkaloid，TIA）[1]。部分TIA具有明顯的生物活性并廣泛地應用于各種疾病的治療，如長春堿（vinblastine）和長春新堿（vincristine）廣泛應用于何杰金氏病、惡性淋巴腫瘤、急性淋巴細胞性白血病等疾病的治療[2]。該類抗腫瘤藥物主要從長春花葉中提取分離獲得[3]。然而，這些化合物在植物中含量極微，且化學合成和半合成成本太高，如何提高長春花中TIA產(chǎn)量成為國內(nèi)外學者研究的重點[4]。

在植物科學中，誘導子（elicitor）是指在植物抗病生理過程中誘發(fā)植物產(chǎn)生植物抗毒素和引起植物過敏反應（hypersensitive reaction，HR）或自身防御反應（self-defense reaction）的因子[5]。誘導子可來源于植物、真菌、細菌等多種生物，根據(jù)其來源可分為生物誘導子（biotic elicitor）和非生物誘導子（abiotic elicitor），生物誘導子主要包括植物細胞成分及病原菌即細菌、真菌與病毒，而非生物誘導子則包括能起誘導作用的金屬離子和無機物[6-8]。

近年，越來越多的研究表明真菌誘導子（fungal elicitor）在調(diào)控生物次生代謝途徑及細胞內(nèi)信息傳導等方面有重要作用。在提高藥用植物次生代謝產(chǎn)物產(chǎn)量的研究中，用真菌誘導子處理植物細胞培養(yǎng)體系已成為快速提高植物細胞培養(yǎng)物中目標產(chǎn)物產(chǎn)量的有效方法之一[7,9]。本文主要涉及真菌誘導子的簡介，以及真菌誘導子在長春花培養(yǎng)體系中的研究進展

1 真菌誘導子的發(fā)現(xiàn)與概述

1968年，Cruickshank等[10]從叢梗孢科鏈核盤屬鏈合盤菌Monilinia fructicola的菌絲體中分離得到一種多肽——鏈核盤素A（monilicolin A），并將其加入菜豆細胞培養(yǎng)基，發(fā)現(xiàn)monilicolin A能誘導菜豆果皮的形成和菜豆素（phaseollin）的積累。Monilicolin A作為首個被報道的真菌誘導子，使得真菌作為一種新型誘導子在植物與真菌相互作用的病理學機制及提高藥用植物次生代謝物產(chǎn)量等研究領域中受到了廣泛關注。

真菌誘導子是來源于真菌的一類活性物質(zhì)，能快速、專一地誘導植物特定基因的表達，從而活化特定次生代謝途徑，使目的次生代謝產(chǎn)物的積累量增加[9]。值得注意的是，用于制備誘導子的真菌，既可以是植物致病性的或內(nèi)源性的，也可以是與植物完全無關的真菌。真菌誘導子的組分主要包括真菌的菌絲體、菌絲體降解產(chǎn)物、真菌分泌物等，而化學成分一般為多糖、寡糖、多肽和蛋白質(zhì)等[11]。上述化學成分與信號分子的傳導過程密切相關。現(xiàn)有研究結果表明，真菌誘導子首先與細胞膜表面受體結合并被植物細胞識別，然后通過各種信號傳導途徑使植物基因的表達發(fā)生變化，從而使植物次生代謝產(chǎn)物生物合成途徑中相關酶的活性受到調(diào)節(jié)，最終引起植物細胞產(chǎn)生防御反應并促進特定次生代謝產(chǎn)物的生成和積累[12]。

目前，該類誘導子主要應用于植物和微生物細胞產(chǎn)生次生代謝產(chǎn)物兩個方面，在提高藥用植物培養(yǎng)物中天然產(chǎn)物的產(chǎn)率方面取得較為明顯的進展。在藥用植物培養(yǎng)中，人們利用不同的真菌誘導子實現(xiàn)了萜類、生物堿類、皂苷類、黃酮類及多酚類等多種化合物的誘導合成及產(chǎn)量提高[4,7,12-14]。真菌誘導子雖能很好地調(diào)控次生代謝物的產(chǎn)量，但其誘導效果因真菌種類、誘導子組分、劑量、加入時間及植物細胞培養(yǎng)物的種類等因素的不同而有所差異[15-17]。

2 真菌誘導子在長春花培養(yǎng)體系中的應用現(xiàn)狀

2.1 利用真菌誘導子提高次生代謝物的產(chǎn)量

長春花中多數(shù)吲哚類生物堿具有重要的生物活性，但這些有效成分的含量較低，且化學合成和半合成成本昂貴。因此，人們開始致力于提高長春花中生物堿的含量。而真菌誘導子以其獨有的優(yōu)勢，成為提高長春花中TIA含量的其中一種重要手段[18-19]。

Zhao等[20-21]利用真菌誘導子與化學試劑聯(lián)合處理長春花懸浮細胞的方法，先后提高了細胞中阿嗎堿（ajmalicine）和長春質(zhì)堿（catharanthine）的產(chǎn)量。隨后，Namdeo等[22]證實黑曲霉（Aspergillus niger）、串珠鐮孢（Fusarium moniliforme）和綠色木霉（Trichoderma viride）真菌誘導子能有效地提高長春花懸浮細胞中阿嗎堿的產(chǎn)量，且阿嗎堿的產(chǎn)量與誘導子的劑量呈一定相關性。石岳香等[23]將鐮刀菌屬內(nèi)生真菌F9作用于長春花懸浮細胞培養(yǎng)體系后，發(fā)現(xiàn)該真菌及其誘導子能影響長春花懸浮細胞的生長率，導致細胞代謝結構發(fā)生改變，并使生物堿的產(chǎn)量得以提高。

然而，真菌誘導子對長春花生物堿合成的誘導效果不僅與真菌的種類、誘導子的劑量有關，還與誘導時間長短以及植物細胞培養(yǎng)物的種類等多種因素相關。這促使國內(nèi)外學者加深了在這些方面的研究。用來自12種不同真菌的誘導子對長春花懸浮細胞進行誘導實驗后，Zhao等[16]發(fā)現(xiàn)10 mg/L稻曲霉（Ustilaginodia verens）誘導子和20 mg/L黑曲霉（Aspergillum niger）誘導子的誘導效果最好；誘導子的處理時間以2～4 d為宜，時間太短則效果不明顯，時間過長則會抑制生物堿合成并造成細胞死亡。張向飛等[24]則用分別來源于鐮刀菌（Fusarium solani）和Aspergillum niger的真菌誘導子，對長春花愈傷組織進行誘導處理。他們發(fā)現(xiàn)，上述兩種真菌誘導子對吲哚總堿及阿嗎堿和長春質(zhì)堿的積累均有明顯的正向調(diào)節(jié)作用，并確立了真菌誘導子的最佳處理時間。

除上述研究以外，還有Shukla等[3]用瓜果腐霉（Pythium aphanidermatum）勻漿分別對長春花試管苗、愈傷組織和懸浮細胞進行誘導，并設定誘導持續(xù)時間為8 h、16 h和24 h，誘導后測定細胞內(nèi)生物堿的含量及SGD和DAT基因的表達情況。結果顯示，P. aphanidermatum勻漿不僅能使長春花試管苗、愈傷組織和懸浮細胞中總生物堿的含量日益增加，還能使SGD和DAT基因的表達上調(diào)。此外，在長春花試管苗和愈傷組織中，該真菌誘導子還能誘導長春質(zhì)堿和文多靈（vindoline）的合成與積累。Tonk等[15]用不同濃度的黃曲霉（Aspergillus flavus）誘導子處理胚性長春花愈傷組織，并對愈傷組織生長率、植胚及植株再生率及生物堿（長春新堿和長春堿）含量進行了檢測。結果表明，低劑量的真菌誘導子既能有效地提高愈傷組織生長率、植胚數(shù)、萌芽率及長春花植胚中的生物堿含量，也能增加胚苗和胚根的長度。進一步檢測抗氧化物酶活性發(fā)現(xiàn)，經(jīng)誘導子處理后，初生和成熟的長春花植胚中超氧化物歧化酶（SOD）活性明顯升高；由此可認為低劑量的A. flavus誘導子使長春花的晚期植胚產(chǎn)生過敏反應，從而導致生物堿的含量有所提升。

在研究真菌誘導子對長春花TIA產(chǎn)量影響的同時，人們也對長春花的其他次生代謝物進行深入研究。Frankmann和Kauss[25]發(fā)現(xiàn)在P. aphanidermatum真菌誘導子的誘導下，阿嗎堿的含量在誘導初期有所提高，并且長春花懸浮細胞中會積累2, 3-二羥基苯甲酸 （2,3-dihydroxy benzoic acid，DHBA）。與此同時，Moreno等[26]用P. aphanidermatum真菌誘導子處理長春花懸浮細胞和幼苗后也發(fā)現(xiàn)，無論在長春花懸浮細胞還是在長春花幼苗中，都會有DHBA在細胞內(nèi)大量累積；而且，DHBA的積累量與異分支酸合酶（isochorismate synthase，ICS）的誘出量呈正相關。幾年后，Muljono等[27]繼續(xù)利用P. aphanidermatum誘導子研究長春花懸浮細胞中產(chǎn)生的DHBA是否來自水楊酸（salicylic acid，SA）。結果顯示，雖然SA不太可能是DHBA的直接前體物質(zhì)，但它很可能在DHBA生物合成途徑中起著調(diào)控作用。

2.2 真菌誘導子的作用機制

除了研究如何提高長春花中特定生物堿含量，人們還利用真菌誘導子來進行誘導機制方面的研究。

上世紀八九十年代，Eilert等[28]用P.aphanidermatum誘導子處理長春花懸浮細胞，發(fā)現(xiàn)色氨酸脫羧酶（tryptophan decarboxylase，TDC） 和異胡豆苷合酶（strictosidine synthase，SS）的酶活力被瞬間激發(fā)；Roewer等[29]進一步研究發(fā)現(xiàn)，酶活力被瞬間激發(fā)是因為P. aphanidermatum誘導子導致了上述兩種酶基因的瞬時表達。后來，在利用聯(lián)合誘導法提高長春花懸浮細胞次生代謝產(chǎn)物產(chǎn)量的同時，Zhao等[30]還通過黑曲霉誘導子，發(fā)現(xiàn)在懸浮細胞中真菌誘導子對吲哚生物堿生物合成的誘發(fā)作用與Ca2+內(nèi)流及氧化爆發(fā)（oxidative burst）密切相關。Xu和Dong[17]利用分離自真菌橘青霉（Penicillium citrinum）細胞壁的誘導子及NO特異清除劑 1,3-PBITU二氫溴酸鹽（S,S’-1,3-phenylenebis(1,2-ethanediyl) -bis-isothiourea，PBITU）處理長春花懸浮細胞。研究結果說明，真菌誘導子能誘導長春花懸浮細胞中的一氧化氮合成酶（nitric oxide synthase，NOS）和一氧化氮合成樣酶（NOS-like enzyme）合成NO，而細胞中NO的存在則是誘導長春質(zhì)堿合成的關鍵。與此同時，他們還利用黑曲霉細胞壁誘導子處理長春花懸浮細胞，闡述了從氧化反應中間產(chǎn)物（reactive oxygen intermediate，ROI）的產(chǎn)生到苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonialyase，PAL）的激活，及導致長春質(zhì)堿合成的一系列信號傳導過程。值得注意的是，觸發(fā)后續(xù)信號傳導過程的ROI是O2-而不是H2O2[31]。

隨后，Tang等[32]從長春花中分離出屬尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporumSchlecht）的內(nèi)生真菌F9，并作用于長春花懸浮細胞培養(yǎng)體系，證實在真菌誘導子的作用下，懸浮細胞迅速作出應答，某些與清除自由基過程相關的信號傳導通路被激活，某些特定的次生代謝途徑被打開或增強。且經(jīng)內(nèi)生真菌誘導子處理后，長春花懸浮細胞中PAL和TDC的活性及生物堿的含量獲得顯著提高。

為闡明真菌誘導子調(diào)控藥用植物活性成分生物合成的作用機制，Chen等[33]將分離自真菌苧麻疫霉（Phytophthora boehmeriae）的蛋白PB90作為真菌誘導子。該研究發(fā)現(xiàn)，用PB90處理長春花懸浮細胞后，細胞中脫落酸（ABA）和NO含量迅速增加，而細胞中的兩個重要的長春質(zhì)堿生物合成基因Str和Tdc的表達也隨之受到促進，長春質(zhì)堿的含量增至20 mg/L即原來的4倍；分別用ABA抑制劑和NO清除劑處理經(jīng)真菌誘導子誘導的長春花懸浮細胞時，Str和Tdc的表達及長春質(zhì)堿的生物合成卻受到抑制。由此可見ABA和NO在誘導子誘導的長春質(zhì)堿生物合成中起著至關重要的作用。進一步研究表明，在由PB90誘發(fā)的信號傳導級聯(lián)反應中，ABA在NO的上游發(fā)揮作用。

其后，人們進一步在基因水平上對真菌誘導子的調(diào)控作用進行解釋。Pandey等[4]發(fā)現(xiàn)分離自長春花葉片的內(nèi)生真菌Curvularia sp. CATDLF5和Choanephora infundibuliferaCATDLF6對長春花的初級代謝不產(chǎn)生影響，但能使長春花植株中文多靈的含量增加約2～4倍。qPCR結果顯示，經(jīng)上述內(nèi)生誘導子處理后，長春花TIA途徑中關鍵酶基因G10H、TDC、STR、16OMT、D4H、DAT、PRX1及轉錄激活因子基因ORCA3的表達均有所上調(diào)，而轉錄抑制因子基因ZCT的表達卻受到抑制；根據(jù)qPCR結果推斷，長春花植株中文多靈的含量增加，是因為內(nèi)生真菌誘導子可特異地調(diào)控文多靈生物合成途徑中關鍵基因的表達。

3 結語和展望

生物堿是存在于藥用植物中的一類含氮雜環(huán)化合物，在疾病治療中發(fā)揮重要作用。然而，來源于長春花的生物堿含量往往很低，且長春花植物資源有限，嚴重影響其在藥用方面的開發(fā)利用。雖然半合成、發(fā)酵或基因工程等手段在提高生物堿產(chǎn)量方面均顯示出巨大潛力，但限于成本偏高及環(huán)境污染等問題，從藥用植物細胞中提取生物堿仍然是當前獲取生物堿的主要來源[34]?，F(xiàn)有研究證明真菌誘導子能快速、專一地誘導植物特定基因的表達，從而活化特定次生代謝途徑、使目的次生代謝產(chǎn)物的積累量增加。因此，利用真菌誘導子提高長春花生物堿含量具有重大意義。

從已有研究可知，通過調(diào)整真菌誘導子的真菌種類、誘導子的劑量、誘導時間長短及植物細胞培養(yǎng)物的種類等因素，可有效地提高長春花生物堿的產(chǎn)量。此外，通過真菌誘導子對長春花懸浮細胞進行誘導處理，人們還對真菌誘導子的誘導機制進行了初步研究，并取得可喜進展。

但目前真菌誘導子在長春花細胞的應用主要集中于由愈傷組織（callus）繼代培養(yǎng)而成的長春花懸浮培養(yǎng)細胞體系。愈傷組織又被稱為脫分化細胞，是指植物體的局部受到創(chuàng)傷刺激后，在傷口表面新生的組織；而干細胞（stem cell），則是一類具有多向分化潛能和自我復制能力的原始的未分化細胞。與脫分化細胞對比，干細胞在生長率、穩(wěn)定性、次生代謝物含量等方面表現(xiàn)出一定的優(yōu)越性[35]。藥用植物干細胞培養(yǎng)作為一種新技術，為解決傳統(tǒng)細胞培養(yǎng)遇到的問題提供了一個全新的解決方案[36]。隨著藥用植物干細胞培養(yǎng)技術的完善與發(fā)展，如果將真菌誘導子與該技術結合起來，將會極大地推動真菌誘導子在調(diào)控藥用植物次生代謝產(chǎn)物含量方面的研究進程。