邢佰穎，陳田雨，楊麗瑩，李 婷，高 鵬

（山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，山東 濟(jì)南 250355）

馬鞭草（Verbena officinalisL.）又名土荊芥、鐵馬鞭等，原產(chǎn)于歐洲，主要生長于原野，在全世界的溫帶至熱帶地區(qū)均有分布。本品具有散瘀通經(jīng)、清熱涼血、解毒消脹、止癢驅(qū)蟲的功效[1]?，F(xiàn)代研究表明，馬鞭草主要含環(huán)烯醚萜糖苷類、黃酮類[2]、三萜類、甾醇等化學(xué)成分[3]，具有抗炎、抗氧化、抗病毒、抗早孕、調(diào)節(jié)免疫活性等作用[4]。目前對于馬鞭草的研究報道并不多見，本項目組在單因素試驗的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法優(yōu)化馬鞭草總黃酮的超聲波提取工藝并研究其體外抗氧化活性，以期為該藥的研究開發(fā)提供基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

UV-1100紫外可見光分光光度計（上海天美）；R201C型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（鞏義英峪高科儀器廠）；循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長城）；KQ-500E型超聲波清洗器（昆山超聲儀器公司）；恒溫不銹鋼水浴鍋（上海樹立）；YP10002電子天平（上海光正）；JY1002分析天平（上海精密科學(xué)儀器公司）；SZ-1型快速混勻器（江蘇金壇金城國勝實驗儀器廠）。

1.2 藥品與試劑

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH，Sigma）；蘆丁對照品（純度：≥98 %，上海源葉，批號：Y01M7S10307）；馬鞭草（購自安徽亳州中藥材市場，經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)萬鵬教授鑒定合格）；過氧化氫（天津富宇，批號：20161209）；L（+）-抗壞血酸，亞硝酸鈉，三氯化鋁，氫氧化鈉（分析純，國藥集團(tuán)）。

2 方法

2.1 馬鞭草總黃酮超聲提取工藝的優(yōu)化

2.1.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密稱取蘆丁對照品5.00 mg，置入25 ml量瓶，加適量無水乙醇超聲使溶解，以無水乙醇定容，搖勻，配成0.2 mg/ml的蘆丁對照品溶液，備用。

精密移取蘆丁對照品溶液0.5，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 ml，分別置入25 ml量瓶，加無水乙醇至6 ml，依次加入5 %NaNO2溶液1.00 ml，充分混勻后靜置6 min，加入10 %AlCl3溶液1.00 ml，充分混勻后靜置6 min，最后加入4 %NaOH溶液10 ml，并加無水乙醇定容至刻度，充分混勻后靜置15 min[5]。以試劑空白為參比溶液，于506 nm處測各對照品溶液的吸光度[6]。以蘆丁對照品質(zhì)量濃度（C）為橫坐標(biāo)，吸光度（A）為縱坐標(biāo)建立對照曲線?；貧w方程為A=0.0916C-0.0148，R2=0.9966，表明蘆丁對照品溶液在4.00～40.00 μg/ml范圍內(nèi)濃度與吸光度的線性關(guān)系良好。

2.1.2 馬鞭草總黃酮提取工藝流程 取馬鞭草段（約為2 cm），準(zhǔn)確稱定，按設(shè)計好的實驗條件進(jìn)行超聲提取，濾過，濾液減壓回收乙醇并繼續(xù)減壓濃縮成稠膏，備用。

2.1.3 馬鞭草總黃酮提取的單因素試驗

2.1.3.1 超聲時間對馬鞭草總黃酮含量的影響 準(zhǔn)確稱取馬鞭草段20 g，固定液料比為30:1，乙醇體積分?jǐn)?shù)為60 %，考察超聲時間分別為10，20，30，40，50，60 min條件下馬鞭草提取物中總黃酮的含量。

2.1.3.2 液料比對馬鞭草總黃酮含量的影響 準(zhǔn)確稱取馬鞭草段20 g，固定超聲時間為30 min，乙醇體積分?jǐn)?shù)為60 %，考察液料比分別為10:1，20:1，30:1，40:1，50:1，60:1條件下馬鞭草提取物中總黃酮的含量。

2.1.3.3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對馬鞭草總黃酮含量的影響 準(zhǔn)確稱取馬鞭草段20 g，固定超聲時間為30 min，液料比為30:1，考察乙醇體積分?jǐn)?shù)分別為40 %，50 %，60 %，70 %，80 %，90 %條件下馬鞭草提取物中總黃酮的含量。

2.1.4 超聲法提取工藝的響應(yīng)面優(yōu)化[7]在單因素試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，以馬鞭草總黃酮的含量（Y）為響應(yīng)值，選取超聲時間(X1)、液料比(X2)、乙醇體積分?jǐn)?shù)(X3)為影響因素，采用三因素三水平的試驗設(shè)計進(jìn)行Box-Behnken中心組合試驗。響應(yīng)面試驗設(shè)計因素水平及編碼見表1。

表1 馬鞭草總黃酮提取響應(yīng)面試驗設(shè)計因素水平及編碼

2.2 馬鞭草總黃酮體外抗氧化試驗

2.2.1 馬鞭草總黃酮對DPPH的清除能力[8]將馬鞭草濃縮液加無水乙醇配制成濃度分別為5，10，20，40，60，80 μg/ml的樣品溶液。精密移取2 ml樣品溶液于試管中，加入0.1 mmol/L的DPPH溶液2 ml，充分混勻，25 ℃下避光反應(yīng)30 min，以無水乙醇為空白對照，于517 nm波長處測定其吸光度，平行測量3次。以抗壞血酸為陽性對照，精密稱取一定量的抗壞血酸配制成相應(yīng)濃度，按上述方法操作。

DPPH自由基清除率（%）=[1-(A樣品-A空白)/A對照]×100 %

其中：A樣品為樣品溶液2 ml+DPPH溶液2 ml的吸光度；A空白為樣品溶液2 ml+無水乙醇2 ml的吸光度；A對照為無水乙醇2 ml+DPPH溶液2 ml的吸光度。

2.2.2 馬鞭草總黃酮對H2O2的清除能力[9]將馬鞭草濃縮液加無水乙醇配制成濃度分別為5，10，20，40，60，80 μg/ml的樣品溶液。精密移取2 ml樣品溶液于試管中，加入2.5 %的H2O2溶液2 ml，充分混合，靜置15 min，以蒸餾水為空白對照，于230 nm處測定其吸光度，平行測量3次。以抗壞血酸為陽性對照，精密稱取一定量的抗壞血酸配制成相應(yīng)濃度，按上述方法操作。

H2O2清除率（%）=[1-(A樣品-A空白)/A對照]×100 %

其中：A樣品為樣品溶液2 ml+H2O2溶液2 ml的吸光度；A空白為樣品溶液2 ml+無水乙醇2 ml的吸光度；A對照為無水乙醇2 ml+H2O2溶液2 ml的吸光度。

3 結(jié)果與分析

3.1 單因素試驗結(jié)果

3.1.1 超聲時間的影響 超聲時間對提取物中馬鞭草總黃酮含量的影響見圖1。

圖1 超聲時間對提取物中馬鞭草總黃酮含量的影響

由圖1可見，在液料比30:1，乙醇體積分?jǐn)?shù)60 %的條件下，隨著超聲時間的延長，馬鞭草總黃酮含量先增加后減小，在40 min時總黃酮含量最高，40～60 min含量降低。這可能是由于隨著超聲時間的延長，馬鞭草中總黃酮在不斷溶出，在40 min時提取較完全，再增加超聲時間會使黃酮類物質(zhì)破壞且增加雜質(zhì)的溶出，降低總黃酮含量。因此，超聲時間為40min時最佳。

3.1.2 液料比的影響 液料比對提取物中馬鞭草總黃酮含量的影響見圖2。

由圖2可見，在超聲時間為30 min，乙醇體積分?jǐn)?shù)60 %的條件下，隨著液料比的增加，提取物中馬鞭草總黃酮含量先增加后減少，在液料比40:1時總黃酮含量最高。這主要是由于前期溶劑量的增多，增大了溶劑與溶質(zhì)的接觸面積，使有效成分浸出完全。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)外達(dá)到擴散平衡時，黃酮不再浸出，此時總黃酮含量最高，再增加溶劑的量將不會提高總黃酮含量，反而浪費溶劑，為之后的蒸發(fā)濃縮帶來困難。因此，液料比為40:1時最佳。

圖2 液料比對馬鞭草總黃酮含量的影響

3.1.3 乙醇體積分?jǐn)?shù)的影響 乙醇體積分?jǐn)?shù)對提取物中馬鞭草總黃酮含量的影響見圖3。

圖3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對馬鞭草總黃酮含量的影響

由圖3可見，在超聲時間30 min，液料比30:1的條件下，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，馬鞭草總黃酮含量先增加后減少，在乙醇體積分?jǐn)?shù)為60 %時總黃酮含量最高。但當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)繼續(xù)增加時，會使脂溶性雜質(zhì)如色素等的溶出量增加，降低總黃酮的含量，并且不易進(jìn)行后期的分離純化。因此，乙醇體積分?jǐn)?shù)為40:1時最佳。

綜上，選取單因素的提取條件為：超聲時間40 min，液料比40:1，乙醇體積分?jǐn)?shù)60 %。

3.2 響應(yīng)面分析法試驗結(jié)果

以單因素試驗結(jié)果為基礎(chǔ)，根據(jù)表1的設(shè)計因素水平與編碼，采用Box-Behnken中心組合實驗原理對馬鞭草總黃酮的超聲波提取工藝進(jìn)行響應(yīng)面法優(yōu)化，以超聲時間（X1）、液料比（X2）、乙醇體積分?jǐn)?shù)（X3）為影響因素，馬鞭草總黃酮含量（Y）為響應(yīng)值進(jìn)行三因素三水平試驗，設(shè)計方案及結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面試驗設(shè)計方案與結(jié)果

將所得數(shù)據(jù)通過Design-Expert 8.0軟件進(jìn)行多元回歸擬合，得到的二元多項回歸方程為：

回歸方程分析見表3。

表3 回歸方程方差分析

由表3可見，模型組的F值為207.91，模型差異極顯著（P＜0.01）。一次項X1、X2、X3對模型的影響均極為顯著（P＜0.01），R2=0.9963，數(shù)據(jù)表明所選取的模型相關(guān)度較好，可行性強。由F值可得各個因素對馬鞭草總黃酮含量影響的大小順序：乙醇體積分?jǐn)?shù)（X3）＞液料比（X2）＞超聲時間（X1）。

通過Design-Expert 8.0軟件對超聲時間（X1）、液料比（X2）、乙醇體積分?jǐn)?shù)（X3）各因子間的交互作用進(jìn)行分析，得到了圖4～圖6的響應(yīng)面和等高線圖。響應(yīng)面圖中，響應(yīng)面越陡峭，則該因素對響應(yīng)值的影響越顯著；相反則該因素影響不顯著。在等高線圖中，可直接觀察到各影響因子交互作用程度，等高線接近于圓形，影響因子交互作用不強；相反，等高線接近于橢圓形，說明兩個影響因子間的交互作用較強[10]。由圖4、圖6可見超聲時間（X1）與液料比（X2）、液料比（X1）與乙醇體積分?jǐn)?shù)（X3）的等高線接近于橢圓，說明超聲時間（X1）與液料比（X2）及液料比（X1）與乙醇體積分?jǐn)?shù)（X3）有較強的交互作用。由圖5可見超聲時間（X1）與乙醇體積分?jǐn)?shù)（X3）的等高線接近于圓形，說明超聲時間（X1）與乙醇體積分?jǐn)?shù)（X3）交互作用較小。

圖4 提取時間和液料比對總黃酮含量的響應(yīng)面和等高線分析圖

圖5 提取時間和乙醇體積分?jǐn)?shù)對總黃酮含量的響應(yīng)面和等高線分析圖

圖6 液料比和乙醇體積分?jǐn)?shù)對總黃酮含量的響應(yīng)面和等高線分析圖

3.3 最佳提取工藝及驗證試驗

響應(yīng)面法得到的最佳提取工藝為：超聲時間40 min，液料比50:1，乙醇體積分?jǐn)?shù)60 %，提取物中馬鞭草總黃酮含量的預(yù)測值為3.31 %。對最佳提取工藝為進(jìn)行驗證，得到馬鞭草總黃酮含量的平均實測值為3.26 %（n=3），實測值與預(yù)測值的誤差為1.51 %[11]，說明響應(yīng)面法得到的最佳提取工藝有較強的可行性。

3.4 馬鞭草總黃酮清除DPPH的能力

以馬鞭草總黃酮和抗壞血酸的質(zhì)量濃度（μg/ml）為橫坐標(biāo)，DPPH的清除率（%）為縱坐標(biāo)繪制曲線，見圖7。由圖7可見，5～20 μg/ml濃度范圍內(nèi)，馬鞭草總黃酮的清除率小于抗壞血酸（P＜0.05），但隨著濃度的增加，40～80 μg/ml濃度范圍內(nèi)馬鞭草總黃酮的清除率大于抗壞血酸（P＜0.05）。

圖7 馬鞭草總黃酮清除DPPH自由基的能力

3.5 馬鞭草總黃酮清除H2O2的能力

以馬鞭草總黃酮和抗壞血酸的質(zhì)量濃度（μg/ml）為橫坐標(biāo)，H2O2的清除率（%）為縱坐標(biāo)繪制曲線，見圖8。由圖8可見，馬鞭草總黃酮和抗壞血酸清除H2O2能力均與質(zhì)量濃度成正比，馬鞭草總黃酮對H2O2的清除作用大于抗壞血酸（P＜0.05）。

圖8 馬鞭草總黃酮清除H2O2的能力

4 討論

4.1 馬鞭草具有多種活性成分，其中黃酮類化合物的研究逐漸被大家所重視。本項目組采用超聲法提取馬鞭草總黃酮，提取效率高，成分破壞少，并用響應(yīng)面法優(yōu)化馬鞭草總黃酮的提取工藝，得到最佳提取條件為超聲時間40 min，液料比50:1，乙醇體積分?jǐn)?shù)60 %。根據(jù)驗證試驗得到的實測值為3.26 %，與預(yù)測值3.31 %的誤差為1.51 %，說明該提取工藝有較強的可行性。

4.2 通過測定馬鞭草總黃酮清除DPPH自由基和H2O2的能力，表明其具有較強的體外抗氧化活性。

4.3 通過上述研究，確定了馬鞭草總黃酮的最佳提取工藝，為其全面開發(fā)與利用提供理論依據(jù)；同時，馬鞭草總黃酮具有較好的抗氧化能力，可作為保健品及化妝品的原料，有較好的開發(fā)前景。