張濤 許文勝 郝冬梅 何宏偉 單新亮 李鑫瑤 孫旭 高彩鳳

(包頭醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室，內(nèi)蒙古 包頭 014040)

腦缺血再灌注損傷主要是指恢復(fù)缺血腦組織的血流灌注對(duì)腦組織造成的嚴(yán)重?fù)p傷，其可引起一系列的細(xì)胞和生理反應(yīng)，如產(chǎn)生大量氧自由基等活性分子、誘導(dǎo)前列腺素合成、誘導(dǎo)活化信號(hào)分子和誘導(dǎo)炎癥因子產(chǎn)生等，導(dǎo)致線粒體功能障礙，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量[1-2]。而缺血預(yù)適應(yīng)主要是指短暫缺血再灌注可增強(qiáng)腦組織對(duì)隨后較長(zhǎng)時(shí)間缺血損傷的耐受性現(xiàn)象，缺血后適應(yīng)主要是指在腦缺血后再灌注早期采用反復(fù)數(shù)次短暫缺血再灌注可保護(hù)腦組織以防止再灌注損傷，二者均可調(diào)動(dòng)細(xì)胞內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制，進(jìn)而抵抗神經(jīng)細(xì)胞損傷，但具體作用機(jī)制目前尚不完全清楚[3-4]。為了進(jìn)一步討論預(yù)適應(yīng)聯(lián)合后適應(yīng)對(duì)大鼠腦缺血/再灌注損傷的保護(hù)作用，本研究將SD大鼠制作腦缺血/再灌注損傷模型后的神經(jīng)功能、腦梗死灶體檢、腦組織氧化應(yīng)激損傷生化指標(biāo)及神經(jīng)元凋亡情況進(jìn)行了檢測(cè)分析，并與正常大鼠進(jìn)行了比較，旨在為臨床提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 選取清潔級(jí)雄性SD大鼠50只，體質(zhì)量240～300g，由內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)：201407413，ddY系SPF級(jí)。將大鼠隨機(jī)分為5組，每組各10只：假手術(shù)組(僅分離大鼠頸部血管，不插線栓)、模型組(線栓法行大腦中動(dòng)脈阻閉120min后再灌注)、預(yù)適應(yīng)組(在造模前24h和1h行3個(gè)循環(huán)的缺血15s+再灌注30s)、后適應(yīng)組(在造模后行3個(gè)循環(huán)的再灌注30s+缺血15s)和預(yù)適應(yīng)+后適應(yīng)組(在造模前24h和1h行3個(gè)循環(huán)的缺血15s+再灌注30s以及在造模后行3個(gè)循環(huán)的再灌注30s+缺血15s)。

1.2 儀器與試劑 精密電子天平(DV215CD)購(gòu)自日本奧豪斯公司；高速離心機(jī)(CRII)購(gòu)自日本日立公司；數(shù)碼相機(jī)(A-550)購(gòu)自日本SONY公司，彩色病理圖文分析系統(tǒng)(HPIAS-1000)購(gòu)自武漢千屏影像公司，紫外分光光度計(jì)(UV-2550)購(gòu)自日本島津儀器公司，顯微鏡(Ls-210)購(gòu)自日本奧林巴斯公司。丙二醛(MDA)檢測(cè)試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)檢測(cè)試劑盒和考馬斯亮蘭蛋白測(cè)定試劑盒購(gòu)自北京中金杉生物技術(shù)有限公司；TUNEL試劑盒購(gòu)自德國(guó)Roche公司；氯化三苯基四氮唑(TTC)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。

1.3 模型制備 所有實(shí)驗(yàn)大鼠在術(shù)前均禁食12h，自由飲水，隨后行大腦中動(dòng)脈阻閉120min后再灌注造成局灶性腦缺血再灌注損傷模型，具體造模方法如下：腹腔注射10%水合氯醛麻醉后頸部備皮、消毒，在頸正中做長(zhǎng)約1.5 cm切口，分離右側(cè)頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈及頸內(nèi)動(dòng)脈，結(jié)扎頸外動(dòng)脈遠(yuǎn)心端及頸內(nèi)動(dòng)脈的顱外分支翼腭突動(dòng)脈。利用動(dòng)脈夾夾閉頸總動(dòng)脈近心端和頸內(nèi)動(dòng)脈遠(yuǎn)心端，防止血液返流，隨后在頸外動(dòng)脈近分叉處剪一切口，經(jīng)頸外動(dòng)脈將線栓插入頸內(nèi)動(dòng)脈，松開頸內(nèi)動(dòng)脈遠(yuǎn)心端的動(dòng)脈夾后繼續(xù)插入線栓，直至到達(dá)大腦前動(dòng)脈近端壁，阻斷大腦中動(dòng)脈來自頸內(nèi)動(dòng)脈、大腦前動(dòng)脈及大腦后動(dòng)脈的所有血供。去除頸總動(dòng)脈上的動(dòng)脈夾，依次縫合肌肉和皮膚切口，但將線栓外留。阻斷120min后再次麻醉動(dòng)物，將線栓緩慢拔出，恢復(fù)血流再灌注。假手術(shù)組僅分離頸內(nèi)動(dòng)脈和頸外動(dòng)脈，不插線栓。

1.4 預(yù)適應(yīng)與后適應(yīng)處理 預(yù)適應(yīng)方法：預(yù)適應(yīng)組大鼠和預(yù)適應(yīng)+后適應(yīng)組大鼠在造模前24h和1h分別行3個(gè)循環(huán)的大腦中動(dòng)脈缺血15 s+再灌注30 s作為預(yù)適應(yīng)，即阻斷大腦中動(dòng)脈15s后拔出線栓再灌注30s，重復(fù)3個(gè)循環(huán)。后適應(yīng)方法：后適應(yīng)組和預(yù)適應(yīng)+后適應(yīng)組大鼠在造模后拔出線栓再灌注30s，然后將線栓再次插入頸內(nèi)動(dòng)脈阻閉大腦中動(dòng)脈15s，重復(fù)3個(gè)循環(huán)后進(jìn)行持續(xù)再灌注48h。

1.5 腦梗死灶測(cè)定 各組于造模48h后隨機(jī)取4只處死后斷頭取腦，除去嗅球、小腦和低位腦干部分后切成約2 mm厚腦片，迅速放入氯化三苯基四氮唑溶液(TTC)中37℃染色30min，正常組織可被TTC染為深紅色，而缺血壞死的腦組織不與TTC反應(yīng)，應(yīng)為白色。將切片多聚甲醛固定后放置比例尺并拍照，利用圖像處理軟件描繪出每一層面染色成白色的區(qū)域后，按比例求出各腦片的梗死面積(紅色區(qū)域?yàn)檎ＤX組織，白色區(qū)域?yàn)楣Ｋ绤^(qū))。

1.6 腦組織勻漿生化指標(biāo)測(cè)定 各組再隨機(jī)取4只大鼠斷頭后取腦，去除小腦和嗅球后用冷生理鹽水漂洗，濾紙拭干后稱重，隨后加入等體積預(yù)冷的生理鹽水后利用勻漿機(jī)制成勻漿，高速離心機(jī)以6000r/min離心15min后取上清液，于冰箱保存待測(cè)。取少量上清液分別加入考馬斯亮蘭蛋白測(cè)定試劑盒、SOD試劑盒和MDA試劑盒進(jìn)行處理，并利用紫外分光光度計(jì)分別在590nm、550nm和532nm處測(cè)定吸光度，根據(jù)公式求出樣本中蛋白質(zhì)濃度、SOD活性和脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA的含量，具體操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.7 細(xì)胞凋亡測(cè)定 將各組剩余大鼠麻醉后先經(jīng)心臟灌注生理鹽水，把血液沖凈后再用4%多聚甲醛灌注，隨后斷頭取腦，將缺血側(cè)腦組織用4%多聚甲醛固定。常規(guī)脫水和石蠟包埋處理，在視交叉后1mm處及4mm處行冠狀切片后做連續(xù)切片，厚約5μm。將相鄰大腦切片用TUNEL試劑盒進(jìn)行染色后于顯微鏡下觀察并記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。陽(yáng)性細(xì)胞結(jié)果應(yīng)為棕黃色(核)或棕褐色，背景呈藍(lán)紫色，每張切片在普通光鏡下隨機(jī)釆集5個(gè)不重疊視野進(jìn)行觀察，記錄每個(gè)視野中的凋亡細(xì)胞個(gè)數(shù)，取平均值作為凋亡細(xì)胞數(shù)。

1.8 神經(jīng)功能缺陷評(píng)分 采用Longa等描述的5級(jí)神經(jīng)缺陷評(píng)分法對(duì)大鼠手術(shù)后再灌注6、12、24和48h神經(jīng)功能進(jìn)行評(píng)分：0級(jí)為無(wú)神經(jīng)功能缺陷，記為0分；Ⅰ級(jí)為不能完全伸展缺血病灶對(duì)側(cè)前肢，記為1分；Ⅱ級(jí)為行走時(shí)向缺血病灶對(duì)側(cè)轉(zhuǎn)圈，記為2分；Ⅲ級(jí)為行走時(shí)向缺血病灶對(duì)側(cè)傾倒，記為3分；Ⅳ級(jí)為不能自發(fā)行走，昏迷，記為4分。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分比較 再灌注后6h各處理組與模型組神經(jīng)功能缺陷評(píng)分差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；再灌注12、24和48h模型組神經(jīng)功能缺陷評(píng)分明顯高于其他處理組(P<0.05)；再灌注12、24和48h處理組中，預(yù)適應(yīng)+后適應(yīng)組神經(jīng)功能缺陷評(píng)分最低(P<0.05)，而預(yù)適應(yīng)組和后適應(yīng)組神經(jīng)功能缺失評(píng)分比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見表1。

表1 各組大鼠神經(jīng)功能缺陷評(píng)分比較分)Table 1 Comparison of neurological function defects in each group

注：與模型組比較，①P<0.05；與預(yù)適應(yīng)組比較,②P<0.05；與后適應(yīng)組比較，③P<0.05

2.2 各組大鼠腦梗死灶體積比較 預(yù)適應(yīng)+后適應(yīng)組腦梗死灶體積為(100.41±33.26)mm3，明顯低于模型組、預(yù)適應(yīng)組和后適應(yīng)組(均P<0.05)；預(yù)適應(yīng)組和后適應(yīng)組腦梗死灶體積較模型組降低(P<0.05)；預(yù)適應(yīng)組和后適應(yīng)組腦梗死灶體積比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

表2 各組大鼠腦梗死灶體積比較Table 2 Comparison of volume of cerebral infarction in rats

注：與模型組比較，①P<0.05；與預(yù)適應(yīng)組比較，②P<0.05；與后適應(yīng)組比較，③P<0.05

2.3 各組大鼠腦組織SOD和MDA比較 假手術(shù)組SOD活性明顯高于模型組，而MDA低于模型組(P<0.05)；模型組與預(yù)適應(yīng)組SOD和MDA比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；后適應(yīng)組和預(yù)適應(yīng)+后適應(yīng)組SOD活性較模型組升高，而MDA較模型組降低(P<0.05)，見表3。

Table3SODactivityandMDAofratbraintissueineachgroup

組別SOD(μn/mgprot)MDA(nmol/mgprot)假手術(shù)組122 41±24 61①②③43 51±9 64①②③模型組45 56±10 31113 43±21 07預(yù)適應(yīng)組48 63±11 07110 53±25 66后適應(yīng)組76 81±9 83①②78 60±13 27①②預(yù)適應(yīng)+后適應(yīng)組110 13±12 16①②③④61 51±12 15①②③④ F84 63291 062 P<0 05<0 05

注：與模型組比較，①P<0.05；與預(yù)適應(yīng)組比較，②P<0.05；與后適應(yīng)組比較，③P<0.05；與假手術(shù)組比較，④P<0.05

2.4 各組大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元凋亡影響 假手術(shù)組細(xì)胞凋亡數(shù)明顯低于模型組(P<0.05)；各處理組細(xì)胞凋亡數(shù)較模型組有所降低(P<0.05)，其中預(yù)適應(yīng)+后適應(yīng)組神經(jīng)元細(xì)胞凋亡數(shù)最少，為(47.20±9.21)個(gè)，見表4、圖1。

表4 各組大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡比較Table 4 Comparison of apoptosis of cortical neurons in each group

注：與模型組比較，①P<0.05；與預(yù)適應(yīng)組比較，②P<0.05；與后適應(yīng)組比較，③P<0.05；與假手術(shù)組比較，④P<0.05

3 討論

缺血、低氧(I/HPC)指機(jī)體預(yù)先受一次或多次短暫、非致死性缺血/低氧刺激,再恢復(fù)常態(tài)后而獲得的更嚴(yán)重甚至致死性缺血或缺氧，是臨床醫(yī)學(xué)的常過程和基本病理死因，如CO中毒、缺血性腦病(肺性腦病、高血壓腦病、肝性腦病等)、帕金森氏病、新生兒窒息后由缺血缺氧引起的腦病，病情危重且病死率較高，甚至可以產(chǎn)生諸如智力低下、腦癱、癲痛、痙攣以及共濟(jì)失調(diào)等[5]，也是航天、高原、深水等極端環(huán)境所面臨的基本問題。

圖1 各組大鼠缺血側(cè)皮質(zhì)TUNEL染色結(jié)果(×400)Figure 1 Results of TUNEL staining of ischemic lateral cortex in rats

缺血、低氧可導(dǎo)致機(jī)體免疫功能紊亂,誘發(fā)一些免疫炎癥性疾病,并可導(dǎo)致細(xì)胞和組織由于能量供給不足等一系列問題而出現(xiàn)炎癥、損傷，甚至死亡，而腦是人體對(duì)缺血最為敏感的器官，腦組織缺血將會(huì)導(dǎo)致局部腦組織及其功能的損害，即使短暫的缺血也可導(dǎo)致神經(jīng)元的損傷或死亡，而長(zhǎng)時(shí)間的完全缺血或嚴(yán)重缺血會(huì)引起梗死[6]。缺血后血流恢復(fù)無(wú)疑是維持和防止腦組織進(jìn)一步損傷的必需措施,但再灌注后往往發(fā)生復(fù)雜的腦循環(huán)機(jī)能和代謝的變化,加重缺血后的腦組織損傷,常表現(xiàn)于圍術(shù)期腦外傷及頭頸部大血管手術(shù)[7]。Murry等[8]1986年發(fā)現(xiàn)，I/HPC后阻斷犬冠狀動(dòng)脈40min所致的心肌梗死范圍比對(duì)照組減少75%，由此首次提出I/HPC的神經(jīng)保護(hù)作用，并于1990年發(fā)現(xiàn)類似狀況[9]。I/HPC被認(rèn)為是細(xì)胞內(nèi)源性防護(hù)機(jī)制的啟動(dòng)[9]，如促紅細(xì)胞生成素(EPO)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)等[10-11]均在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中廣泛表達(dá)，機(jī)體抗缺氧或缺血可以促進(jìn)二者表達(dá)增加，通過與配體結(jié)合，啟動(dòng)內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制，依次激活一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路及多種可能的機(jī)制發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，減輕低氧/缺血引起的神經(jīng)元損傷。這種防護(hù)機(jī)制一般通過預(yù)先給機(jī)體一個(gè)溫和的(亞致死性)缺血/低氧刺激。這一細(xì)胞內(nèi)源性保護(hù)現(xiàn)象在大腦、腎臟、小腸和肝臟等器官都存在，腦缺血時(shí)腦細(xì)胞生物電會(huì)發(fā)生改變，并出現(xiàn)病理性慢波，缺血一定時(shí)間后再灌注，慢波持續(xù)并加重，而顳葉組織內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)性氨基酸代謝也會(huì)發(fā)生明顯變化，即興奮性氨基酸隨缺血-再灌注時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸降低，抑制性氨基酸在缺血-再灌注早期明顯升高。缺血再灌注損傷時(shí)間越長(zhǎng)，興奮性遞質(zhì)含量越低，腦組織超微結(jié)構(gòu)改變?cè)矫黠@，但其具體機(jī)制目前尚不完全清楚[12-13]。

腦缺血再灌注損傷的機(jī)制目前己有多種學(xué)說,如自由基(ROS)學(xué)說、興奮性氨基酸毒性學(xué)說、韓超載學(xué)說、水通道學(xué)說、蛋白質(zhì)合成抑制學(xué)說及基因遺傳學(xué)說等，其中ROS引發(fā)的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)被認(rèn)為是腦缺血/再灌注損傷的最為重要機(jī)制之一,其介導(dǎo)的連鎖反應(yīng)是腦缺血/再灌注的核心病理生理過程[14-15]。ROS生成增多與黃嘌呤氧化酶形成增多、中性粒細(xì)胞的呼吸爆發(fā)、線粒體功能受損、兒茶酚胺自身氧化增加，而急劇增加的ROS可與細(xì)胞膜不飽和脂肪酸發(fā)生反應(yīng),形成脂質(zhì)過氧化并導(dǎo)致細(xì)胞損傷破裂、血腦屏障破壞以及腦水腫形成[16]。ROS還可以攻擊細(xì)胞膜,造成細(xì)胞膜和線粒體損傷,最終導(dǎo)致細(xì)胞膜破壞及神經(jīng)元損傷,并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[17]。而細(xì)胞膜受損會(huì)加重血管源性腦水腫及缺血性腦損傷,并使大腦缺血半暗區(qū)出現(xiàn)血管痙攣與內(nèi)凝血,從而導(dǎo)致腦梗死范圍擴(kuò)大[18]。有研究表明，缺血預(yù)適應(yīng)和缺血后適應(yīng)均對(duì)腦缺血/再灌注損傷具有一定的保護(hù)作用[19]，但其具體機(jī)制目前尚不完全清楚。

本研究對(duì)SD大鼠腦缺血/再灌注損傷模型的神經(jīng)功能、腦梗死灶體積、腦組織氧化應(yīng)激損傷生化指標(biāo)及神經(jīng)元凋亡情況進(jìn)行檢測(cè)分析，并與正常大鼠進(jìn)行比較，結(jié)果表明，再灌注12、24和48h模型組神經(jīng)功能缺陷評(píng)分明顯高于其他處理組，再灌注12、24和48h處理組中，預(yù)適應(yīng)+后適應(yīng)組神經(jīng)功能缺陷評(píng)分最低，而預(yù)適應(yīng)組和后適應(yīng)組神經(jīng)功能缺失評(píng)分比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，提示預(yù)適應(yīng)+后適應(yīng)可明顯改善腦缺血/再灌注損傷導(dǎo)致的神經(jīng)功能下降程度，且比單獨(dú)預(yù)適應(yīng)或后適應(yīng)的效果更好。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，假手術(shù)組SOD活性明顯高于模型組，而MDA低于模型組；模型組與預(yù)適應(yīng)組SOD和MDA比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；后適應(yīng)組和預(yù)適應(yīng)+后適應(yīng)組SOD活性較模型組升高，而MDA較模型組降低。SOD可清除超氧陰離子,其活性的下降則意味著機(jī)體抗氧化能力的降低；而MDA的含量變化可間接反映腦組織中ROS含量的變化和腦組織的損傷程度，而后適應(yīng)可明顯上調(diào)SOD水平并降低MDA水平，進(jìn)而抑制ROS的爆發(fā)，其抗氧化作用較強(qiáng)。研究還發(fā)現(xiàn)，各處理組細(xì)胞凋亡數(shù)較模型組有所降低，其中預(yù)適應(yīng)+后適應(yīng)組神經(jīng)元細(xì)胞凋亡數(shù)最少，而預(yù)適應(yīng)+后適應(yīng)組腦梗死灶體積明顯低于模型組、預(yù)適應(yīng)組和后適應(yīng)組，預(yù)適應(yīng)組和后適應(yīng)組腦梗死灶體積較模型組也明顯降低，提示預(yù)適應(yīng)和后適應(yīng)均可明顯改善腦組織的損傷程度，從而抑制再灌注期的氧化應(yīng)激損傷,進(jìn)而減少神經(jīng)細(xì)胞的凋亡與壞死，且聯(lián)合后的保護(hù)效果更好。但本研究限于樣本量不足，對(duì)預(yù)適應(yīng)聯(lián)合后適應(yīng)對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷保護(hù)作用的具體機(jī)制仍需做進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

預(yù)適應(yīng)和后適應(yīng)均能對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用，而兩者聯(lián)合應(yīng)用能進(jìn)一步加強(qiáng)保護(hù)作用。

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