李得志 于欣欣 吳福玲 高萌 石濤

(1.濱州醫(yī)學院附屬醫(yī)院兒科，山東 濱州 256610； 2. 濱州市人民醫(yī)院兒科，山東 濱州 256610)

毛細支氣管炎是一種嚴重的喘息性疾病，具有咳嗽、咳痰發(fā)燒等典型的臨床表現(xiàn)，發(fā)病具有季節(jié)性[1]。毛細支氣管炎多見于2歲以下的嬰幼兒，由于新生兒較弱的免疫系統(tǒng)和發(fā)育不全的呼吸系統(tǒng)，使這一年齡段的嬰幼兒患毛細支氣管炎的發(fā)病率明顯升高[2]。最近Wu P的流行病學研究發(fā)現(xiàn),小兒毛細支氣管炎的發(fā)病率為68%，小兒毛細支氣管炎還伴有支氣管哮喘等一系列并發(fā)癥[3]，危害嚴重，給社會、家庭帶來了沉重負擔。

呼吸道合胞病毒(Respiratory syncytial virus , RSV)是引起小兒毛細支氣管炎最常見的的病原體，占發(fā)病的50%～80%[4]。此外，鼻病毒和博卡病毒等也可引起該病[5]。RSV可以通過促進炎癥因子釋放引起呼吸道炎癥，同時可以破壞免疫系統(tǒng)[6]。以往研究認為，RSV引起的小兒毛細支氣管炎與輔助性T淋巴細胞1 (help T cells，Th1)/輔助性T淋巴細胞2(help T cells，Th2)亞群比例失衡有關。最近動物以及細胞實驗發(fā)現(xiàn)，RSV還可引起輔助性T淋巴細胞17(help T cells，Th17)/調節(jié)性T淋巴細胞 (regulatory T cells，Treg )亞群比例失衡，而Th17/ Treg比例失衡同樣參與嬰幼兒毛細支氣管炎的發(fā)生、發(fā)展過程[7]。

間充質干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是一類多潛能干細胞，存在于幾乎所有器官和結締組織間質中。以往研究發(fā)現(xiàn)，MSCs具有抗炎和促進組織修復的作用[8-9]。而同時大量研究證實了人胎盤間充質干細胞(human placental multipotent mesenchymal stromal cells ，hp-MSCs)對炎癥介質釋放具有抑制作用。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，hp-MSCs可以抑制毛細支氣管炎模型鼠的支氣管炎癥反應。但是hp-MSCs水平與小兒毛細支氣管炎的發(fā)病是否相關以及 hp-MSCs抑制小兒毛細支氣管炎癥機制還不明確。因此，本研究旨在觀察hp-MSCs對小兒毛細支氣管炎的影響，并探討 hp-MSCs抑制毛細支氣管炎的機制。

1 材料與方法

1.1 研究對象 本研究于2014～2015年在濱州醫(yī)學院附屬醫(yī)院招募志愿者，并收集濱州醫(yī)學院附屬醫(yī)院出生的新生兒胎盤，隨后對出生后的新生兒進行隨訪，由兒科大夫根據(jù)臨床診斷標準診斷受試者是否為毛細支氣管炎患者，以毛細支氣管炎患者為病例組，正常體檢兒童為對照組，進行病例對照研究。按照胎齡、性別、居住地和喂養(yǎng)方式進行1:1匹配。胎盤由產(chǎn)科大夫收集，無菌條件下取足月剖宮產(chǎn)兒胎盤，剖出羊膜，剪取胎兒側胎盤組織，PBS(磷酸緩沖液)反復沖洗至干凈，放入液氮凍5min，然后轉移至-80°冰箱進行保存。本研究共獲取44名研究對象的既往體檢資料(年齡、居住地、聯(lián)系電話、家族史、個人史、喂養(yǎng)史、治療情況等)，其中男性22人，女性22人。

1.2 hp-MSCs水平檢測 取出胎盤組織，用眼科剪剪碎。剪碎的組織稱取5g，加入1g/L的膠原酶Ⅱ，37℃下消化45min，然后經(jīng)過細胞篩網(wǎng)，收集細胞懸液。離心，棄上清，以8．3 g/L氯化銨溶液4 ml 重懸細胞，1000 r/min離心 5 min，棄上清，PBS洗滌2次。以完全培養(yǎng)基重懸，制成單細胞懸液，錐蟲藍染色計數(shù)活細胞數(shù)。利用流式細胞儀檢測hp-MSC表面標志整合素家族成員CD29(Cluster of differentiation29，CD29)和透明質酸受體CD44(Cluster of differentiation44，CD44)表達水平[10]。

1.3 細胞培養(yǎng) 利用Ficoll-Hypaque密度梯度離心法分離外周血單個核細胞；利用免疫磁珠法進一步從單個核細胞中分離CD4+T淋巴細胞；利用流式細胞術檢測CD4+T淋巴細胞的純度,利用2%錐蟲藍鑒定活細胞數(shù)。將分離獲取的細胞調整為2×106個/ml，取相同數(shù)量的CD4+T淋巴細胞分為對照組、RSV感染組和RSV+hp-MSCs干預組等3個亞組，分別給予相應的干預。

1.4 hp-MSC對炎癥因子分泌的影響 酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linked ligand sorbent assay ，ELLSA)檢測炎癥因子水平，并參照試劑盒說明書進行操作。

1.5 觀察hp-MSC對Foxp3及RORγt基因表達的影響 采用Real time PCR法檢測Foxp3和RORγt基因水平。稱取各組細胞，使用超聲破碎儀將組織粉碎后裂解，提取RNA，變性，進行逆轉錄反應，引物序列見表1。

表1 Foxp3 和 RORγt 引物序列Table 1 Primers for PCR amplification of Foxp3 and RORγt gene

1.6 觀察hp-MSC對Foxp3及RORγt蛋白表達的影響 采用Western blot法進行檢測，取60mg全細胞蛋白電泳樣品進行電泳分析，電泳條件：4°C，開始時電壓120V，當染料進入分離膠后，電壓調到80V。電泳結束后，進行蛋白質的轉膜，蛋白從SDS-PAGE凝膠上轉移至PVDF膜上。封閉PVDF膜，蛋白質與一抗反應，蛋白質與二抗反應，顯色，觀察結果，用掃描儀掃描照片并用Fluorchem FC2軟件進行圖像分析。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase ，GAPDH)作為內參照，用目的蛋白與相應的GAPDH條帶平均光密度比值表示目的蛋白的相對表達量。

2 結果

2.1 hp-MSCs與嬰幼兒毛細支氣管炎的相關性

2.1.1 病例組和對照組基本情況比較 兩組人群基本情況以及是否有特異性皮炎，是否存在毛細支氣管炎1級、2級家族史，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05或P<0.01)，見表2。

表2 兩組人群的人口學特征(n,×10-2)Table 2 Demographic characteristics

注：與對照組比較，①P<0.05， ②P<0.01

2.1.2 病例組與對照組hp-MSCs及表面標記物表達水平比較 對照組hp-MSCs水平高于病例組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；對照組hp-MSCs 表面標記物CD44和CD29表達水平高于病例組，差異亦有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表3。

表3 兩組嬰幼兒胎盤hp-MSCs數(shù)量及表面標記物表達水平比較Table 3 Expression of hp-MSCs and its surface markers in infants with nomal and with capillary bronchitis

注：與正常組比較，①P<0.05，②P<0.01

2.2 hp-MSCs對人CD4+T淋巴細胞分泌炎性介質的影響

2.2.1 hp-MSCs對人CD4+T淋巴細胞分泌IL-9的影響 與對照組相比，RSV感染可以升高IL-9水平，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；而hp-MSCs干預可以降低IL-9水平，差異亦有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，見圖1。

2.2.2 hp-MSCs對人CD4+T淋巴細胞分泌IL-17的影響 與對照組相比，RSV感染可以升高IL-17水平，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；而hp-MSCs干預可以降低IL-17水平，差異亦有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖2。

圖1 hp-MSCs對人CD4+T淋巴細胞分泌IL-9濃度的影響

Figure1Effectofhp-MSCsonIL-9secretioninhumanCD4+TlymphocytesbyELISA

注：與對照組相比，①P<0.05，②P<0.01

圖2 hp-MSCs對人CD4+T淋巴細胞分泌IL-17濃度的影響

Figure2Effectofhp-MSCsonIL-17secretioninhumanCD4+TlymphocytesbyELISA

注：與對照組相比，①P<0.05，②P<0.01

2.2.3 hp-MSCs對人CD4+T淋巴細胞分泌IL-10的影響 與對照組相比，RSV感染可以降低IL-10水平，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；而hp-MSCs干預可以升高IL-10水平，差異亦有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖3。

圖3 hp-MSCs對人CD4+T淋巴細胞分泌IL-10濃度的影響

Figure3Effectofhp-MSCsonIL-10secretioninhumanCD4+TlymphocytesbyELISA

注：與對照組相比，①P<0.05，②P<0.01

2.2.4 hp-MSCs對人CD4+T淋巴細胞分泌TGF-β1的影響 與對照組相比，RSV感染可以降低TGF-β1水平，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；而hp-MSCs干預可以升高TGF-β1水平，差異亦有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖4。

圖4 hp-MSCs對人CD4+T淋巴細胞分泌TGF-β1濃度的影響

Figure4Effectofhp-MSConTGF-β1secretioninhumanCD4+TlymphocytesbyELISA

注：與對照組相比①P<0.05，②P<0.01

2.3 hp-MSCs對CD4+T淋巴細胞Th17/Treg平衡的影響

2.3.1 hp-MSCs對Foxp3蛋白和基因表達的影響 與對照組相比，RSV感染可以上調Foxp3蛋白表達水平，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；而hp-MSCs干預可以下調TGF-β1蛋白表達，差異亦有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖5。與對照組相比，RSV感染可以上調Foxp3基因表達，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；而hp-MSCs干預可以下調Foxp3基因表達，差異亦有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖6。

圖5 Western-blot方法檢測hp-MSCs對Foxp3表達水平的影響Figure 5 Effect of hp-MSCs on Foxp3 expression by Western-blot注：與對照組相比，① P<0.05，②P<0.01

圖6 檢測hp-MSCs對Foxp3基因表達水平的影響

Figure6Effectofhp-MSCsonFoxp3geneexpressionbyRealtimePCR

注：與對照組相比，①P<0.05，②P<0.01

2.3.2 hp-MSCs對RORγt蛋白和基因表達的影響 與對照組相比，RSV感染可以上調RORγt蛋白表達，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；而hp-MSCs干預可以下調RORγt蛋白表達，差異亦有統(tǒng)計學意義(P<0.05),見圖7。與對照組相比，RSV感染可以上調RORγt基因表達，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；而hp-MSCs干預可以下調RORγt基因表達，差異亦有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖8。

圖7 檢測hp-MSCs對RORγt表達水平的影響

Figure7Effectofhp-MSCsonRORγtexpressionbyWestern-blot

注：與對照組相比，①P<0.05，②P<0.01

圖8 檢測hp-MSCs對RORγt基因表達水平的影響

Figure8Effectofhp-MSCsonRORγtgeneexpressionbyRealtimePCR

注：與對照組相比，①P<0.05，②P<0.01

3 討論

研究已經(jīng)證實，嬰幼兒毛細支氣管炎發(fā)病可引起炎癥介質釋放增多，并可進一步引起支氣管哮喘等并發(fā)癥[11]。Chen CP等研究發(fā)現(xiàn)，hp-MSCs不僅可以抑制IL-9等促炎癥介質釋放，還可增加IL-10等抗炎癥介質的釋放[12]，提示胎盤中的hp-MSCs水平可能與嬰幼兒毛細支氣管炎的發(fā)病存在密切聯(lián)系。但是至今無臨床研究證實hp-MSCs水平降低與嬰幼兒毛細支氣管炎發(fā)病存在聯(lián)系。本研究第一次通過臨床研究觀察hp-MSCs水平與嬰幼兒毛細支氣管炎發(fā)病的相關性，結果表明，hp-MSCs水平下降是引起嬰幼兒毛細支氣管炎的獨立危險因素。

人群研究已經(jīng)證實了嬰幼兒hp-MSCs水平下降可以引起毛細支氣管炎，說明hp-MSCs具有保護作用。那么hp-MSCs是如何防治毛細支氣管炎的呢？為此，本研究團隊進一步進行了細胞研究。通過分離hp-MSCs和CD4+T淋巴細胞并進行共培養(yǎng)，結果顯示，RSV明顯升高IL-9、IL-17等促炎癥因子的水平，同時降低IL-10、TGFβ-1等抗炎因子水平。而hp-MSC干預可以明顯降低IL-9、IL-17等促炎癥因子的水平，升高IL-10、TGFβ-1等抗炎因子水平。本研究結果與以往研究結果相似。2011年，上海交通大學新華醫(yī)院管小俊通過動物實驗發(fā)現(xiàn)，肺內輸入MSCs可以降低肺氣腫模型鼠的炎癥因子釋放[13]。Gu YZ團隊通過細胞實驗發(fā)現(xiàn)，hp-MSCs可以降低γ-干擾素(interferon-gamma, IFN-γ)的水平，同時提高IL-10等抗炎因子的水平。目前尚未發(fā)現(xiàn)與本研究結論相反的研究報道[14]。

Th17與Treg細胞之間的平衡對毛細支氣管炎發(fā)生起到重要作用，Treg不僅可以抵御各種病毒入侵，還可抑制機體炎癥反應和增加免疫耐受，起到預防毛細支氣管炎的發(fā)生作用[15-16]。而Th17可以通過分泌IL-17等炎癥介質促進毛細支氣管炎的發(fā)生[17]。而以往研究證實,Foxp3 與 RORγt之間的平衡決定CD4+T細胞的分化方向[18]，F(xiàn)oxp3表達上調可以抑制RORγt表達，繼而促進CD4+T細胞向Treg分化，抑制CD4+T向Th17分化。反之Foxp3表達下調可以上調RORγt表達，繼而抑制CD4+T細胞向Treg分化[19]，促進CD4+T細胞向Th17分化。Foxp3 與 RORγt的穩(wěn)態(tài)受到破壞可以誘導免疫反應的發(fā)生，引起Th17分泌IL-17等炎癥因子增加，引起毛細支氣管炎[20]。本研究結果發(fā)現(xiàn)，RSV病毒干預可以下調Foxp3蛋白和基因，上調RORγt蛋白和基因，引起CD4+T淋巴細胞向Th17分化，促進毛細支氣管炎的發(fā)生。而hp-MSCs的干預可以反轉RSV病毒引起一系列炎癥反應，起到防治毛細支氣管炎的作用。本研究與以往研究結果相似。Obermajer N研究發(fā)現(xiàn)，在器官移植手術中，MSCs可以抑制CD4+T淋巴細胞向Th17細胞轉化，促進向Treg細胞轉化[19]。目前尚未發(fā)現(xiàn)與本研究結論相悖的報道，證明了hp-MSC是通過調節(jié)Th17與Treg細胞平衡達到抑制炎癥因子釋放和促進抗炎因子的分泌，起到防治毛細支氣管炎的作用。本研究同樣存在一些不足，比如以往研究顯示，Th1/Th2的平衡紊亂也可引起毛細支氣管炎[21]，因此，還需進一步觀察hp-MSC對Th1/Th2平衡紊亂的影響。

4 結論

本研究結果顯示，hp-MSCs表達水平降低是引起嬰幼兒毛細支氣管炎的獨立危險因素，hp-MSCs通過調節(jié)Th17/Treg平衡繼而上調Foxp3蛋白和基因的表達，以及下調RORγt蛋白和基因表達,進而起到防治嬰幼兒毛細支氣管炎的作用。

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