任春鳳 段國(guó)慶

(1. 濟(jì)寧市第一人民醫(yī)院風(fēng)濕免疫科, 山東 濟(jì)寧 272000；2. 濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院骨關(guān)節(jié)科， 山東 濟(jì)寧 272000)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)以多個(gè)小關(guān)節(jié)的滑膜炎癥為其主要特征，病理主要為滑膜的炎癥和血管翳的形成，表現(xiàn)為多個(gè)小關(guān)節(jié)的疼痛、腫脹以及畸形，嚴(yán)重者可致殘疾[1-2]。但其發(fā)病病因及機(jī)制目前仍然不十分明了?；|(zhì)細(xì)胞衍生因子-1(stromal cell derived factor 1,SDF-1)是前炎性細(xì)胞因子的一種，主要由骨髓基質(zhì)細(xì)胞分泌，它是炎癥細(xì)胞活化及向滑膜組織遷移過(guò)程中的關(guān)鍵因子，其天然受體是CXC趨化因子受體4(CXC chemokine receptor 4,CXCR4)[3]。研究發(fā)現(xiàn)，關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞也具有產(chǎn)生和分泌SDF-1的能力，而關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞表面可以表達(dá)CXCR4，二者結(jié)合后可引起關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞分泌多種炎性因子,如MMPs、ILs等，并能激活ERK、P38等信號(hào)通路引起炎癥因子的分泌，最終引起軟骨細(xì)胞凋亡和基質(zhì)破壞[4-7]。

SDF-1有兩個(gè)結(jié)構(gòu)異構(gòu)體SDF-1α和SDF-1β，由于二者在結(jié)構(gòu)上的相似性，故具有相似的生物學(xué)效應(yīng)。近年來(lái)大量研究發(fā)現(xiàn)，SDF-1/CXCR4在強(qiáng)直性脊柱炎、皮肌炎以及系統(tǒng)性紅斑狼瘡等自身免疫性疾病的發(fā)生、發(fā)展中有著重要的作用[8-10]。本文擬通過(guò)檢測(cè)SDF-1α和CXCR4在RA患者外周血中的表達(dá)，初步探討其在RA發(fā)病及發(fā)展中的作用及臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 對(duì)照組：25例健康志愿者為2016年1月～3月在我院行健康體檢者，其中女性17例，男性4例，年齡20～65歲，平均(35.3±13.5)歲。 RA患者組：50例RA患者為2016年1月～6月在我院風(fēng)濕免疫科就診的患者，均符合美國(guó)風(fēng)濕病協(xié)會(huì)(ACR)修訂的RA診斷標(biāo)準(zhǔn)(2009年)，女性35例，男性15例，年齡18～64歲，平均(33.8±12.6)歲；病程3～15年，平均(8.5±3.4)年。兩組在性別、年齡方面差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。本研究經(jīng)我院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)，并取得受試者的知情同意。

1.2 主要試劑 鼠抗人單克隆抗體CD3-PerCP/CD4-FITC/CD8-PE、CXCR4-PC、陰性對(duì)照IgG2α-APC及SDF-1α和IL-6 ELISA試劑盒，均購(gòu)自美國(guó)BD(Becton dickins)公司。

1.3 檢測(cè)方法

1.3.1 血液標(biāo)本采集 清晨空腹抽取RA患者的外周靜脈血8 ml，分成2 管，每管4 ml。其中1管血標(biāo)本中加入肝素抗凝，于2 h內(nèi)給予流式細(xì)胞術(shù)檢驗(yàn)；另1管血標(biāo)本離心后取血清，-80℃低溫下保存，行ELISA 檢測(cè)。健康對(duì)照組標(biāo)本采集及處理方法同上。

1.3.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CXCR4的表達(dá) ①各10μl CD3PerCP / CD4FITC / CD8PE及IgG2α-APC熒光抗體一起加入第1支流式管，然后各10μl CD3PerCP / CD4FITC / CD8PE以及CXCR4APC熒光抗體一起加入第2支流式管。②把50μl抗凝全血分別加入以上2支流式管中，混勻，室溫下避光15 min。③每支流式管中分別加入溶血?jiǎng)? ml，搖勻，室溫下避光15 min。④在1000 r/ min離心機(jī)內(nèi)離心5 min，棄去上清液，洗滌，然后用200μl PBS進(jìn)行懸浮細(xì)胞。⑤上機(jī)前準(zhǔn)備。⑥進(jìn)行上機(jī)分析。應(yīng)用流式細(xì)胞儀上的Cellquest軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)獲取和分析。

1.3.3 ELISA法檢測(cè)SDF-1α和IL-6的表達(dá) 嚴(yán)格按照ELISA試劑盒要求進(jìn)行操作，具體方法如下：①加樣：分別加入稀釋好的標(biāo)準(zhǔn)品及待測(cè)樣品各50μl于反應(yīng)孔內(nèi)，然后立即加入50μl生物素標(biāo)記的抗體，37℃溫育1h并洗滌。同時(shí)做空白對(duì)照、陰性對(duì)照及陽(yáng)性對(duì)照。②加入酶標(biāo)抗體：每孔加入80μl親和鏈霉素-HRP，震蕩搖勻，然后37℃溫育30min，并洗滌。③顯色：每孔加入底物①、②各50μl，37℃溫育10min，避免光照。④終止：每孔各加入50μl終止液，然后立即測(cè)定結(jié)果。在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔OD值。

2 結(jié)果

2.1 外周血CXCR4、SDF-1α及IL-6表達(dá)水平 觀察組外周血CD3+CD4+和CD3+CD8+T淋巴細(xì)胞表面CXCR4表達(dá)百分率和血清SDF-1α、IL-6表達(dá)水平均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 兩組患者外周血CXCR4、SDF-1α和IL-6表達(dá)水平Table 1 Comparison of expression of CXCR4 and SDF-1αand IL-6 in peripheral blood

2.2 不同病程RA患者外周血CXCR4及SDF-1α表達(dá)水平 不同病程RA患者外周血CD3+CD4+和CD3+CD8+T淋巴細(xì)胞表面CXCR4表達(dá)百分率和血清SDF-1α表達(dá)水平均存在顯著性差異(P<0.05)；隨著病程的延長(zhǎng)，外周血CD3+CD4+和CD3+CD8+T淋巴細(xì)胞表面CXCR4表達(dá)百分率和血清SDF-1α表達(dá)水平顯著上升(P<0.05)，見(jiàn)表2。

2.3 直線相關(guān)性分析 結(jié)果顯示，外周血CXCR4及SDF-1α表達(dá)水平與IL-6均存在正相關(guān)性(P<0.05)，見(jiàn)表3。

Table2TheexpressionofCXCR4andSDF-1αinperipheralbloodofRApatientswithdifferentcourseofdisease

病程(年)nCD3+CD4+CXCR4(×10?2)CD3+CD8+CXCR4(×10?2)SDF?1α(pg/ml)<5142 09±0 781 89±0 56289 50±67 305～10263 78±1 052 85±0 78313 43±84 22>10106 16±2 085 11±1 29413 49±102 46F5 3036 4998 490P0 0250 0180 010

表3 外周血CXCR4及SDF-1α表達(dá)水平與IL-6的相關(guān)性分析Table 3 Correlation analysis of expression of CXCR4 and SDF-1αwith IL-6 in peripheral blood

3 討論

RA是一種全身性自身免疫性疾病。研究發(fā)現(xiàn)，在受累的器官和組織內(nèi)出現(xiàn)大量的淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等炎細(xì)胞的浸潤(rùn)，尤以關(guān)節(jié)周圍滑膜組織最為明顯，可以引起關(guān)節(jié)滑膜的充血、水腫及增生，最終引起關(guān)節(jié)軟骨的破壞，關(guān)節(jié)畸形直至病廢。

在RA慢性滑膜炎的發(fā)病過(guò)程中，有大量炎細(xì)胞從外周血遷徙至滑膜組織，分泌多種炎性分子，導(dǎo)致滑膜破壞；而趨化因子在炎細(xì)胞的遷徙和浸潤(rùn)過(guò)程中起到了重要的作用。趨化因子作為配體，其家族可分為CXCL、CCL、XCL和CX3CL1 4大類。近年來(lái)，國(guó)外大量研究發(fā)現(xiàn)，多種趨化因子在RA病人的滑液、滑膜組織以及外周血中高表達(dá)，提示其可能與RA的發(fā)病有關(guān)[11-17]。國(guó)內(nèi)石連杰等[18]對(duì)70例活動(dòng)期RA病人進(jìn)行研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，趨化因子配體19(CCL19)在RA患者血清中高表達(dá)，并且與類風(fēng)濕因子(RF)、抗CCP抗體滴度呈明顯正相關(guān)。這與國(guó)外Sellam等[19]人的研究基本一致。

SDF-1屬于CXC類趨化因子，被系統(tǒng)命名為CXCL12(CXC chemokine ligand-12,CXCL-12)，是目前為止唯一能和受體CXCR4結(jié)合的趨化因子。SDF-1/CXCR4結(jié)合后廣泛表達(dá)于各種組織細(xì)胞中，是B淋巴細(xì)胞生長(zhǎng)、發(fā)育過(guò)程中的關(guān)鍵因子，并可促進(jìn)T淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞的遷移，故SDF-1/CXCR4信號(hào)通路在介導(dǎo)炎癥反應(yīng)過(guò)程中起著重要作用。國(guó)外有研究發(fā)現(xiàn)[20]，在RA患者的滑膜組織和滑膜細(xì)胞中，SDF-1的濃度較正常人明顯升高，其受體CXCR4在T淋巴細(xì)胞中的表達(dá)也明顯增高，而CD4+T細(xì)胞在RA的發(fā)生和發(fā)展中有著非常重要的作用。國(guó)內(nèi)張逸彪等[21]通過(guò)檢測(cè)RA患者血清以及關(guān)節(jié)液中的SDF-1濃度水平，并且通過(guò)與外傷截肢者進(jìn)行對(duì)比發(fā)現(xiàn)，在RA患者血清和關(guān)節(jié)液中，SDF-1水平較對(duì)照組明顯升高。祖蓓蓓等[22]通過(guò)對(duì)系統(tǒng)性紅斑狼瘡腎炎患者進(jìn)行研究后發(fā)現(xiàn)，系統(tǒng)性紅斑狼瘡腎炎患者外周血中SDF-1/CXCR4的濃度水平較健康對(duì)照組明顯升高，考慮其可能參與了系統(tǒng)性紅斑狼瘡腎損害的發(fā)病過(guò)程。國(guó)外Kanbe等[23]運(yùn)用新的免疫組化評(píng)分系統(tǒng)，對(duì)使用格里木單抗治療的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者的滑膜組織進(jìn)行研究后發(fā)現(xiàn)，滑膜組織中的SDF-1表達(dá)水平與用CRP計(jì)算的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎28關(guān)節(jié)疾病活動(dòng)指數(shù)(DAS28 CRP)明顯相關(guān)，CXCR4則與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大關(guān)節(jié)破壞和影像學(xué)愈合評(píng)分相關(guān)，表明滑膜組織中SDF-1/CXCR4的表達(dá)與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的疾病活動(dòng)和關(guān)節(jié)破壞密切相關(guān)。國(guó)內(nèi)目前對(duì)SDF-1/CXCR4的研究多集中在骨關(guān)節(jié)炎方面，國(guó)內(nèi)最新研究[24]發(fā)現(xiàn)，SDF-1可以促進(jìn)顳下頜關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎中的MMP-13和IL-β的表達(dá)以及P38MAPK通路的激活，提示SDF-1可能與顳下頜關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病有關(guān)。而李龍滕等[25]通過(guò)對(duì)骨關(guān)節(jié)炎病人的關(guān)節(jié)軟骨進(jìn)行研究后也發(fā)現(xiàn)，SDF-1/CXCR4信號(hào)通路被特異性阻斷劑阻斷后，可以明顯降低關(guān)節(jié)軟骨內(nèi)MMP-3、MMP-9、MMP-13等的表達(dá)，提示SDF-1/CXCR4信號(hào)通路可以通過(guò)促進(jìn)基質(zhì)金屬蛋白酶等因子的表達(dá)，進(jìn)一步引起關(guān)節(jié)軟骨的損傷。本研究結(jié)果顯示，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者外周血CD3+CD4+和CD3+CD8+T淋巴細(xì)胞表面CXCR4表達(dá)百分率和血清SDF-1α表達(dá)水平均顯著高于健康人群(P<0.05)，提示SDF-1α/CXCR4信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可能參與了類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病過(guò)程。SDF-1α及其受體CXCR4是表達(dá)最廣泛的趨化因子和受體之一，當(dāng)SDF-1α/CXCR4表達(dá)水平上升時(shí)，其可通過(guò)招募、趨化并活化免疫細(xì)胞，導(dǎo)致免疫系統(tǒng)過(guò)度激活，分泌更多的自身抗體和致炎因子，這可能是SDF-1α/CXCR4參與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎發(fā)病過(guò)程的機(jī)制之一。

本研究發(fā)現(xiàn)，隨著病程的延長(zhǎng)，外周血CD3+CD4+和CD3+CD8+T淋巴細(xì)胞表面CXCR4表達(dá)百分率和血清SDF-1α表達(dá)水平顯著上升(P<0.05)，表明類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎病程越長(zhǎng)，SDF-1α/CXCR4表達(dá)水平越高。饒?jiān)伱返萚26]報(bào)道稱，SDF-1α/CXCR4在系統(tǒng)性紅斑狼瘡血液系統(tǒng)損害的發(fā)病過(guò)程中起重要作用，存在血液系統(tǒng)損害的系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者外周血SDF-1α/CXCR4水平顯著上升。隨著類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎疾病的進(jìn)展，外周血SDF-1α/CXCR4表達(dá)水平隨之上升，參與了類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的疾病進(jìn)展過(guò)程。IL-6是一種重要的促炎癥細(xì)胞因子，有研究發(fā)現(xiàn)，IL-6是通過(guò)增加TNF-α和IL-1等致炎因子的作用而發(fā)揮作用，被認(rèn)為是這些炎癥因子的放大因子，并且能促進(jìn)B淋巴細(xì)胞的增殖和分化[27]。本研究顯示，外周血CXCR4及SDF-1α表達(dá)水平與IL-6均存在正相關(guān)性(P<0.05)，表明SDF-1α及CXCR4與IL-8存在某種協(xié)同關(guān)系，共同參與了類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病進(jìn)展過(guò)程。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果顯示，SDF-1α/CXCR4信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與IL-6存在協(xié)同效應(yīng)，可能共同參與了類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病和發(fā)展過(guò)程。但由于本研究樣本數(shù)量有限，存在一定的局限性，該結(jié)論尚需進(jìn)一步證實(shí)。

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