王 丹,董紅敬,楊 鵬,王 曉,耿巖玲,*

(1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,山東泰安 271018;2.齊魯工業(yè)大學(xué)(山東省科學(xué)院),山東省分析測(cè)試中心,山東省中藥質(zhì)量控制技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山東濟(jì)南 250014;3.濟(jì)南森康三峰生物工程有限公司,山東濟(jì)南 250014)

分心木(DiaphragmajuglandisFructus)為胡桃科植物胡桃(JuglansregiaL.)果核內(nèi)的干燥木質(zhì)隔膜,是新疆維吾爾族傳統(tǒng)藥物之一,其特點(diǎn)為味苦、澀,性平,入脾、腎二經(jīng)。分心木的功效在《本草再新》、《全國(guó)中草藥匯編》中均有記載,常用于腎虛[1]、遺精滑瀉、尿頻遺尿、慢性腎功能不全和慢性腎炎[2]等疾病的治療;將分心木與其他藥物配伍,還可以治療失眠多夢(mèng)、牙齦出血、口腔潰瘍、多汗[3]等。分心木中主要含有揮發(fā)油類、酚酸類、黃酮類、蒽醌類、皂苷類等化合物[4-5]。

近年來(lái),有關(guān)分心木化學(xué)成分系統(tǒng)研究的報(bào)道較少,分離鑒定物質(zhì)成分不全面。藥理活性研究表明:分心木乙醇、正丁醇和水提取物均可不同程度的改善腎陽(yáng)虛小鼠模型的狀況[6],分心木甲醇、乙醇和石油醚提取液均具有較好的抗菌效能[7],分心木中總皂苷和總黃酮均具有較強(qiáng)的抗氧化活性[8],分心木乙酸乙酯和正丁醇提取物均具有較強(qiáng)的抗腫瘤作用[9]。這些研究主要針對(duì)分心木的提取物,藥效物質(zhì)基礎(chǔ)大多不明確,單體成分有待于進(jìn)一步研究與開(kāi)發(fā)。此外,在核桃的生產(chǎn)加工中,核桃仁因具有極高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值,產(chǎn)生了大量的分心木;但是目前關(guān)于分心木的利用研究較少,造成了資源的大量浪費(fèi)。因此,為增加核桃副產(chǎn)物的附加值,使資源可持續(xù)利用,有必要對(duì)分心木化學(xué)成分進(jìn)行系統(tǒng)研究。

本課題組前期已經(jīng)對(duì)分心木的乙酸乙酯部位化學(xué)成分進(jìn)行了系統(tǒng)研究和報(bào)道[10],本研究在前期工作基礎(chǔ)上利用現(xiàn)代色譜技術(shù)和分離純化方法對(duì)分心木的石油醚部位和水部位化學(xué)成分進(jìn)一步深入系統(tǒng)研究,并通過(guò)先進(jìn)的波譜技術(shù)對(duì)化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定解析,為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用核桃屬植物資源,深入了解其藥用活性成分奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

分心木 采自安徽亳州藥材市場(chǎng),經(jīng)鑒定為胡桃科植物胡桃(JuglansregiaL.)果核內(nèi)的木質(zhì)隔膜;甲醇 色譜純,海洋石油化工有限公司;水(HPLC) 娃哈哈飲用水有限公司;95%乙醇 淄博丹陽(yáng)化工有限公司;石油醚、乙酸乙酯 分析純,濟(jì)南禹安化工有限公司;甲酸 色譜純,天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。

Waters 2695型高效液相色譜儀 配有YMC-PEAK ODS-A分析型色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)Waters公司;普源L-3000高效液相色譜儀 配有YMC-PEAK ODS-A半制備型色譜柱(250 mm×10.0 mm,5 μm),北京普源精電科技有限公司;Agilent 1200 RRLC-6410 QQQ-MS/MS質(zhì)譜儀 Agilent公司;INOVA-400型核磁共振波譜儀 Varian公司;R-3型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 瑞士Buchi公司;柱色譜硅膠(200～300 目) 青島鼎康硅膠有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 粗提物的制備 參考文獻(xiàn)[5,11]的提取方法,取分心木9 kg,粉碎,過(guò)80目篩,用95%乙醇水溶液80 ℃加熱回流提取2次,每次2 h,料液比1∶4 (w/v),合并提取液并減壓濃縮得乙醇提取物;加水混懸后依次用等體積的石油醚、乙酸乙酯萃取6次,合并每部分萃取液,分別通過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在真空度60 hPa、水浴溫度55 ℃的條件下減壓濃縮干燥至浸膏狀,得石油醚部位(195.68 g)、乙酸乙酯部位(47.27 g)和水部位(98.21 g),其含水率分別為石油醚部位0.7%、乙酸乙酯部位4.5%和水部位6.5%。

1.2.2 分離純化

1.2.2.1 石油醚部位 取石油醚部位浸膏40 g,經(jīng)硅膠柱色譜分離,依次用石油醚-乙酸乙酯(10∶0,8∶2,5∶5,2∶8,0∶10)進(jìn)行梯度洗脫,共得到20個(gè)餾分(FS.1～FS.20)。其中FS.7和FS.10分別通過(guò)半制備高效液相色譜進(jìn)行分離,采用甲醇-水(60∶40,V/V)等度洗脫,得到化合物1(10.2 mg)和化合物2(10.4 mg);FS.12通過(guò)半制備高效液相色譜進(jìn)行分離,采用甲醇-水(50∶50,V/V)等度洗脫,得到化合物3(3.3 mg)和化合物4(1.9 mg)。

1.2.2.2 水部位 取水部位浸膏98 g,經(jīng)MCI柱色譜分離,依次用甲醇-水(5%、30%、60%、80%、100%)進(jìn)行梯度洗脫,共得到12個(gè)餾分(Fr.1～Fr.12)。其中Fr.3(3.33 g)和Fr.4(5.47 g)分別通過(guò)反相C18中壓柱色譜進(jìn)行分離,分別依次用甲醇-水(5%、10%、20%、30%、40%)進(jìn)行梯度洗脫。Fr.3的5%甲醇洗脫部位(0.26 g)通過(guò)半制備高效液相色譜進(jìn)行分離,采用甲醇-水(18∶82,V/V)等度洗脫,得到化合物5(11.50 mg);Fr.3的30%甲醇洗脫部位(0.15 g)通過(guò)半制備高效液相色譜進(jìn)行分離,采用甲醇-水(35∶65,V/V)等度洗脫得到化合物6(4.5 mg)和化合物7(14.80 mg)。Fr.4的5%甲醇部位(0.10 g)通過(guò)半制備高效液相色譜進(jìn)行分離,采用甲醇-水(10∶90,V/V)等度洗脫,得到化合物8(36.80 mg);Fr.4的20% 甲醇洗脫部位(0.34 g)通過(guò)半制備高效液相色譜進(jìn)行分離,采用甲醇-水(15∶85,V/V)等度洗脫,得到化合物9(11.4 mg)。

1.2.3 結(jié)構(gòu)鑒定 采用質(zhì)譜儀和核磁共振波譜儀對(duì)化合物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定。質(zhì)譜條件:離子源:電噴霧離子化源(ESI);模式:正、負(fù)離子模式;掃描范圍:m/z為100～1000;噴霧氣壓:30 psi;干燥氣流速:10.0 L/min;干燥氣溫度:350 ℃。核磁條件:根據(jù)Varian INOVA-400型核磁共振波譜儀和Varian INOVA-600型核磁共振波譜儀的相應(yīng)參數(shù)設(shè)置,以TMS為內(nèi)標(biāo)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

質(zhì)譜數(shù)據(jù)通過(guò)Agilent Mass Hunter Qualitative Analysis軟件處理,獲得各化合物的分子量信息。核磁共振波譜數(shù)據(jù)通過(guò)MestReNova軟件處理,獲得相應(yīng)的1H-NMR和13C-NMR信息。

2 結(jié)果與分析

化合物1:ESI-MS:m/z219[M+H]+;1H-NMR(CD3OD,400 MHz)δ:7.64(1H,d,J=7.6 Hz,H-8),7.60(1H,d,J=2.0 Hz,H-7),7.26(1H,dd,J=7.6,1.8 Hz,H-6),6.20(1H,s,H-3),4.13(2H,q,J=7.0 Hz,H-1′),1.48(3H,t,J=7.2 Hz,H-2′);13C-NMR(CD3OD,100 MHz)δ:191.1(C-4),179.5(C-1),160.7(C-5),160.5(C-2),135.2(C-7),131.3(C-9),124.3(C-6),118.7(C-8),114.0(C-10),109.4(C-3),65.5(C-1′),12.8(C-2′)。該化合物氫譜、碳譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[12]報(bào)道的2-乙氧基胡桃醌數(shù)據(jù)基本一致,故鑒定化合物1為2-乙氧基胡桃醌。

化合物2:ESI-MS:m/z357[M+H]+,355[M-H]-;1H-NMR(CD3OD,400 MHz)δ:6.89(1H,d,J=6.4 Hz,H-5),6.87(1H,d,J=6.4 Hz,H-18),6.65(1H,dd,J=8.2,2.0 Hz,H-19),6.43(1H,d,J=8.0 Hz,H-6),5.55(1H,d,J=2.0 Hz,H-15),2.64(1H,m,H-13a),2.95(1H,m,H-13b),2.31(2H,m,H-12),2.21(2H,m,H-10),1.52(2H,m,H-9),1.81(1H,m,H-8a),1.66(1H,m,H-8b),3.17(1H,m,H-7a),2.36(1H,m,H-7b),3.89(3H,s,2-OCH3),3.81(3H,s,17-OCH3)。13C-NMR(CD3OD,100 MHz)δ:211.6(C-11),149.6(C-16),149.4(C-3),146.6(C-1),146.5(C-17),140.7(C-2),134.3(C-14),125.9(C-5),125.7(C-4),121.4(C-19),114.5(C-6),112.9(C-15),112.4(C-18),45.8(C-10),40.6(C-12),29.8(C-7),26.6(C-13),24.0(C-8),18.8(C-9),60.3(2-OCH3),55.5(17-OCH3)。該化合物氫譜、碳譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[13-15]報(bào)道的胡桃苷A數(shù)據(jù)基本一致,故鑒定化合物2為胡桃苷A。

化合物3:ESI-MS:m/z179[M+H]+,201[M+Na]+,分子式為C10H10O3;1H-NMR(CDCl3,600 MHz)δ:12.43(1H,s,OH-8),7.52(1H,dd,J=8.4 Hz,7.8 Hz,H-6),7.04(1H,d,J=7.8 Hz,H-5),6.95(1H,d,J=8.4 Hz,H-7),4.94(1H,dd,J=7.8,3.6 Hz,H-4),3.02(1H,m,H-2b),2.67(1H,m,H-2a),2.37(1H,m,H-3b),2.21(1H,m,H-3a);13C-NMR(CDCl3,150 MHz)δ:204.3(C-1),34.6(C-2),31.2(C-3),67.7(C-4),145.9(C-4a),117.8(C-5),137.0(C-6),117.4(C-7),162.8(C-8),115.3(C-8a)。該化合物氫譜、碳譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[11,16]報(bào)道的4,8-二羥基-1-四氫萘醌數(shù)據(jù)基本一致,故鑒定化合物3為4,8-二羥基-1-四氫萘醌。

化合物4:ESI-MS:m/z209.1[M+H]+,231.1[M+Na]+,417.2[2M-H]+,439.2[2M+Na]+;1H-NMR(CDCl3,600 MHz)δ:5.87(1H,s,H-4),2.57(1H,m,H-8a),2.54(1H,m,H-8b),2.39(1H,d,J=17.4 Hz,H-2a),2.18(3H,s,10-CH3),2.07(1H,d,J=17.4 Hz,H-2b),2.03(3H,m,13-CH3),2.00(1H,m,H-7a),1.91(1H,t,J=5.6 Hz,H-6),1.73(1H,m,H-7b),1.08(3H,s,12-CH3),1.04(3H,s,11-CH3)。13C-NMR(CDCl3,150 MHz)δ:207.6(C-9),199.1(C-3),164.7(C-5),125.6(CH,C-4),50.1(CH,C-6),47.0(CH2,C-2),42.5(C-1),36.3(CH2,C-8),30.1(CH3,C-10),28.8(CH3,C-11),27.3(CH3,C-12),24.6(CH2,C-7),23.5(CH3,C-13)。該化合物氫譜、碳譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[17]報(bào)道的4-megastigmen-3,9-dione數(shù)據(jù)基本一致,故鑒定化合物4為4-megastigmen-3,9-dione。

化合物5:ESI-MS:m/z339[M+H]+,361[M+Na]+,399[2M+Na]+;1H-NMR(DMSO-d6,400 Hz)δ:9.99(-OH),7.54(2H,d,J=8.4 Hz,H-2,6),7.51(1H,d,J=15.8 Hz,H-α),6.80(2H,d,J=8.4 Hz,H-3,5),6.33(1H,d,J=15.8 Hz,H-β),5.18(1H,dt,H-3′),4.89(1H,s,C4′-OH),4.88(1H,s,C1′-OH),3.86(1H,m,H-5′),3.55(1H,d,J=3.2 Hz,H-4′),1.92(3H,m,H-2′a,e,6′e),1.74(1H,m,H-6′a)。13C-NMR(DMSO-d6,100 Hz)δ:176.54(-COOH),166.61(C=O),160.09(C-4),144.48(C-α),130.53(C-2,6),125.76(C-1),116.26(C-3,5),115.73(C-β),73.37(C-1′),71.64(C-5′),71.44(C-3′),67.81(C-4′),38.71(C-6′),35.58(C-2′)。該化合物氫譜、碳譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[18]報(bào)道的3′-O-(E-4-coumaroyl)-quinic acid數(shù)據(jù)基本一致,故鑒定化合物5為3′-O-(E-4-coumaroyl)-quinic acid。

化合物6:ESI-MS:m/z281[M-H]-,分子式為C15H22O5;1H-NMR(CD3OD,400 MHz)δ:7.88(1H,d,J=15.2 Hz,H-4),6.39(1H,d,J=15.2 Hz,H-5),5.68(3H,s,H-2),3.90(1H,m,H-9),3.63(1H,d,J=7.2 Hz,H-12a),3.55(1H,d,J=7.2 Hz,H-12b),1.86(1H,dd,J=13.6,6.8 Hz,H-8a),1.70(1H,dd,J=13.6,6.8 Hz,H-8b),1.61(1H,dd,J=13.2,10.4 Hz,H-10a),1.53(1H,dd,J=13.2,10.4 Hz,H-10b),1.99(3H,s,H-15),1.00(3H,s,H-14),0.80(3H,s,H-13)。13C-NMR(CD3OD,100 MHz)δ:167.9(C-1),119.6(C-2),148.7(C-3),130.1(C-4),134.9(C-5),81.9(C-6),86.2(C-7),45.9(C-8),64.3(C-9),44.4(C-10),48.5(C-11),75.8(C-12),16.6(C-13),20.0(C-14),21.2(C-15)。該化合物氫譜、碳譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[19]報(bào)道的二氫紅花菜豆酸數(shù)據(jù)基本一致,故鑒定化合物6為二氫紅花菜豆酸。

化合物7:ESI-MS:m/z339[M+H]+;1H-NMR(DMSO-d6,400 Hz)δ:10.02(-OH),7.55(2H,d,J=8.4 Hz,H-2,6),7.52(1H,d,J=15.8 Hz,H-α),6.80(2H,d,J=8.4 Hz,H-3,5),6.35(1H,d,J=15.8 Hz,H-β),5.45(1H,s,C3′-OH),5.17(1H,dt,H-5′),4.94(1H,s,C4′-OH),4.80(1H,s,C1′-OH),3.80(1H,m,H-3′),3.62(1H,s,H-4′),1.99(3H,m,H-2′a,e,6′e),1.84(1H,m,H-6′a)。13C-NMR(DMSO-d6,100 Hz)δ:174.67(-COOH),166.51(-CO),160.19(C-4),144.62(C-7),130.58(C-2,6),125.69(C-1),116.26(C-3,5),115.55(C-8),73.15(C-1′),70.87(C-5′),70.35(C-3′),68.24(C-4′),38.71(C-6′),35.36(C-2′)。該化合物氫譜、碳譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[18]報(bào)道的5′-O-(E-4-coumaroyl)-quinic acid數(shù)據(jù)基本一致,故鑒定化合物7為5′-O-(E-4-coumaroyl)-quinic acid。

化合物8:ESI-MS:m/z 353[M+Na]+,分子式為C14H18O9;1H-NMR(DMSO-d6,400 MHz)δ:7.51(1H,dd,J=8.4,2.0 Hz,H-6),7.48(1H,d,J=1.6 Hz,H-2),7.16(1H,d,J=8.4 Hz,H-5),5.04(1H,d,J=7.2Hz,H-1′),3.81(3H,s,-OCH3),3.45(2H,m,H-6′a,6′b),3.15-3.30(4H,m,H-2′,3′,4′,5′)。13C-NMR(DMSO-d6,100 MHz)δ:167.5(C-7),150.7(C-4),148.9(C-3),124.6(C-1),123.3(C-6),114.8(C-5),113.2(C-2),100.0(C-1′),77.5(C-5′),77.3(C-3′),73.6(C-2′),70.0(C-4′),61.1(C-6′),56.1(-OCH3)。該化合物氫譜、碳譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[20-22]報(bào)道的香草酸4-O-β-D-葡萄糖苷數(shù)據(jù)基本一致,故鑒定化合物8為香草酸4-O-β-D-葡萄糖苷。

化合物9:ESI-MS:m/z443.1[M-H]-,分子式為C21H32O10;1H-NMR(DMSO-d6,400 Hz)δ:7.89(1H,d,J=15.6 Hz,H-4),6.55(1H,d,J=15.6 Hz,H-5),5.77(1H,s,H-2),5.39(1H,d,J=8.0 Hz,H-1′),3.91(1H,m,H-9),3.64(2H,m,H-6′),3.89(2H,m,H-12),3.46(1H,d,J=5.6 Hz,H-5′),3.43(1H,d,J=5.6 Hz,H-3′),3.25(1H,d,J=8.8 Hz,H-2′),3.21(1H,d,J=7.6Hz,H-4′),3.14(1H,m,H-11),2.08(3H,s,H-15),1.87(1H,m,H-8),1.71(1H,m,H-10),1.62(1H,m,H-8),1.53(1H,m,H-10),1.01(3H,s,H-14),0.81(3H,s,H-13)。13C-NMR(DMSO-d6,100 Hz)δ:164.28(C-1),153.02(C-3),137.30(C-5),129.71(C-4),116.51(C-2),94.33(C-1′),86.24(C-7),82.01(C-6),78.34(C-3′),77.06(C-5′),75.83(C-12),72.87(C-2′),70.01(C-4′),64.32(C-9),61.07(C-6′),48.61(C-11),45.96(C-8),44.38(C-8),21.31(C-15),19.99(C-14),16.54(C-13)。該化合物氫譜、碳譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[23]報(bào)道的litchiol A數(shù)據(jù)基本一致,故鑒定化合物9為litchiol A。

從石油醚部位浸膏分離出的物質(zhì)(化合物1,2,3,4)多為醌類及其衍生物,極性較小;而乙酸乙酯萃取后的水部位浸膏分離出的物質(zhì)(化合物5,6,7,8,9)多為羧酸類,極性較大,分離難度大。根據(jù)化合物的性質(zhì),對(duì)石油醚部位浸膏采用堿性硅膠柱色譜洗脫,乙酸乙酯萃取后的水部位浸膏采用MCI和反相C18中壓半制備柱色譜相結(jié)合的方法進(jìn)行分離,但所得化合物純度都不高,需要進(jìn)一步純化。最終我們采用高效液相色譜制備的方法進(jìn)行純化,大大減少了醌類和羧酸類化合物的損失。

3 結(jié)論

分心木乙醇提取物的石油醚部位浸膏和水部位浸膏,經(jīng)多種柱色譜分離純化,根據(jù)高效液相色譜檢測(cè)其純度,得到了9個(gè)高純度的化合物,應(yīng)用質(zhì)譜和核磁共振波譜闡明其化學(xué)結(jié)構(gòu),分別鑒別為2-乙氧基胡桃醌(1)、胡桃苷A(2)、4,8-二羥基-1-四氫萘醌(3)、4-megastigmen-3,9-dione(4)、3′-O-(E-4-coumaroyl)-quinic acid(5)、二氫紅花菜豆酸(6)、5′-O-(E-4-coumaroyl)-quinic acid(7)、香草酸4-O-β-D-葡萄糖苷(8)和litchiol A(9),其中化合物4,5,7,8和9為首次從核桃種屬植物中分離得到。分心木的石油醚部位和水部位存在多種醌類和羧酸類化合物,實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步豐富了分心木的化學(xué)成分,為下一步的藥理活性研究奠定基礎(chǔ),對(duì)于深入了解該種藥用植物的活性成分與藥用價(jià)值具有重要意義。