王 旗,任夢婷,石亞男,芶明麗,張鳳玲,劉婭芳,魏在榮,王達利,徐尚福

(1.遵義醫(yī)學(xué)院 美容醫(yī)學(xué)系，貴州 遵義 563099；2.遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 燒傷整形外科， 貴州 遵義 563099;3.遵義醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)藥理教育部重點實驗室暨特色民族藥教育部國際合作聯(lián)合實驗室，貴州 遵義 563099)

痤瘡常發(fā)于青少年，是一種慢性炎癥性損容性皮膚病，痤瘡發(fā)生后常遺留色素沉著，毛孔粗大，甚至形成瘢痕，給患者的容貌及心理帶來巨大壓力。研究認(rèn)為淋巴細(xì)胞、異物巨細(xì)胞浸潤構(gòu)成的慢性炎癥過程[1-2]，性激素分泌紊亂和皮脂腺內(nèi)正常菌群(主要是痤瘡丙酸桿菌)的大量繁殖、皮脂腺導(dǎo)管的異常角化，皮脂的大量分泌等都會導(dǎo)致痤瘡的發(fā)生[3-4]。目前痤瘡的治療方法主要有光療法、外用藥膏、口服中藥等。但由于現(xiàn)有的治療手段價格昂貴、毒副作用大、治療周期長，加之患者本身的不重視，使痤瘡惡化發(fā)展為瘢痕，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量給患者帶來巨大的精神壓力[5]。因此，尋找一種簡單、經(jīng)濟、有效的治療痤瘡的藥物，具有重要意義。

龍眼葉為無患子科龍眼屬植物龍眼(DimocarpuslonganLour.)的葉，以葉入藥，主要化學(xué)成分有黃酮類、酚類、香豆素類、揮發(fā)油、植物甾醇、糖類、苷類、鞣質(zhì)、有機酸等[6]。龍眼葉提取物具有清除自由基和提高細(xì)胞免疫力等藥理作用[7]。《全國中草藥匯編》記載，龍眼葉可清熱解毒，解表利濕[8]，民間亦有龍眼葉水煎治療痤瘡的應(yīng)用。然而對龍眼葉治療痤瘡的實驗研究未見報道。因此，本實驗就龍眼葉提取物對兔耳痤瘡模型進行研究，為龍眼葉提取物對痤瘡的治療作用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 新西蘭兔，48只，雌雄各半，購自重慶第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院實驗動物中心，體重1.5～2.5 kg，許可證號：SCX K(軍)2007-017。

1.2 試劑 痤瘡丙酸桿菌從中科院微生物研究所購入，菌號112236；供試品的龍眼葉提取物購自南京澤朗植物提取有限公司；維甲酸乳膏為四川明欣藥業(yè)有限公司產(chǎn)品；濃齒輪油液為?？松梨谑陀邢薰井a(chǎn)品；白介素-1β(IL-1β，批號：AF06298501)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α，批號：AF06245761)抗體購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；DAB染色試劑盒購自基因科技有限公司，產(chǎn)品貨號GK600705，批號：2016090101。兔IL-1β、TNF-α ELISA試劑盒購自南京建成生物工程研究所(批號分別為：20160723、20160725)。

1.3 儀器設(shè)備 自動脫水機，為德國Leica公司產(chǎn)品，型號為ASP 300；石蠟包埋機，為德國Lecia 公司產(chǎn)品，型號為EG1160；平推式切片機，為德國Lecia 公司產(chǎn)品，型號為Microm HM400R；病理圖像分析系統(tǒng)由日本OLYMPUS顯微鏡和JVC攝像儀組成，型號分別為BX40 和TK-C1381。

1.4 方法

1.4.1 痤瘡丙酸桿菌菌液制備 凍干的痤瘡丙酸桿菌在厭氧條件下，以硫乙醇鈉培養(yǎng)基増菌后，以生理鹽水洗滌3次，調(diào)整丙酸桿菌濃度為6×103個/L，95 ℃下水浴滅活15 min。

1.4.2 龍眼葉提取物外用溶液制備 本研究中藥物劑量參考龍眼葉民間用藥劑量和藥典龍眼肉臨床推薦使用劑量，按4∶2∶1比例配制龍眼葉提取物成高、中、低濃度。即濃度設(shè)定為0.2、0.1、0.05g /mL，局部外用。

1.4.3 分組及給藥 新西蘭兔48只，雌雄各半，按體重和性別隨機分成6組：空白對照組、模型組、龍眼葉提取物(0.05、0.1、0.2 g/mL)組及維甲酸(0.1%)組，每組8只。各組新西蘭兔(除空白對照組外)均于左耳內(nèi)側(cè)面耳管開口處約3 cm×3 cm范圍，涂抹濃齒輪油液每天1次，連續(xù)35 d。涂抹濃齒輪油后第22天和第29天，在每只兔耳廓皮內(nèi)注射痤瘡丙酸桿菌液1 mL。從第36天開始各實驗組新西蘭兔開始按設(shè)定濃度局部給藥，連續(xù)2周。給藥同時按前述造模方法繼續(xù)涂抹齒輪油，6 h后局部給藥。末次給藥后用氨基甲酸乙酯(20%)耳緣靜脈注射麻醉新西蘭兔，頸總動脈插管取血，空氣栓塞法處死后剪取造模處耳組織保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.4 兔耳痤瘡形態(tài)學(xué)觀察 肉眼觀察兔耳造模處皮膚的變化(包括：耳厚度、硬度、粗糙程度及黑角栓)，并拍照。剪取的兔耳組織用10 %甲醛溶液固定，對固定后的兔耳組織進行修剪、包埋、切片、蘇木素-伊紅染色、封片，顯微鏡下觀察兔耳組織表皮層和真皮淺層厚度、細(xì)胞形態(tài)及排列，有無炎細(xì)胞浸潤等。

1.4.5 ELISA技術(shù)檢測兔外周血中IL-1β和TNF-α的含量 外周血950 ×g離心后獲得血清。①酶標(biāo)包被板底部加樣品血清50 μL，含梯度標(biāo)準(zhǔn)品及空白對照，輕晃混勻；②封板膜封板后置37 ℃溫育30 min；③棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液洗滌，靜置30 s后棄去，如此重復(fù)5次，拍干；④每孔加入酶標(biāo)試劑50 μL，空白孔除外，溫育30 min后洗滌；⑤每孔先后加入顯色劑A、B各 50 μL，輕輕震蕩混勻，37 ℃避光顯色10 min；⑥每孔加入終止液50 μL，終止反應(yīng)，450 nm波長進行酶標(biāo)檢測。

1.4.6 免疫組化法檢測兔耳造模處IL-1β和TNF-α蛋白表達 ①石蠟切片后60 ℃烘烤10 min，二甲苯及梯度酒精脫蠟水化，PBS沖洗。②檸檬酸鹽抗原修復(fù)20 min，自然冷卻后，PBS沖洗。3 %過氧化氫溶液避光15 min后，PBS沖洗。③加入10 %山羊血清置于37 ℃封閉1 h，甩掉并滴加一抗(1∶200)置于37 ℃溫育2 h，PBS沖洗。滴加二抗，室溫30 min，PBS沖洗。④配制DAB工作液(1∶50)，光鏡下控制顯色。⑤蘇木素復(fù)染后， 分別過1%鹽酸酒精，水沖，梯度酒精脫水、二甲苯透明。⑥自然風(fēng)干，封片，顯微鏡觀察。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計 所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0進行單因素方差分析，P<0.05和P<0.01認(rèn)為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 龍眼葉提取物對兔耳痤瘡模型改善的肉眼觀察 肉眼觀察各組兔耳痤瘡模型，空白對照組可見耳厚正常，硬度、粗糙程度正常，毛囊口無黑角栓。造模后可見耳部造模處皮膚增厚，粗糙，痤瘡形成，紅腫、糜爛明顯。治療后，與模型組比較，龍眼葉提取物及維甲酸局部給藥后，皮膚增厚及粗糙表現(xiàn)改善，紅腫程度減輕，皮膚表面糜爛好轉(zhuǎn)(見圖1)。

圖1 龍眼葉提取物對兔耳痤瘡模型改善的肉眼觀察

2.2 龍眼葉提取物對兔耳痤瘡模型改善的組織病理學(xué)觀察 組織病理學(xué)HE染色觀察發(fā)現(xiàn)，空白對照組各層細(xì)胞排列規(guī)則、緊密，無增厚等異常形態(tài)，真皮層內(nèi)單一核細(xì)胞浸潤。模型組各層細(xì)胞排列紊亂，角質(zhì)層角化過度，顆粒層和棘層也相應(yīng)增厚，毛囊角化過度，內(nèi)有角栓形成，真皮淺層和毛囊周圍有較多中性粒細(xì)胞浸潤。龍眼葉提取物給藥后對痤瘡形成有較好的抑制作用，龍眼葉提取物0.2 g/mL和0.1g/mL組的表皮厚度明顯減輕，各層細(xì)胞排列近乎規(guī)則，炎細(xì)胞浸潤明顯減少。維甲酸組和龍眼葉提取物0.05 g/mL組有不同程度改善(見圖2)。

箭頭所指為角化毛囊及增厚的顆粒層及棘層。圖2 龍眼葉提取物對兔耳痤瘡模型改善的組織病理學(xué)觀察

2.3 龍眼葉提取物對兔耳痤瘡模型外周血IL-1β和TNF-α含量的影響 兔耳痤瘡模型外周血ELISA結(jié)果顯示，模型組IL-1β和TNF-α含量明顯升高，而龍眼葉提取物0.2 g/mL和0.1g/mL組及維甲酸組可降低外周血中IL-1β和/或TNF-α含量(見圖3)。

vs空白對照，*P<0.05,**P<0.01; vs模型，#P<0.05,##P<0.01。圖3 龍眼葉提取物對兔耳痤瘡模型外周血IL-1β和TNF-α含量的影響

2.4 龍眼葉提取物對兔耳痤瘡模型部位IL-1β和TNF-α蛋白表達的影響 兔耳痤瘡模型免疫組化結(jié)果可見，表皮細(xì)胞內(nèi)棕黃色部位為抗原陽性表達部位，抗體表達定位于表皮細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)。與空白對照組比較，模型組兔耳痤瘡模型部位IL-1β和TNF-α蛋白表達明顯增加；龍眼葉提取物不同給藥濃度組及維甲酸組可不同程度降低兔耳痤瘡模型部位IL-1β和TNF-α蛋白表達 (見圖4～6)。

圖4 龍眼葉提取物對兔耳痤瘡模型部位IL-1β蛋白表達的影響

圖5 龍眼葉提取物對兔耳痤瘡模型部位TNF-α蛋白表達的影響

vs空白對照，**P<0.01; vs模型，#P<0.05,##P<0.01。圖6 龍眼葉提取物對兔耳痤瘡模型部位IL-1β和TNF-α蛋白表達的影響

3 討論

痤瘡是侵犯毛囊皮脂腺單元的一種疾病，在正常的代謝過程中，毛囊皮脂腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞脫屑，皮脂腺攜帶脫屑從毛囊口排出，毛囊中寄生著大量的皮膚正常菌群，例如痤瘡丙酸桿菌、需氧葡萄球菌等。皮脂大量分泌或皮脂腺導(dǎo)管異常角化等原因引起毛囊堵塞，毛囊內(nèi)的菌群分解瘀滯的皮脂，產(chǎn)生游離脂肪酸，刺激毛囊產(chǎn)生炎癥。痤瘡好發(fā)于皮脂溢出部位，如顏面、前胸、后背。常表現(xiàn)為閉合性(白頭)和開放性(黑頭)粉刺。在粉刺基礎(chǔ)上形成丘疹、膿皰、囊腫、結(jié)節(jié)，嚴(yán)重的可形成瘢痕。兔耳模型是最常用的痤瘡藥物抗角化實驗?zāi)Ｐ椭?，該模型?941年發(fā)現(xiàn)，是研究痤瘡比較公認(rèn)的模型之一[9-10]。本研究利用濃齒輪油和痤瘡丙酸桿菌復(fù)制兔耳痤瘡模型，模型成功。

痤瘡治療臨床多以抗生素、抑制皮脂分泌和內(nèi)分泌調(diào)節(jié)藥物治療為主。文獻報道龍眼葉提取物具有抗痤瘡的潛在作用，王力等[11]從龍眼葉中分離出8個多酚類化合物，經(jīng)波譜分析為鞣花酸、3,4-二甲基鞣花酸、兒茶素、沒食子酸乙酯、沒食子酸、山柰酚、槲皮素和山柰酚-3-o-鼠李糖等。龍眼葉具有清熱解毒，解表利濕的功效。研究發(fā)現(xiàn)龍眼葉提取物可用于預(yù)防流行性感冒，流行性腦脊髓膜炎，感冒，腸炎；外用還可治陰囊濕疹[8]。本實驗發(fā)現(xiàn)，龍眼葉提取物和陽性藥維甲酸均可改善兔耳痤瘡模型的皮膚增厚、粗糙、紅腫、糜爛癥狀，可改善皮膚角質(zhì)層角化和炎癥細(xì)胞浸潤，提示龍眼葉提取物具有一定治療痤瘡作用。

痤瘡的發(fā)生與炎癥密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)炎癥早期粉刺腔內(nèi)有中性粒細(xì)胞存在。而炎癥的晚期，中性粒細(xì)胞導(dǎo)致毛囊壁破壞，斷裂，使毛囊壁斷裂，產(chǎn)生真皮損傷。此外，由淋巴細(xì)胞、異物巨細(xì)胞浸潤構(gòu)成的慢性炎癥過程也參與痤瘡的發(fā)生[11]。激素與皮脂腺內(nèi)菌群與炎癥及痤瘡也有密切關(guān)系[2,12-13]。痤瘡丙酸桿菌細(xì)胞壁的肽聚糖-多糖片段可能是涉及免疫反應(yīng)的主要部位，刺激免疫細(xì)胞產(chǎn)生 TNF-α和 IL-1β等促炎癥因子，痤瘡的腫脹程度跟體內(nèi)的IL-1β和TNF-α的含量呈正比[1,14-17]。 本實驗發(fā)現(xiàn)，龍眼葉提取物和陽性藥維甲酸可降低模型組引起的新西蘭兔外周血中IL-1β和TNF-α含量的升高，降低兔耳痤瘡模型部位IL-1β和TNF-α的蛋白表達，提示龍眼葉提取物抑制炎癥因子釋放。綜上所述，在本實驗條件下龍眼葉提取物對痤瘡具有治療作用，機制可能與抑制炎癥因子釋放有關(guān)，值得進一步研究。

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