屈小芳，曹亞萍，吳 慶，胡慶紅，袁澤利

(遵義醫(yī)學院 藥學院無機化學教研室， 貴州 遵義 563099)

癌癥是嚴重威脅人類生命和社會發(fā)展的重大疾病[1]，在我國腫瘤死亡占全部死因的1/4，位居疾病死亡第一位[2]。目前臨床上治療癌癥的手段主要有化學治療、放射治療、手術(shù)治療、光動力治療等。光動力治療(Photodynamic Therapy，PDT)因其屬于非入侵性的治療方法，有著創(chuàng)傷小、不良反應少、低積累毒性等優(yōu)勢[3]，在治療癌癥等惡性疾病以及多種良性疾病等方面表現(xiàn)出巨大的應用潛力。

PDT涉及光敏劑、光和氧分子[4]的參與。先經(jīng)系統(tǒng)或局部給予光敏劑，當光敏劑隨血液循環(huán)到達病變部位后，利用特定波長激光照射病變部位，使其產(chǎn)生大量的單線態(tài)氧(1O2)物種，從而清除病變組織[5-6]。已應用于臨床的光敏劑如卟啉、酞箐等具有吸收波長處于近紅外區(qū)(600～800 nm)的組織穿透性強、產(chǎn)生單線態(tài)氧量多等優(yōu)勢[7-8]。然而，這些光敏劑多為混合物(不同異構(gòu)體混合)，且制備成本高等問題。因而，探尋制備簡單、成分單一的處于近紅外區(qū)的新光敏劑成為研究者們熱衷的方向。

α,α′-雙(對二甲氨亞芐基)環(huán)烷酮類化合物是重要的有機合成中間體，其共軛的π體系，使其結(jié)構(gòu)在光學性能上具有雙光子吸收性能，波長接近紅光區(qū)而常被作為光學材料。此外，該基團也在醫(yī)藥、農(nóng)藥等方面被應用[9-11]，如在抗HIV-1、抗腫瘤等藥理活性[12-13]中被作為藥學團進行藥物設計。如Zou等[14]最近研究表明α,α′-雙(對二甲氨亞芐基)結(jié)構(gòu)還具有光輻射產(chǎn)生單線態(tài)氧而殺傷腫瘤的活性，這為該結(jié)構(gòu)在醫(yī)藥方面應用奠定了新的基礎，但Zou等[14]未基于母核環(huán)進行系統(tǒng)擴充及甲基斥電子基團進行研究。為探尋中間母核環(huán)烷酮環(huán)對光敏劑光動力抗腫瘤活性，本研究構(gòu)建了3個不同環(huán)烷酮母核的α,α，-雙(亞芐基)環(huán)烷酮先導化合物，其合成路線如圖1所示。

圖1 目標化合物1的合成

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 Varian 1 000 FT-IR紅外光譜儀(4 000～400 cm-1，KBr壓片，美國Varian公司)，Micromass LCT Premier XE高分辨質(zhì)譜儀(德國Bruker公司)；Bruker APEX2 Smart CCD型單晶X射線衍射儀(德國Bruker公司)；TU-1901紫外-可見分光光度計(北京譜析儀器公司)；Vary Eclipse熒光分光光度計(美國Varian公司)；安捷倫400 MHz-DD2磁共振儀(美國安捷倫公司)；DHJF-4002低溫恒溫攪拌反應浴(鄭州長城科工有限公司)；CKX41倒置顯微鏡(日本Olympus公司)；QB-9001微孔板快速震蕩器(上海瀘粵明科學儀器有限公司)；Varioskan Flash全波長掃描式多功能讀數(shù)儀(美國Thermo 公司)。

對二甲氨基苯甲醛(上海薩恩化學技術(shù)有限公司)；環(huán)丁酮[韶遠科技(上海)有限公司]；環(huán)戊酮(化學純，國藥集團化學試劑有限公司)；環(huán)己酮[薩恩化學技術(shù)(上海)有限公司]。未經(jīng)特別說明所用溶劑均為分析純。

1.2 目標化合物1的合成 以化合物1a的合成為例：將0.532 g(7.59 mmol)環(huán)丁酮和0.2 g的氫氧化鈉溶于50 mL乙醇和5 mL純化水溶液中，將其置于低溫攪拌反應儀并于-10 ℃下攪拌約5 min，再緩緩加入2.238 g(15 mmol) 的對二甲氨基苯甲醛，繼續(xù)反應6 h，抽濾，甲醇洗滌，得到黃色固體。用乙醇和二氯甲烷或乙醇重結(jié)晶得紅色塊狀晶體1a，產(chǎn)率65%。 m.p.252.0～252.4 ℃。1H NMR(CDCl3,400 MHz),δ(ppm):7.46～7.48(d,4H,J=8.9 Hz,Ar-H),7.14(s,2H,Ar-CH=C),6.69～6.72(d,4H,J=8.8 Hz,Ar-H),3.72(s,2H,-CH2-),3.04(s,12H,-CH3);13C NMR(CDCl3,100 MHz),δ(ppm):151.23,144.75,141.49,131.51,127.00,123.00,111.96,40.12,35.11; HRMS(ESI-MS),理論計算值C22H24N2O:333.1967(M+H+),實測值：333.203 8; FT-IR(4 000～400 cm-1,KBr壓片):3 448.04,2 916.52,2 852.01,2 803.00,1 696.71,1 648.00,1 588.73,1 525.29,1 479.19,1 365.47,1 311.16,1 236.04,1 169.11,1 133.64,1 091.14,945.25,809.53。按類似方法合成得到1b和1c。

1b:紅色針狀晶體，產(chǎn)率90%。m.p.300.1～301.4 ℃.1H NMR (CDCl3,400 MHz),δ(ppm):7.53-7.54(d,4H,J=8.0 Hz,Ar-H),7.26(s, 2H, Ar-CH=C)，6.72～6.74(d,4H,J=8.7 Hz,Ar-H),4.08(s,4H,-CH2-),3.04(s,12H,-CH3);13C NMR(CDCl3,100 MHz),δ(ppm):150.71,133.55,133.48,132.54,124.23,111.87,40.13,26.64; HRMS(ESI-MS),理論計算值 C23H26N2ONa:369.194 3(M+Na+),實測值：369.192 3; FT-IR(4 000～400 cm-1,KBr壓片):3 445.36,3 095.26,2 969.70,2 929.37,1 649.92,1 649.92,1 582.48,1 517.89,1 404.26,1 357.27,1 273.00,1 196.57,1 153.71,1 127.56,1 074.63,1 013.59,969.95,818.05,730.60,517.16。

1c:紅色粉末，產(chǎn)率53%。m.p.65.4～66.5 ℃.1H NMR (CDCl3,400 MHz),δ(ppm):7.43～7.45(d,4H,J=8.9 Hz,Ar-H),7.76(s,2H,Ar-CH=C),6.70～6.72(d,4H,J=8.9Hz,Ar-H),3.01(s,12H,-CH3),2.92～2.94(t,4H,J=4.1Hz,-CH2-),1.77～1.82(m,2H,-CH2-);13C NMR (CDCl3,100 MHz),δ(ppm):186.10,146.37,133.05,128.45,120.30,107.67,107.28,36.20,24.78,19.24; HRMS(ESI-MS),理論計算值 C24H28N2O:383.209 9(M+Na+),實測值：383.207 8; FT-IR (4 000～400 cm-1,KBr壓片):3 786.98,3 430.66,2 921.30,1 702.68,1 606.47,1 526.18,1 444.36,1 370.02,1 276.88,1 182.04,1 231.74,1 104.18,946.59,825.86,768.56,699.110,619.03,530.82。

1.3 單晶結(jié)構(gòu)測定和解析 將1a固體用乙醇加熱溶解后，室溫條件下緩慢揮發(fā)溶劑，2 d后得到適宜單晶測試的1a。用Bruker APEX2 Smart CCD單晶衍射儀收集數(shù)據(jù)，采用經(jīng)石墨單色器單色化的Mo Kα射線(λ=0.071 073 nm)，以φ-ω掃描方式收集單晶衍射數(shù)據(jù)。得到的強度數(shù)據(jù)進行經(jīng)驗吸收校正、LP 校正后，采用直接法解得晶體結(jié)構(gòu)，最后用全矩陣最小二乘法修正了全部非氫原子坐標及其各向異性熱參數(shù)。用SHELX-97程序完成所有計算[15]。

1.4 光學性質(zhì)測定 將化合物1a～1c用無水乙醇配成濃度為2.24×10-4mol/L，作為儲備液，然后各取0.1 mL稀釋至10 mL，使其濃度為2.24×10-6mol/L，使用TU-1901紫外-可見分光光度計和Carry熒光分光光度計分別測其紫外-可見吸收光譜和熒光光譜(狹縫寬度均為5 nm，電壓為中等)。所得數(shù)據(jù)用origin 8軟件進行處理繪制。

1.5 體外抗腫瘤活性考察 采用MTT法考察化合物1a～1c對 A549(人源肺腺癌細胞)和 HepG2(人源肝癌細胞，2個細胞均來源于遵義醫(yī)學院醫(yī)學研究中心)的生長抑制活性。具體步驟如下：取處于對數(shù)生長期的腫瘤細胞，接種于96孔板中(2.0×104～5×104個/mL)，放置5% CO2、飽和濕度及37 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24 h后[16]，加入5、10、20、40、60、80、100和120 μmol/L的受試化合物，暗室孵育20 h，用光功率為7 mW·cm-2溴鎢燈光照15 min，再暗室37 ℃孵育4 h,然后每孔加入10 μL (5 mg/mL)的MTT溶液和90 μL培養(yǎng)基，暗室37 ℃孵育 4 h，將孔內(nèi)液體吸棄，每孔加入100 μL DMSO，室溫下振搖5 min，用酶聯(lián)免疫檢測儀測490 nm OD值。細胞增殖抑制率公式為：抑制率=1-[OD(樣品)-OD(空白)]/[(OD細胞對照-OD空白)]×100%。暗毒性考察不需燈照，其他條件同上。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)構(gòu)表征 以1a的1H NMR為例，在目標化合物的1H NMR中，在δ7.46～7.48 ppm處的雙峰為對稱芳環(huán)上的4個芳環(huán)質(zhì)子化學位移；在δ7.14 ppm處的單峰為新生成的兩個烯鍵質(zhì)子化學位移；而在δ6.69～6.72 ppm處的雙峰為對稱芳香環(huán)上的4個質(zhì)子化學位移。此外在δ3.72 ppm處的單峰為環(huán)丁酮結(jié)構(gòu)中的亞甲基的2個質(zhì)子化學位移，而在δ 3.04 ppm的單峰為氨基位取代的12個甲基質(zhì)子化學位移。1b、1c的1H NMR測試結(jié)果與之類似，不同之處在于1b在δ 4.08 ppm處出現(xiàn)了4個環(huán)戊酮亞甲基質(zhì)子化學位移；而1c卻在δ 2.94～1.77 ppm處出現(xiàn)了2組6個亞甲基質(zhì)子化學位移。而在1a的13C NMR譜中，在δ 150～180 ppm處出現(xiàn)了環(huán)酮碳基碳信號，在δ 107～144 ppm處為芳環(huán)碳和生成的C=C雙鍵碳信號；而19～40 ppm處為亞甲基和甲基碳信號。在1a～1c的HRMS譜圖中測定值與理論計算值均在5‰范圍內(nèi)。p在1a～1c的FT-IR譜中，于1 969～1 702 cm-1出現(xiàn)了?C=O特征振動吸收峰，在2 852～2 969 cm-1處出現(xiàn)了甲基和亞甲基的特征振動吸收峰。

上述譜圖表征充分證實，得到的化合物為預期結(jié)構(gòu)。

2.2 單晶結(jié)構(gòu) 單晶X射線衍射測試表明，化合物1a的晶體結(jié)構(gòu)屬于單斜晶系(Monoclinic)，P21/c空間群，分子式為C22H24N2O，晶胞參數(shù)為a=7.489(2) ?,b=19.945(6) ?,c=12.403(3) ?,α= 900,β= 96.9650(10),γ= 900,V=1 839.0(9) ?3,Dc=1.201 Mg/m3,μ=0.074 mm-1,Z=4,F(000)=712.0,R1=0.065 5,wR2=0.224 0,s=0.902。晶體數(shù)據(jù)存于英國劍橋數(shù)據(jù)中心，CCDC 號為1586168。

1a的分子結(jié)構(gòu)見圖2，鍵長、鍵角見表1。由圖2可以看出，此分子結(jié)構(gòu)中含有2個N,N-二甲基芳香環(huán)單元和1個環(huán)丁酮單元，芳香環(huán)與環(huán)丁酮通過環(huán)外雙鍵相連。表1的晶體數(shù)據(jù)表明：環(huán)丁酮的C-C鍵長處于1.47 ?～1.53 ?之間，C=O鍵長為1.218 ?。環(huán)丁酮和芳環(huán)之間的雙鍵的C=C鍵為1.33 ?，而苯環(huán)上C=C鍵處于1.37 ?～1.41?間，C-N鍵長在1.42 ?～1.46 ?之間，這些鍵長與文獻報道的鍵長相吻合[17-18]。同時，環(huán)丁酮的鍵角在90.7o～91.4°，基本上接近90°，鍵角趨于平均化，有助于化合物結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定[17]，且鍵角和為359.96°，4個C原子基本處于同一個平面。

圖2 化合物1a的分子結(jié)構(gòu)

表1化合物1a的選擇性鍵長(?)和鍵角(°)

鍵長 (?)鍵角 (o)C(1)-N(1)1.439(3)C(5)-C(4)-C(3)121.4(2)C(2)-N(1)1.433(4)C(7)-C(6)-C(5)116.2(3)C(3)-N(1)1.375(4)C(7)-C(6)-C(9)123.7(2)C(3)-C(4)1.396(4)C(9)-C(10)-C(11)132.1(2)C(6)-C(7)1.390(3)C(9)-C(10)-C(13)137.1(3)C(10)-C(11)1.478(4)C(11)-C(10)-C(13)90.8(2)C(9)-C(10)1.334(4)O(1)-C(11)-C(10)134.7(3)C(10)-C(13)1.526(3)C(10)-C(11)-C(12)91.1(2)C(11)-O(1)1.221(3)C(11)-C(12)-C(13)90.4(2)C(12)-C(14)1.333(4)N(2)-C(18)-C(17)122.1(3)C(12)-C(13)1.528(4)N(2)-C(18)-C(19)121.9(3)C(18)-N(2)1.364(3)C(3)-N(1)-C(2)121.3(2)C(21)-N(2)1.451(4)C(18)-N(2)-C(22)121.3(3)C(22)-N(2)1.448(4)C(22)-N(2)-C(21)117.1(3)

2.3 化合物1a～1c的吸收光譜和熒光光譜 由圖3A可以看出：化合物1a～1c最大吸收波長分別在470 nm、483 nm和447 nm處,它們的吸光度為1a<1b<1c，尤以環(huán)己酮生成的1c的吸光度為1a和1b的10倍和13倍。而在熒光發(fā)射圖譜中(見圖3B)，熒光發(fā)射峰分別在588 nm、600 nm和567.05 nm處，且熒光強度大小為1a<1c<1b。

圖3 化合物1a～1c的紫外-可見光譜(A)和熒光光譜(B)

2.4 體外光毒性 化合物1a～1c避光和光照對人肺腺癌細胞(A549)和人源肝癌細胞(HepG2)受試細胞株的生長抑制活性結(jié)果(見表2)。由表2可以看出：3個化合物均無暗毒性，在光毒性方面，化合物1b和1c對受試腫瘤細胞株也無毒性，僅化合物1a對2株受試腫瘤細胞株表現(xiàn)出較強的光毒性，IC50分別5.48 μmol/L、10.50 μmol/L，表明以環(huán)丁酮為母核的α,α′- 雙(對二甲氨亞芐基)環(huán)烷酮作為新光敏劑設計值得進一步深入研究。

表2化合物1a～1c對兩種受試細胞的體外抑制活性[IC50/(μmol/L)]

化合物A549暗毒性光毒性HepG2暗毒性光毒性1a>1005.48>10010.501b>100>100>100>1001c>100>100>100>100

3 討論

α,α′- 雙(對二甲氨亞芐基)環(huán)烷酮類化合物合成有微波輻射相轉(zhuǎn)移催化法[19-20]、強酸性陽離子交換樹脂催化法[21]、ZrOCl2·8H2O催化法[9]等。本研究中，通過加入NaOH堿化溶劑來催化芳香醛與環(huán)烷酮進行Cross-Aldol縮合反應。該方法操作簡便，催化劑價廉易得，反應環(huán)境溫和，后處理簡單，對于發(fā)展化學藥物的低碳綠色技術(shù)具有十分重要的意義。

光動力治療是一種利用光動力效應對腫瘤和其他病理性靶組織進行診斷和治療的新技術(shù)[22]。當藥物達到病灶組織后，對病灶組織進行光定位照射，從而殺傷病灶組織，而不損傷正常組織。因此，理想光敏劑應具備暗毒性低、對正常組織毒副作用低，且對病灶部位和靶向組織更具有選擇性等條件?；衔?a在暗室條件下對細胞的殺傷效應低(即無暗毒性)，在光照下對受試腫瘤細胞株表現(xiàn)出顯著光毒性，表明其具備理想光敏劑的無暗毒性條件，值得進一步研究其體內(nèi)活性。

此外，從藥效團結(jié)構(gòu)與光動力毒性方面看，增大母核環(huán)烷酮的環(huán)系未表現(xiàn)出對受試腫瘤細胞株的光毒性，這可能是由于環(huán)系增加導致分子結(jié)構(gòu)更易于扭曲，致使分子共軛較弱，故以小環(huán)的環(huán)丁酮為母核新光敏劑設計值得進一步開展。

綜上所述，本實驗在NaOH催化下，將對二甲氨基苯甲醛分別與環(huán)烷酮類化合物通過Cross-Aldol縮合生成α,α′-(對甲氨亞芐基)環(huán)烷酮1a～1c，并通過核磁1H NMR、13C NMR譜、FT-IR譜、高分辨質(zhì)譜及單晶XRD等現(xiàn)代分析手段表征為預期目標分子。采用MTT法研究化合物1a～1c避光和光照條件下對人肺腺癌細胞(A549)和人源肝癌細胞(HepG2)受試細胞株的生長抑制活性。結(jié)果表明：化合物1a對A549(人肺腺癌細胞)和 HepG2(人源肝癌細胞)均有較強的光毒性，值得進一步研究。

[1] 曾紅梅,陳萬青.中國癌癥流行病學與防治研究現(xiàn)狀[J].化學進展,2013,25(9):1415-1420.

[2] 高婷,李超,梁鋅,等.中國癌癥流行的國際比較[J].中國腫瘤,2016,25(6):409-414.

[3] 凌紹枝,屈亞威,劉海峰.光動力治療及其臨床應用研究[J].武警醫(yī)學,2017,28(2):203-207.

[4] 韓曉博,鄭英虹,楊力明.光敏劑在光動力治療中的研究進展[J].上海大學學報:自然科學版，2017，23(2):169-178.

[5] 紀?，?陽離子卟啉光敏劑的光動力抗菌活性及作用機制研究[D].北京：協(xié)和醫(yī)學院,2016.

[6] 魏永青.血卟啉單甲醚作為光敏劑對卵巢癌細胞的體外光動力殺傷作用[D].濟南：山東大學,2007.

[7] 周勇,黃一波.基于卟啉的藥物活性化合物的合成研究進展[J].化學試劑,2017,39(5):481-486.

[8] Li Y H,Zhao D H,Li Y W,et al.Synthesis of water-soluble and thermoresponsive phthalocyanine ended block copolymers as potential photosensitizer[J].Dyes and Pigments,2017,142:88-99.

[9] 韓波,賈小維,呂磊,等.ZrOCl2·8H2O高效催化合成α,α'-雙亞芐基環(huán)烷酮[J].化學試劑,2015，37(10):919-922.

[10]康麗琴,魏邦國.Amberlyst 15催化下合成雙亞芐基環(huán)烷酮類化合物[J].化學通報,2007,70(10):801-804.

[11]曾鴻耀,尹述凡,李穎.無溶劑NH2SO3H催化下超聲促進環(huán)酮與芳香醛的Aldol縮合[J].有機化學,2007,27(4):528-531.

[12]Artico M,Di Santo R,Costi R,et al.Geometrically and conformationally restrained cinnamoyl compounds as inhibitors of HIV-1 integrase:synthesis,biological evaluation,and molecular modeling[J].J Med Chem,1998,41(21):3948-3960.

[13]Das U,Pati H N,Sakagami H,et al.3,5-Bis(benzylidene)- 1-[3-(2- hydroxyethylthio) propanoyl]piperidin-4-ones:a novel cluster of potent tumor-selective cytotoxins[J].J Med Chem，2011,54(9):3445-3449.

[14]Zou Q,Zhao H,Zhao Y,et al.Effective two-photon excited photodynamic therapy of xenograft tumors sensitized by water-soluble bis(arylidene)cycloalkanone photosensitizers[J].J Med Chem，2015,58(20):7949-7958.

[15]帥光平,袁澤利.新型磺酰胺化合物的合成、晶體結(jié)構(gòu)及抗菌活性[J].遵義醫(yī)學院學報,2017,40(4)：389-393.

[16]曹亞萍,易芩蘭,劉洪梅,等.氨基酸席夫堿氧釩(IV)配合物的合成、晶體結(jié)構(gòu)及其抗腫瘤活性[J].遵義醫(yī)學院學報,2016,39(2):122-128.

[17]林秋漢,李玉川,汪竹,等.5,5’-偶氮四唑-5-氮氧化物鈉五水合物的晶體結(jié)構(gòu)及相關(guān)理論研究[J].北京理工大學學報,2014,34(2):211-215.

[18]邵菊香,程新路,楊向東,等.C-H,C-N,C-O,N-N的鍵離解能和鍵長的計算[J].原子與分子物理學報,2006,23(1):80-84.

[19]李步洪,謝樹森,陸祖康.光動力學療法新型光敏劑的光譜特性研究[J].光譜學與光譜分析,2002,22(6):902-904.

[20]周建峰,朱惠琴,夏敏,等.微波輻射相轉(zhuǎn)移催化下水相合成α,α'-雙亞芐基環(huán)烷酮[J].有機化學,2005,25(5):583-586.

[21]胡雪原,孫洪,范學森,等.離子液體中α,α′-雙亞芐基環(huán)烷酮的綠色合成[J].河南師范大學學報:自然科學版,2004,32(1):52-55.

[22]劉馨剛,吳敏,李素瑩,等.氟硼二吡咯類光敏劑的制備及對腫瘤細胞的光動力學影響[J].浙江大學學報:醫(yī)學版,2017,46(2):135-143.