*

1.貴陽中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系，貴州 貴陽 550002；2.貴州師范大學(xué)分析測(cè)試中心, 貴州 貴陽 550001；3.黔南州甕安縣人民醫(yī)院, 貴州 黔南 550400

鈍藥野木瓜(StauntonialeucanthaDiels ex Y.C.)屬于木通科野木瓜屬植物，俗稱繞繞藤、五葉木通、八月瓜，主要分布在貴州、四川、安徽、江浙和兩廣一帶，具有祛風(fēng)止痛，利尿消腫的功效，對(duì)風(fēng)濕痹通、小便不利和水腫療效顯著[1]。該藥材被2003版《貴州省中藥材、民族藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》收載，作為野木瓜藤入藥，但僅有性狀描述[2]。在長(zhǎng)期研究抗病毒中藥和民族藥的過程中，采用HIV-1蛋白酶和HPLC法[3]，發(fā)現(xiàn)鈍藥野木瓜95%乙醇提取物的乙酸乙酯萃取物在100 μg/mL時(shí)，對(duì)HIV蛋白酶的抑制率達(dá)44.3%，進(jìn)一步的文獻(xiàn)調(diào)研發(fā)現(xiàn)，鈍藥野木瓜化學(xué)成分及含量研究未見報(bào)道。2015 版《中國(guó)藥典》同屬植物野木瓜(S.chinensisDC)以苯乙醇苷類成分荷苞花苷B作為指標(biāo)性成分進(jìn)行質(zhì)量控制[4]。本課題組參照藥典方法對(duì)黔產(chǎn)10批次的鈍藥野木瓜藥材中荷苞花苷B進(jìn)行定性和定量研究，發(fā)現(xiàn)含量為5.91～39.39 μg/g，荷苞花苷B需低溫存放，長(zhǎng)時(shí)間暴露在空氣中，含量有所下降，其標(biāo)準(zhǔn)品溶液低溫存放超過24 h后，易產(chǎn)生雜質(zhì)峰[5]。一些學(xué)者對(duì)野木瓜(S.chinensisDC)中的木犀草素、綠原酸、齊墩果酸和熊果酸的含量進(jìn)行了報(bào)道[6-8]，而同屬植物化學(xué)成分研究發(fā)現(xiàn)野木瓜(S.chinensisDC)[9]、六葉野木瓜(S.hexaphyllaThunb.Dence.)、五指那藤(S.obovatifoliolasubsp.intermedia)、尾葉那藤(S.obovatifoliolasp.urophylla)和黃臘果(S.brachyanthera)藤莖中常分離出羽扇豆醇和羽扇豆酮等多種羽扇豆烷型化合物[9-11]。體內(nèi)外研究證實(shí)，羽扇豆醇具抗炎、抗瘧疾、抗癌等作用[12]。羽扇豆酮對(duì)單純皰疹病毒(HSV)和非洲豬瘟病毒(ASFV)具有抗病毒活性，對(duì)HSV-1和HSV-2具有很強(qiáng)的抗病毒抑癍作用[13]。為明確鈍藥野木瓜藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，實(shí)驗(yàn)開展了鈍藥野木瓜化學(xué)成分研究，建立HPLC法同時(shí)測(cè)定羽扇豆醇和羽扇豆酮的定量分析方法，為該藥材的監(jiān)督、質(zhì)控和相關(guān)藥品、保健品的開發(fā)研制提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Bruker AM-400和500 MHz核磁共振波譜儀(TMS為內(nèi)標(biāo))；GC-MS 5973型氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國(guó)HP公司)；1100型高效液相色譜儀( 美國(guó) Agilent)；梅特勒-托利多超聲波清洗器(METILER-TOULEDO)；ME104 電子分析天平(瑞士梅特勒)；R-200旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士布奇公司)；SHZ-DⅢ循環(huán)水式真空泵(上海予英儀器有限公司)；ZF-1三用紫外分析儀(上海電光分析)。

1.2 材料 TLC和柱色譜硅膠分別為GF254和200-300目硅膠 (青島海洋化工廠分廠)；反相硅膠為ODS DM 1020T (日本富士硅膠公司)；Sephadex LH-20 (GE 公司)。羽扇豆醇、羽扇豆烷均來自為本植物(乙酸乙酯萃取)分離純化所得，結(jié)構(gòu)經(jīng)波譜學(xué)(ESI-MS，1H-NMR，13C-NMR)分析鑒定，以HPLC面積歸一化法測(cè)定其質(zhì)量分?jǐn)?shù)均大于96%。洗脫劑均為工業(yè)重蒸品，甲醇、乙醇、磷酸(分析純，重慶茂業(yè)化學(xué)試劑有限公司)；乙腈(色譜純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)；水(超純水)。鈍藥野木瓜藥材于2014年4月采集于貴州省遵義市，經(jīng)貴陽中醫(yī)學(xué)院陳德媛教授鑒定為鈍藥野木瓜的地上部分，憑證標(biāo)本保存于貴陽中醫(yī)學(xué)院中藥化學(xué)教研室(標(biāo)本號(hào)：2014/SL)。

2 方法與結(jié)果

2.1 化學(xué)成分研究

2.1.1 藥材前處理 干燥鈍藥野木瓜藤莖 3 kg,粉碎后用70%的甲醇溶液(料液比為 1∶3)加熱回流提取3次，每次1 h，合并浸提液后減壓濃縮，回收甲醇至無醇味，再用乙酸乙酯萃取，濃縮，得浸膏(45 g)，經(jīng)硅膠柱(柱長(zhǎng)×內(nèi)徑=75 cm × 5.5 cm )色譜進(jìn)行分離。以石油醚-乙酸乙酯(40∶1 → 0∶100)進(jìn)行梯度洗脫，最后用氯仿-甲醇(1∶1)混合液及純甲醇下柱，得 35 個(gè)流份(fr.1～ 35)。

2.1.2 化合物的分離純化 在fr.3，即 石油醚-乙酸乙酯 25∶1 部分(112 mg)經(jīng)Sephadex LH-20凝膠柱色譜分離，以氯仿-甲醇(1∶1)為洗脫劑，純化得到化合物 1(27 mg)；fr. 18，即石油醚-乙酸乙酯 20∶1～18∶1部分(106 mg)經(jīng)反相硅膠柱層析，以甲醇-水(5∶5 → 10∶0)梯度洗脫，在 8∶2 洗脫部分析出結(jié)晶，用甲醇多次洗滌結(jié)晶，石油醚-丙酮重結(jié)晶得化合物2(19 mg)；fr.26，即石油醚-乙酸乙酯(15∶1 ～ 12∶1部分(363 mg)經(jīng)硅膠柱層析分離，用石油醚-丙酮(30∶1→1∶1)梯度洗脫得到 12 個(gè)流份，其中fr.5 ～ 6經(jīng)Sephadex LH-20柱層析，甲醇洗脫分離純化得到化合物 3(26.7 mg)；fr.30，即石油醚-乙酸乙酯10∶1～9∶1部分(163 mg)經(jīng)硅膠柱層析，用氯仿-丙酮(40∶1→1∶1)洗脫，并經(jīng)石油醚-丙酮重結(jié)晶得到化合物 4(25.2 mg)

2.1.3 化合物的結(jié)構(gòu)鑒定 化合物 1 白色結(jié)晶(丙酮)，mp 170～172 ℃，分子式為C30H48O; ESI-MSm/z447 [M + 23]+;1H-NMR (CDCl3, 400 MHz) 、13C-NMR (CDCl3, 100 MHz) 數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[14]對(duì)照基本一致，故鑒定化合物 1 為羽扇豆酮。

化合物 2 白色針晶(石油醚-丙酮)；EI-MSm/z488 [M]+,1H-NMR (CDCl3,500 MHz)、13C-NMR (CDCl3, 125 MHz)數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[15]報(bào)道基本一致，故鑒定該化合物2為3β-乙酰基齊墩果酸。

化合物 3 白色針狀結(jié)晶(石油醚-醋酸乙酯), mp 210 ～ 212 ℃,分子式為C30H50O, TLC檢識(shí)遇硫酸-甲醇溶液加熱顯紫紅色, Lieberman-Burchard反應(yīng)為陽性。EI-MSm/z426 [M]+，1H-NMR (CDCl3, 400 MHz) 、13C-NMR (CDCl3, 100 MHz)數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[16]對(duì)照基本一致，故鑒定化合物 3 為羽扇豆醇。

化合物 4 白色簇晶(石油醚-丙酮)；EI-MSm/z456 [M]+,1H-NMR (CDCl3, 400 MHz) 、13C-NMR (CDCl3, 100 MHz)數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[17]報(bào)道基本一致，故鑒定該化合物4為齊墩果酸。

2.2 羽扇豆醇與羽扇豆酮的含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件及系統(tǒng)適應(yīng)性 色譜柱為Ocean C18柱(250 mm × 4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相：100%甲醇；流速：1 mL/min；柱溫：30 ℃；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)：210 nm；進(jìn)樣量為20 μL。對(duì)照品與樣品中的羽扇豆醇和羽扇豆酮色譜峰相互分離度大于1.5，理論塔板數(shù)大于5000，對(duì)照品和鈍藥野木瓜樣品的HPLC色譜見圖 1。

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取羽扇豆醇對(duì)照品12.930 mg和羽扇豆酮對(duì)照品23.625 mg于25 mL容量瓶中，加甲醇溶液溶解并稀釋至刻度，制成濃度分別為0.5172 mg/mL和0.945 mg/mL對(duì)照品貯備液。分別精密吸取上述對(duì)照品貯備液適量，加甲醇溶解并稀釋，搖勻，制成羽扇豆醇和羽扇豆酮質(zhì)量濃度分別為0.0517 mg/mL和0.0945 mg/mL的混合對(duì)照品溶液，備用。

2.2.3 供試品溶液的制備 取鈍藥野木瓜干燥帶葉莖枝藥材粉末(貴州都勻，過4號(hào)篩，50℃烘干)約1.0 g，精密稱定，置于150 mL具塞錐形瓶中，用移液管精密加入甲醇25 mL，密塞，搖勻，稱重，超聲提取30 min，待冷卻后，稱重，用甲醇補(bǔ)足減量，經(jīng)4000 r/min離心15 min，取上清液過0.45 μm 微孔濾膜，即得。

2.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的考察 分別精密吸取上述兩種對(duì)照品貯備液1、5、10、15、20、25 μL，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣，記錄色譜圖，以進(jìn)樣量(X，μg)為橫坐標(biāo)，峰面積積分值(Y)為縱坐標(biāo)進(jìn)行回歸，得羽扇豆醇回歸方程為Y=20.026X-6.1885(r=0.9995，n=6)，進(jìn)樣量在0.5172～12.93 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好；回歸方程為羽扇豆酮Y=7.6074X+2.6331(r=0.9992，n=6)，進(jìn)樣量在0.945～23.625 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。見圖2～3。

2.2.5 精密度試驗(yàn) 分別精密吸取2.2.2項(xiàng)下對(duì)照品混合溶液20 μL，按2.2.1色譜條件各連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積，計(jì)算RSD分別為0.9%和0.3%，表明儀器的精密度良好。

2.2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取同一批鈍藥野木瓜粉末(貴州都勻，過4號(hào)篩)6份，每份1.0 g，按供試品溶液的制備方法制備溶液，取供試品溶液20 μL進(jìn)樣，在上述色譜條件下進(jìn)行分析，根據(jù)峰面積代入回歸方程計(jì)算質(zhì)量，得羽扇豆醇和羽扇豆酮RSD分別為1.2%(n=6)和0.8%(n=6)。

2.2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密稱取鈍藥野木瓜粉末(貴州都勻，過4號(hào)篩)約1.0 g，按2.2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，室溫下放置，取供試品溶液20μL，分別在0、2、4、6、8、10、12 h進(jìn)樣分析，分別測(cè)定峰面積。結(jié)果羽扇豆醇和羽扇豆酮峰面積的RSD分別為2.0%和1.5%。表明12 h內(nèi)供試品溶液的穩(wěn)定性良好。

2.2.8 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取鈍藥野木瓜粉末(貴州都勻，過4號(hào)篩)約0.5 g，各加入對(duì)照品適量，按2.2.3項(xiàng)下方法制備樣品溶液，分別吸取20 μL進(jìn)樣分析，測(cè)定羽扇豆醇、羽扇豆酮的含量，計(jì)算加樣回收率。見表1。

表1 鈍藥野木瓜加樣回收率結(jié)果

2.2.9 樣品分析 取貴州省3個(gè)地區(qū)鈍藥野木瓜的莖和全株，8個(gè)地區(qū)鈍藥野木瓜的全株，打成粉末(過4號(hào)篩)精密稱定1.0 g，按2.2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄峰面積，外標(biāo)一點(diǎn)法計(jì)算藥材中羽扇豆醇和羽扇豆酮的含量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2～3。

表2 鈍藥野木瓜藥材不同采收部位兩種三萜含量檢測(cè)結(jié)果 (n=3)

表3 貴州8個(gè)地區(qū)鈍藥野木瓜藥材中兩種三萜含量檢測(cè)結(jié)果 (n=10)

3 討論

3.1 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化 實(shí)驗(yàn)考察了甲醇-水、乙腈-水3個(gè)不同比例為檢測(cè)體系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)目標(biāo)峰出峰較晚，甚至不出峰，而甲醇-水(98∶2)首個(gè)目標(biāo)峰出峰時(shí)間接近1 h，用乙腈替換也沒明顯改善出峰時(shí)間，而用純甲醇作為流動(dòng)相時(shí)，兩個(gè)目標(biāo)峰羽扇豆醇、羽扇豆酮的出峰時(shí)間明顯縮短且分離效果好，故選擇了純甲醇作為流動(dòng)相。

3.2 樣品處理方法的選擇 實(shí)驗(yàn)考察了不同溶劑(甲醇、乙醇、氯仿及氯仿-甲醇)作為提取溶劑，結(jié)果發(fā)現(xiàn)甲醇作為提取溶劑提取率相對(duì)較高，氯仿-甲醇(1∶1)及氯仿次之，乙醇作為提取溶劑時(shí)目標(biāo)峰分離效果不好，故選用甲醇作為提取溶劑，同時(shí)本實(shí)驗(yàn)也考察了不同濃度甲醇(100%、90%、80%、75%、65%)，不同提取方法(超聲提取法、回流提取法、冷浸提取法)，不同提取時(shí)間(0 min、30 min、40 min、50 min、60 min)，不同料液比(15倍、25倍、35倍、45倍體積)，最終確定以100%甲醇為提取溶劑，超聲提取30 min，料液比為25倍時(shí)樣品提取率相對(duì)較高且操作簡(jiǎn)便，故為最優(yōu)處理方法。

3.3 樣品含量測(cè)定 由表2可知，鈍藥野木瓜全株植物中的羽扇豆醇含量均高于純莖部位，可能該植物的葉子含有較大量的羽扇豆醇成分，而羽扇豆酮的含量受植株部位的影響較??；由表3中結(jié)果顯示，羽扇豆醇的含量受植物生長(zhǎng)環(huán)境的影響較小，但不同產(chǎn)地還是存在差異，貴州丹寨地區(qū)的鈍藥野木瓜中羽扇豆醇含量最高，為0.0113 mg/g；羽扇豆酮的含量差異較大，植株受生長(zhǎng)環(huán)境因素影響較大，并且貴州貴定地區(qū)的鈍藥野木瓜中羽扇豆酮與總?cè)频暮孔罡撸謩e為0.0708 mg/g和0.0794 mg/g。貴州省8個(gè)不同產(chǎn)地、10批次的藥材中，丹寨和貴定地區(qū)樣品的羽扇豆醇和羽扇豆酮含量最高，分別為0.0113 mg·g-1和0.0708 mg·g-1。

實(shí)驗(yàn)首次從鈍藥野木瓜中分離、純化和鑒定出4種五環(huán)三萜化合物，并建立HPLC法同時(shí)測(cè)定鈍藥野木瓜藥材中羽扇豆醇和羽扇豆酮的含量，分析方法簡(jiǎn)單、可行，研究結(jié)果為鈍藥野木瓜藥材的開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

[1]國(guó)家中醫(yī)藥管理局. 中華本草 [M]. 上海：上海科學(xué)技術(shù)出版社, 1999：1936.

[2]貴州省藥品監(jiān)督管理局.貴州省中藥材、民族藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[M]. 貴州：貴州科技出版社，2003:334.

[3]Wei Y., Ma C.M., Chen D.Y. et al. Anti-HIV-1 Protease Triterpenes from Stauntonia obovatifoliola Hayata subsp.intermedia. [J]. Phytochemistry, 2008(69):1875.

[4]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典 [M]. 北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2015: 314.

[5]胡冬群，杜江，李揚(yáng)，等. 貴州鈍藥野木瓜藥材的質(zhì)量測(cè)定[J].貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016, 44(4), 123.

[6]余良忠，文萍，虞金寶，等.HPLC法測(cè)定野木瓜中木犀草素的含量[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)，2013，19(9):111.

[7]余良忠，文萍，虞金寶，等.高效液相色譜法測(cè)定野木瓜中綠原酸的含量[J].醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2008，27(7)：854.

[8]唐唯媛,張義明,董永剛.HPLC法同時(shí)測(cè)定野木瓜中齊墩果酸與熊果酸的研究[J].中國(guó)食品添加劑(試驗(yàn)研究),2010(2):196-200.

[9]王淮濱，于德泉，梁曉天,等.野木瓜甙YM10和YM12的結(jié)構(gòu)[J].藥學(xué)學(xué)報(bào)，1989(6)：444.

[10]彭小冰，危英，高偉略, 等. 尾葉那藤地上部分化學(xué)成分研究[J].中藥材, 2013，36(11): 1796.

[11]陳超，李振興，孟大利, 等.黃臘果藤莖化學(xué)成分的分離與鑒定[J].沈陽大學(xué)學(xué)報(bào),2011,28(6):417.

[12]張琳，張有成. 三萜類化合物羽扇豆醇的抗腫瘤作用[J].國(guó)際腫瘤學(xué)雜志，2012, 39(2)：114.

[13]Madureira AM,Ascenso JR, et al. Evaluation of the antiviral and antimicrobial activities of triterpenes isolated from Euphorbia segetalis[J] .Nat Prod Res,2003，17 (5): 375.

[14]Dantanarayana A P, Kumar N S, Muthukuda P M, et al. A lupine derivative and the 13 C NMR chemical shifts of some lupanone from Pleurostylia opposita [J]. Phytochemistry, 1982(21): 2065.

[15]Ikuta A, The triterpenes from Stauntonia hexaphylla callustissues and their Biosynthetic significance [J]. J. Nat. Prod. 1989(52): 623.

[16]Wenkert E, Baddeley G V, Burfit I R, et al. Carbon-13 nuclear magnetic resonance spectroscopy of naturally-occurring substances. LVII. Triterpenes related to lupane and hopane [J]. Org.Magn. Reson. 1978(11): 343.

[17]Ikuta, A., Itokawa, H., Triterpenoids of Paeonia japonica callus tissue [J]. Phytochemistry, 1988(27): 2813.