谷 寧，楊宇平，蒲首丞，孫梅好

(浙江師范大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，浙江金華 321004)

APS激酶磷酸化APS以形成PAPS， 這種酶較近才引起植物研究界的關(guān)注，因?yàn)椴幌窠湍?、真菌和許多細(xì)菌，植物直接使用APS而不是PAPS進(jìn)行硫還原代謝[1]。因此，在這些生物體中，APS激酶是硫酸鹽同化的重要組成部分(圖1)。在植物中，它實(shí)際上主要從同化物中吸收硫以合成PAPS，因此是初級(jí)和次級(jí)硫代謝的分支點(diǎn)，其活性的強(qiáng)弱決定植物細(xì)胞內(nèi)硫酸鹽的不同代謝方向[2]。

圖1 硫酸鹽在植物細(xì)胞內(nèi)的同化過程Fig.1 Scheme of sulfate assimilation pathway in plant cells

在擬南芥中發(fā)現(xiàn)4種APSK亞型，水稻和楊樹有3種APK同種型，苔蘚卷毛蘚有4種，青藻衣藻和牛蒡?qū)俑髯院?種APSK基因[3]。因此，APSK在目前分析的大多數(shù)植物中都由小型多基因家族編碼。然而，其衍生蛋白質(zhì)的特定靶向存在差異。雖然水稻似乎只編碼具有葉綠體靶向肽的APSK同種型，但在小立陶宛蘚中，所有的APSK似乎都是胞質(zhì)的。雖然水稻和楊樹基因組編碼多個(gè)SOT基因，但在這種類型的磺基轉(zhuǎn)移酶中沒有同系物存在于小立陶宛蘚或萊茵衣藻中[4]。

在擬南芥中，沉默APK1和APKII亞型，得到的雙突變體表現(xiàn)出半矮型表型，說明APS激酶不僅是植物硫酸鹽代謝的關(guān)鍵酶之一，而且影響植物生長(zhǎng)素的積累[4]。但APS激酶的重要性目前尚不清楚，因?yàn)闆]有硫代葡萄糖苷的植物也沒有顯示出任何顯著的生長(zhǎng)表型，并且即使缺失植物激素和PSY1受體以及酪氨酸蛋白質(zhì)磺基轉(zhuǎn)移酶也不致死。

2 植物腺苷5-磷酸-硫酸激酶(APSK)的結(jié)構(gòu)與反應(yīng)機(jī)理

2.1APSK的總體結(jié)構(gòu)APSK催化γ-磷酸酯從ATP向APS腺嘌呤環(huán)的3′-羥基轉(zhuǎn)移，得到PAPS和ADP。來自產(chǎn)黃青霉、大腸桿菌和擬南芥的APSK的動(dòng)力學(xué)研究提出的反應(yīng)順序遵循APS底物抑制的有序機(jī)制[5-7]。 雖然沒有植物APSK的結(jié)構(gòu)信息可用，但已經(jīng)確定來自人、嗜熱菌和脫硫硫桿菌的產(chǎn)黃青霉APSK和雙功能ATP硫化酶-APSK的X射線晶體結(jié)構(gòu)，并揭示典型的α/β嘌呤核苷酸結(jié)合折疊。對(duì)于雙功能人類酶，APS對(duì)APSK活性的底物抑制與低序列同源性的20-aa 左右N末端環(huán)連接。為了更好地了解植物APSK的分子功能，確定了與β，γ-亞氨基腺苷-5′-三磷酸(AMP-PNP)、Mg2+和APS復(fù)合的ATAPSK異構(gòu)體，一個(gè)缺乏葉綠體定位的晶體結(jié)構(gòu)(圖2)。

缺少77-aa N末端葉綠體定位序列的ATAPSK同種型1(殘基78-276)[8]用于蛋白質(zhì)晶體學(xué)。 與AMP-PNP、Mg2+和APS復(fù)合的ATAPSK結(jié)構(gòu)通過使用產(chǎn)黃青霉APSK[9]的分子替代作為不對(duì)稱單位中的3種單體的搜索模型來解決。鏈A形成結(jié)晶二聚體，鏈B和C產(chǎn)生第二非結(jié)晶二聚體。二聚體中每個(gè)單體的總體折疊由可變的N-末端區(qū)域(殘基80-98)組成，并且覆蓋核苷酸結(jié)合位點(diǎn)。其包括α1和相鄰單體，典型的α/β-嘌呤核苷酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域(β1-α2-β2-α3 -β3-α4-β4-α7)以及α5和α6的小結(jié)構(gòu)域。雖然ATAPSK與來自人類的雙功能PAPS合成酶(1.2 ? rmsd for 187 Cα atoms; 51% sequence identity)和產(chǎn)黃青霉APSK(1.3 ? rmsd.for 176 Cα atoms; 55% sequence identity)共享共同的折疊，但這些結(jié)構(gòu)上，N端定位不同[12]。該區(qū)域的特征是各種APSK結(jié)構(gòu)中具有約7-aaα(α1)的非結(jié)構(gòu)化環(huán)[9-13]。在ATAPSK結(jié)構(gòu)的初始2F o-Fc圖中，每個(gè)半胱氨酸的硫原子之間的距離落在二硫鍵的預(yù)期鍵長(zhǎng)(～2.05?)的范圍內(nèi)。Cys86(A)-Cys119(A)和Cys86(B)-Cys119(C)二硫化物被完全氧化，Cys86(C)-Cys119(B)二硫化物被部分氧化。形成二硫化物的半胱氨酸在來自植物和苔蘚的APSK上是不變的，但是在其他生物的同源物中通常缺失。

注：每個(gè)單體分別以粉色和藍(lán)色著色。 AMP-PNP和APS的位置顯示為棒狀分子。 C86·C119二硫鍵的位置在左單體中表示。 二級(jí)結(jié)構(gòu)特征標(biāo)記在右單體Note:Each monomer is colored in pink and blue, respectively.The positions of AMP-PNP and APS are shown as stick molecules.The position of the C86·C119 disulfide bond is indicated in the left monomer.Secondary structure features are labeled in the right monomer圖2 ATAPSK的二聚體帶狀圖Fig.2 Ribbon diagram of ATAPSK’s dimer

2.2APSK的反應(yīng)機(jī)制植物可以通過2種途徑代謝硫酸鹽，這2種途徑在腺苷5′-磷酰硫酸(APS)的水平上分支。APS可以還原成硫化物，并且被并入主要的硫酸鹽同化途徑的Cys中，或者被APS激酶磷酸化成3-磷酸腺苷5-磷酸硫酸鹽，作為硫酸化反應(yīng)的硫酸鹽供給。

ATP-硫酸化酶(MgATP：硫酸腺苷酰轉(zhuǎn)移酶，EC 2.7.7.4)和APS激酶(MgATP：腺苷酸3′-磷酸轉(zhuǎn)移酶，EC 2.7.1.25)催化硫酸鹽活化的初始步驟：

+46 kJ/mol

-21 kJ/mol

2種酶是能量耦合的，包括無機(jī)焦磷酸酶(△G′0：-6 kcal/mol)的焦磷酸鹽水解將無機(jī)硫酸鹽轉(zhuǎn)化成高反應(yīng)性磺酰化合物PAPS.[14]。APS激酶是將磷酸基團(tuán)從ATP轉(zhuǎn)移到腺苷酸(APS)中核糖部分的3-OH基團(tuán)的小的磷酸轉(zhuǎn)移酶(22-27kDa)。體外研究的所有APS激酶對(duì)10-6M范圍內(nèi)Km的APS具有非常高的親和力。APS激酶的另一個(gè)特征是在沒有ATP的情況下可以看到有效的底物抑制。對(duì)APS激酶的反應(yīng)機(jī)理已從產(chǎn)黃青霉菌和大腸桿菌中廣泛地進(jìn)行研究，但是植物APS激酶研究較少[15-17]，盡管在幾個(gè)較高的植物的葉組織或質(zhì)體中發(fā)現(xiàn)了APS激酶活性，但純化酶的動(dòng)力學(xué)研究?jī)H報(bào)道于綠藻[17]。目前的觀點(diǎn)是植物在質(zhì)體中使用APS進(jìn)行半胱氨酸生物合成，使用PAPS形成硫酸酯[18]。在細(xì)胞質(zhì)中合成硫酸酯類如硫酸化黃酮醇、硫代葡萄糖苷、植物類固醇和植物素[19]，并定位于液泡和高爾基體系?；侵?磺基喹諾基糖基二?；视王?的生物合成也取決于作為磺?；w的體外APS[20]，至于質(zhì)體APS-激酶的功能尚不清楚。質(zhì)體中APS的穩(wěn)定濃度是未知的，但是當(dāng)通過合成，結(jié)合和代謝APS的純化酶的體外測(cè)定估算時(shí)，質(zhì)體中游離APS的濃度可能在納摩爾范圍內(nèi)[21-22]。如果在相同隔室中的同種條件下活躍，則APSkinase將積累PAPS并剝奪其他APS消耗底物的反應(yīng)。 研究表明，在PAPS離開酶后，在ExMgADP復(fù)合物解離前，APS可占據(jù)磺酰基核苷酸結(jié)合位點(diǎn)。這種機(jī)制與從大腸桿菌報(bào)道的APS激酶的機(jī)制不同，其中APS在ATP之前結(jié)合形成酶-APS死端復(fù)合物。

3 APSK的功能

硫是所有活生物體的必需元素，是生物合成多種代謝物和大分子所必需的。植物和原核生物是將周圍環(huán)境中的無機(jī)硫酸鹽(SO42-)轉(zhuǎn)化為生理有用形式的硫的主要同化生物體。硫同化的代謝組織因植物和微生物而異，在酵母、真菌和腸桿菌(包括大腸桿菌)中，將硫酸鹽摻入腺苷-5′-磷酸(APS)中，然后轉(zhuǎn)化為3′-磷酸APS(PAPS)作為生物學(xué)“活化”化合物，其被還原成硫化物。在其他硫酸鹽同化細(xì)菌如銅綠假單胞菌中，APS可用于還原硫化物。 植物具有分叉的硫醇代謝途徑，其反映能適應(yīng)環(huán)境脅迫和營(yíng)養(yǎng)波動(dòng)的固著生物的代謝需要。這些途徑在APS形成后分化。植物中主要硫代謝途徑使用APS作為活化的高能化合物用于硫還原和半胱氨酸的生成，這對(duì)于蛋白質(zhì)、蛋氨酸、鐵-硫簇、維生素輔因子和保護(hù)抗氧化應(yīng)激的化合物(包括谷胱甘肽和植物螯合素肽)的合成至關(guān)重要，或者APS可以轉(zhuǎn)化成PAPS，以提供硫酸鹽供體，用于修飾多種天然產(chǎn)物，油菜素類固醇和茉莉酮酸激素，植物鳥嘌呤和其他磺化分子。APS還原酶(APSR)和APSK分別控制植物中初級(jí)(即還原性)和次級(jí)代謝途徑之間分支點(diǎn)的硫酸鹽分離。APSR催化APS對(duì)亞硫酸鹽(SO32-)和AMP的谷胱甘肽依賴性還原。 植物中APSR的大量研究表明，該酶在通過初級(jí)硫同化途徑調(diào)節(jié)通量方面起關(guān)鍵作用[23]。擬南芥(ATAPSR)的APSR氧化還原反應(yīng)改變的活性調(diào)節(jié)通過調(diào)節(jié)二硫鍵發(fā)生，其在還原時(shí)減弱活性。與APSR相反，APSK在植物硫醇代謝中的作用才開始被檢驗(yàn)到。

對(duì)擬南芥最近的研究表明，腺苷-5磷酸硫酸激酶(APK)提供活性硫酸鹽用于次級(jí)代謝物的硫酸化，腺苷5′-磷酰硫酸激酶的破壞降低硫酸次代謝物水平，包括硫代葡萄糖苷。已經(jīng)成功地隔離這個(gè)家族的4種可能的三重純合突變體組合中的3種。單獨(dú)的APK1同種型足以維持WT的生長(zhǎng)和發(fā)育水平。 分析APK1 APK2 APK3和APK2 APK3 APK4的突變顯示，APK3和APK4功能上是冗余的，盡管分別位于細(xì)胞溶質(zhì)和質(zhì)體。然而，無法分離出APK1 APK3 APK4的突變體，最有可能是因?yàn)锳PK1 APK3 APK4的三倍變體組合是花粉致死的。 因此，APS激酶對(duì)植物繁殖和生存力至關(guān)重要[4,24-26]。

4 APSK氧化還原調(diào)控

在植物中，需要腺苷5′-磷酰硫酸激酶(APSK)的生殖活力，并且在專門的代謝中作為PAPS的硫供體。以前對(duì)擬南芥APSK的研究(ATAPSK)鑒定N末端結(jié)構(gòu)域(NTD)和核心支架上半胱氨酸之間形成的調(diào)節(jié)二硫鍵。在植物中，APSK酶活性通過其N末端環(huán)中的Cys86和Cys119間的亞基間二硫鍵進(jìn)行生物化學(xué)調(diào)節(jié)。這種硫醇開關(guān)是苔蘚、裸子植物和被子植物獨(dú)有的[27]。在植物中，分支點(diǎn)從APS進(jìn)入亞硫酸鹽或PAPS可以通過氧化還原條件來調(diào)節(jié)。硫醇基氧化還原開關(guān)差異性調(diào)節(jié)APS還原酶和APSK的活性[23,28-29,40]。還原減弱APS還原酶活性并增強(qiáng)APSK活性，而氧化加速APS還原酶并減弱APSK產(chǎn)生的PAPS[23,28-29,40]。他們的相互氧化還原調(diào)節(jié)提供了一種根據(jù)細(xì)胞條件將硫通量引導(dǎo)到初級(jí)硫代謝(APS還原酶)或?qū)ｉT代謝(APSK)的方法。

植物中的氧化還原敏感性的APSK在綠色植物譜系硫同化途徑分叉后進(jìn)化，提供一種通過APS將硫流分配成質(zhì)體中的初級(jí)和特異性硫醇代謝途徑的控制機(jī)制[23，28-30]。來自擬南芥APSK的早期生物化學(xué)研究表明，大腸桿菌硫氧還蛋白可以介導(dǎo)類似的氧化還原調(diào)節(jié)[31]，這與通過硫氧還蛋白還原二硫化物的共同靶標(biāo)識(shí)別機(jī)制一致[32]。在植物中，氧化應(yīng)激增加對(duì)半胱氨酸和谷胱甘肽的需求，并在導(dǎo)致這些分子的主要途徑中激活2種關(guān)鍵酶(APS還原酶和谷氨酸-半胱氨酸連接酶)[33-36]。氧化條件減弱APSK活性，以限制APS在次級(jí)途徑中的使用。 因此，APS分支點(diǎn)的相互調(diào)節(jié)可以通過細(xì)胞氧化還原狀態(tài)來控制。最近研究表明，2,8-二羥甲基二苯并噻吩S-氧化物在光氧化過程中產(chǎn)生的O(3P)能夠調(diào)節(jié)硫醇?xì)埢趸疉PSK[28]。已經(jīng)證明該方法提供一種調(diào)節(jié)APSK氧化的有效手段及合適的光化學(xué)手段來調(diào)控APSK酶的活性。

5 APSK重組酶動(dòng)力學(xué)分析

合成重組APK作為融合蛋白與谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST-APK)或作為與麥芽糖結(jié)合蛋白的融合蛋白。 我們懷疑植物APS激酶可能通過污染重組蛋白質(zhì)制備物或商業(yè)凝血酶和因子Xa制劑中的蛋白酶而對(duì)降解非常敏感。而純化的APK融合蛋白非常穩(wěn)定，在-70 ℃儲(chǔ)存1年或在室溫下孵育24 h后沒有催化活性損失。

由于發(fā)現(xiàn)融合蛋白是具有功能性的，所以可以直接用融合蛋白進(jìn)行動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)。 我們使用酶偶聯(lián)測(cè)定法測(cè)定APS激酶的活性。Lee等[37]研究表明，將APS滴定至含有5 mmol/L ATP的反應(yīng)混合物中顯示速度線性增加至10 mmol/L APS，但在較高的APS濃度下被抑制。在此試驗(yàn)中，最大速度為0.3 U/mg。與4種不同的酶制劑(2種MAL-APK和2種GST-APK)得到的結(jié)果相同，盡管比活度范圍為0.3～0.5 U/mg。 該分析表明，理論Vmax為1.2 U/mg，動(dòng)力學(xué)常數(shù)(Km)對(duì)于APS為3.6 mmol/L，ATP為1.9 mmol/L。所有制備物顯示相同的動(dòng)力學(xué)常數(shù) 。 最大觀察速度和理論Vmax之間的差異可能是由于在高APS濃度下觀察到的酶抑制。 這些結(jié)果類似于產(chǎn)氣莢膜梭菌和大腸桿菌報(bào)道的結(jié)果。其中它被解釋為APS是與ATP相關(guān)的非競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑。應(yīng)該注意的是，由于活性測(cè)量使用其中65%是麥芽糖結(jié)合蛋白(MAL-APK)或谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(GST-APK)的APK融合蛋白進(jìn)行，更實(shí)際的比活性可以是3倍以上 ，即0.9～1.5 U/mg[37]。這個(gè)值遠(yuǎn)低于產(chǎn)黃青霉APS激酶(24 U/mg)和大腸桿菌(153 U/mg)的比活性，但接近來自萊茵衣藻的純APS激酶(2.2 U/mg )和釀酒酵母(0.8 U/mg)的比活性。

6 討論

植物中的硫同化途徑支持硫原子初級(jí)代謝中硫的還原和半胱氨酸的合成以及次級(jí)代謝的硫化分子的產(chǎn)生。通過APSR和APSK的活性平衡植物中初級(jí)和次級(jí)代謝途徑間硫酸鹽的分離。最近的工作揭示APSK對(duì)擬南芥生殖生存力的重要作用，但是這種酶在植物中的生物化學(xué)調(diào)節(jié)尚不清楚[23-26]。AtAPSK的結(jié)構(gòu)和功能研究提供PAPS形成的分子基礎(chǔ)和這一重要代謝分支酶的氧化還原控制的見解。提出APSK的反應(yīng)順序首先遵循ATP·Mg2+結(jié)合的順序機(jī)制，然后進(jìn)行APS催化，釋放PAPS，釋放ADP·Mg2+[38]。

APS激酶通過硫代葡萄糖苷網(wǎng)絡(luò)的MYB因子在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)節(jié)[39]。轉(zhuǎn)錄物水平也對(duì)硫酸鹽饑餓有反應(yīng)，并與硫代葡萄糖苷的其他基因網(wǎng)絡(luò)相結(jié)合，抑制mRNA。此外，在APSK酶活的氧化還原調(diào)節(jié)中，植物APS激酶具有氧化還原活性半胱氨酸對(duì)，當(dāng)其減少時(shí)，增加催化效率并降低APS的抑制作用。由于APS還原酶被氧化激活，氧化還原調(diào)節(jié)可能有助于控制初級(jí)和次級(jí)代謝之間的硫分配[23,40-41]。然而，這需要在體內(nèi)證明。 來自其他生物體的APS激酶與植物蛋白質(zhì)類似，作為PAPS合成酶蛋白質(zhì)的一部分或作為獨(dú)立的酶[42]。除植物外，APS激酶尚未被證明是高度受調(diào)節(jié)的，也不被認(rèn)為是硫代謝的關(guān)鍵調(diào)節(jié)步驟。這與植物特異性的氧化還原敏感性半胱氨酸對(duì)一致。

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