楊方浩，侯利園，苑瑞東，程曉磊，黎瀅靜

(吉林大學(xué)，長(zhǎng)春 130012)

過(guò)去的幾十年間，我國(guó)化肥用量逐年遞增，而肥料利用率卻僅有30%～50%[1]，過(guò)剩的富營(yíng)養(yǎng)元素隨著農(nóng)田排水或地表徑流進(jìn)入河流湖泊，對(duì)生態(tài)環(huán)境造成巨大威脅，使我國(guó)各大水系均面臨不同程度的富營(yíng)養(yǎng)化。為了加強(qiáng)養(yǎng)分資源綜合管理、改善土壤質(zhì)量、實(shí)現(xiàn)農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展，配方肥、生物有機(jī)肥、新型肥料的開(kāi)發(fā)等措施是滿足糧食從高產(chǎn)高效到優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)高效，再到提質(zhì)增效轉(zhuǎn)型升級(jí)的有效手段。

藻類污水生物處理技術(shù)最早是在1957年由Oswal等[2]提出，截至目前，挪威、日本已開(kāi)展培養(yǎng)微藻進(jìn)行環(huán)境保護(hù)研究[3]。我國(guó)微藻處理污水已經(jīng)應(yīng)用于生活污水、味精廢水、養(yǎng)殖場(chǎng)廢水、工業(yè)廢水等相當(dāng)廣泛的行業(yè)中[4-7]。在眾多微藻中，小球藻在無(wú)光異養(yǎng)條件下將廢水中的銨態(tài)氮轉(zhuǎn)化為細(xì)胞中的蛋白質(zhì)、葉綠素等含氮物質(zhì)，對(duì)氮、磷的最大吸收利用率達(dá)80%左右[8-9]，很多學(xué)者已將上述微藻深度脫氮除磷與擴(kuò)大微藻生物量、制備藻類油脂等技術(shù)進(jìn)行了耦合[10-12]。此外，藻類又因其具有固氮特性而被作為肥料施用于糧食、果蔬、花卉和草坪等作物上，達(dá)到促進(jìn)種子萌發(fā)，提高產(chǎn)量，改善品質(zhì)和土壤質(zhì)量的目的[13-16]。然而，由于在利用過(guò)程中對(duì)藍(lán)藻未經(jīng)任何處理，一些產(chǎn)毒的水華藍(lán)藻釋放的毒素對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)具有潛在威脅，使其推廣應(yīng)用受到一定限制，因此，截至目前國(guó)內(nèi)鮮有類似研究成果報(bào)道。筆者將微藻脫氮除磷與農(nóng)業(yè)微藻肥料技術(shù)進(jìn)行了耦合，以生長(zhǎng)速度快、固氮吸磷能力強(qiáng)，且不分泌藻毒素的單細(xì)胞淡水微藻小球藻為供試藻株，開(kāi)展廢水-微藻體統(tǒng)中富營(yíng)養(yǎng)元素富集效率及廢水培養(yǎng)小球藻對(duì)擬南芥生長(zhǎng)的影響，旨在為揭示富營(yíng)養(yǎng)元素在廢水-微藻-作物系統(tǒng)中的循環(huán)利用機(jī)理提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1模擬濃縮污水的配置。根據(jù)北方污水成分特征，污水廠二級(jí)出水中氮、磷平均含量分別以50和5 mg/L計(jì)算，來(lái)配置10倍濃縮富營(yíng)養(yǎng)化污水。結(jié)合微藻生長(zhǎng)最適營(yíng)養(yǎng)條件，微藻廢水培養(yǎng)液具體成分及含量為：Tris base 2.42 g/L，NH4Cl 1.6 g/L，MgSO4·7H2O 100 mg/L，CaCl2·2H2O 50 mg/L，K3PO4112 mg/L，Na2EDTA·2H2O 50 mg/L，ZnSO4·7H2O 22 mg/L，H3BO311.4 mg/L，MnCl2·4H2O 5 mg/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 5 mg/L， CoCl2·6H2O 1.6 mg/L，CuSO4·5H2O 1.6 mg/L，(NH4)6Mo7O24·4H2O 1.1 mg/L，Acetic acid 1 mL/L；調(diào)整pH至7.0，于121 ℃高壓滅菌20 min，冷卻至室溫待用。

1.1.2微藻的培養(yǎng)。蛋白核小球藻(Chlorellapyrenoidesa)，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所淡水藻種庫(kù)，采用TAP(Tris-Acetate-Phosphate)固態(tài)培養(yǎng)基進(jìn)行藻種的保存，微藻的液態(tài)培養(yǎng)條件為：智能人工氣候培養(yǎng)箱內(nèi)25 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)；光照強(qiáng)度3 000～6 000 LX；光照周期12 h∶12 h(光照∶黑暗)。小球藻生長(zhǎng)曲線的測(cè)定：每天取微藻培養(yǎng)液2 mL，采用血球計(jì)數(shù)板法，顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)小球藻的細(xì)胞濃度。

1.2方法

1.2.1廢水中氨氮、全磷濃度的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)。每天從廢水微藻混合體系中抽取水樣，并過(guò)濾微藻，通過(guò)AA3連續(xù)流動(dòng)分析儀對(duì)水樣中剩余氨氮和全磷含量進(jìn)行測(cè)定。

1.2.2擬南芥的盆栽試驗(yàn)。供試土樣為貧營(yíng)養(yǎng)土壤，采集自吉林省松原市，其基本理化性質(zhì)為：全氮含量(1.13±0.14)g/kg，有效磷含量(12.43±1.56)mg/kg，有效鉀含量(100.55±3.85)mg/kg，有機(jī)質(zhì)含量(14.66±1.59)g/kg。以擬南芥為供試植物，進(jìn)行微藻肥效試驗(yàn)，共設(shè)置4個(gè)處理：處理①，不施加任何肥料(CK)；處理②、③為濃縮廢水培養(yǎng)后收集所得小球藻藻液，重懸于水溶液，含水率為95%左右，其中處理②藻液為鮮藻液，未經(jīng)破碎處理，而處理③為超聲波破碎藻液；處理④為2.0 g復(fù)合肥溶于500 mL水后的營(yíng)養(yǎng)液。在擬南芥出苗后，每5 d用上述不同處理溶液澆灌1次，每次50 mL，測(cè)定不同生長(zhǎng)期的擬南芥植株高度，并測(cè)定成株的根系長(zhǎng)度，每處理重復(fù)3次。

1.2.3土壤酶活性的測(cè)定。對(duì)不同生長(zhǎng)期的擬南芥進(jìn)行根系周圍土壤樣本采樣，每次處理采集6個(gè)土壤平行樣本，其中3個(gè)樣本進(jìn)行含水率測(cè)定，對(duì)另外3個(gè)樣本土壤中過(guò)轉(zhuǎn)化酶和脲酶活性進(jìn)行定量測(cè)定。土壤脲酶采用苯酚鈉-次氯酸鈉比色法測(cè)定；土壤蔗糖酶采用3，5-二硝基水楊酸比色法[17]測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1小球藻生長(zhǎng)曲線的繪制從圖1可見(jiàn)，蛋白核小球藻(Chlorellapyrenoidesa)在異養(yǎng)條件下繁殖速度較快，每6～8 h翻倍1次，在培養(yǎng)第4～6天達(dá)到最大生物量。在高氮、磷模擬污水條件下，該藻的生長(zhǎng)并未受到抑制，最高生物量出現(xiàn)在培養(yǎng)第5天，此時(shí)小球藻的細(xì)胞濃度最高值約為3.3×107個(gè)/mL，隨后進(jìn)入生長(zhǎng)穩(wěn)定期。前期試驗(yàn)在無(wú)氮源條件下培養(yǎng)小球藻，結(jié)果幾乎無(wú)生物量增長(zhǎng)(待發(fā)表數(shù)據(jù))，這驗(yàn)證了氮元素是小球藻生長(zhǎng)的必須元素，外源氮的引入對(duì)小球藻的生長(zhǎng)起到了促進(jìn)作用。

圖1 小球藻在高濃縮模擬污水條件下的生長(zhǎng)曲線Fig.1 Growth curve of Chlorella pyrenoidesa in high concentrated wastewater

2.2小球藻對(duì)污水中氨氮的吸收率根據(jù)以上生長(zhǎng)周期狀況，對(duì)整個(gè)繁殖期小球藻吸收消耗氨氮的情況進(jìn)行研究，結(jié)果見(jiàn)圖2。從圖2可見(jiàn)，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，小球藻的生物量不斷積累，污水中氨氮濃度逐漸降低，并在培養(yǎng)后期達(dá)到吸附飽和狀態(tài)，此時(shí)小球藻對(duì)高濃度含氮廢水中氨氮的吸收去除率達(dá)到80%左右，表明小球藻對(duì)模擬污水中的氨氮有很強(qiáng)的去除能力，可用于實(shí)際污水中氨氮的去除，使污水經(jīng)生物凈化處理后可進(jìn)行達(dá)標(biāo)排放。

圖2 氨氮含量隨小球藻培養(yǎng)時(shí)間的變化趨勢(shì)Fig.2 The variation trend of -N content with culture time

2.3小球藻對(duì)污水中磷的吸收率生活廢水中的磷主要來(lái)源于人體排磷和生活洗滌排磷，磷作為微藻生長(zhǎng)繁殖的營(yíng)養(yǎng)元素，部分可直接被其吸收利用，然而，微藻對(duì)污水中磷元素的去除率遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于對(duì)氮的去除效率。該試驗(yàn)設(shè)置了正磷酸鹽含量為50 mg/L的模擬水樣，對(duì)小球藻在高濃度含磷廢水中的生長(zhǎng)情況及含磷量進(jìn)行動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，結(jié)果表明，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，小球藻不斷增殖，模擬污水中的總磷含量呈遞減趨勢(shì)，當(dāng)生物量達(dá)到最大值時(shí)，小球藻對(duì)磷的吸附趨于飽和狀態(tài)，最大去除率為62.72%。普通生活污水中磷含量約在10 mg/L，小球藻對(duì)磷有較強(qiáng)的吸附能力，可以用于實(shí)際污水的生物凈化處理，且處理后可達(dá)到磷達(dá)標(biāo)排放的標(biāo)準(zhǔn)。

圖3 全磷含量隨小球藻培養(yǎng)時(shí)間的變化趨勢(shì)Fig.3 The variation trend of TP content with culture time

2.4廢水培養(yǎng)小球藻藻液肥對(duì)擬南芥植株生長(zhǎng)的生物肥效對(duì)于微藻廢水資源化的后續(xù)利用，近幾年的研究工作主要集中于微藻的生物質(zhì)能源的制備和生物肥料的應(yīng)用2個(gè)方面[12，18-19]。該研究為了驗(yàn)證小球藻藻液的生物肥效，對(duì)擬南芥整個(gè)生長(zhǎng)期的株高和根長(zhǎng)進(jìn)行了監(jiān)測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖4、5。從圖4可以看出，擬南芥生長(zhǎng)株高曲線呈“S”型增長(zhǎng)趨勢(shì)，在藻液肥施用20 d內(nèi)，與CK相比，不同藻液處理對(duì)擬南芥的生長(zhǎng)并無(wú)顯著的肥效；而后隨著生長(zhǎng)期的延長(zhǎng)，株高長(zhǎng)勢(shì)明顯，各處理的株高從大到小依次為處理④、處理③、處理②、處理①(CK)；從圖5可見(jiàn)，處理③小球藻藻液肥施用后，擬南芥平均根長(zhǎng)比處理②的擬南芥平均根長(zhǎng)要長(zhǎng)出12.7%，其肥效更顯著，說(shuō)明破碎細(xì)胞對(duì)于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的釋放相較未破碎小球藻細(xì)胞更迅速。小球藻可利用水中銨態(tài)氮將其轉(zhuǎn)化為細(xì)胞中的含氮化合物，參與代謝途徑，經(jīng)高濃度富營(yíng)養(yǎng)污水培養(yǎng)后，小球藻體內(nèi)累積了大量的氮磷營(yíng)養(yǎng)鹽，經(jīng)破碎處理后，胞內(nèi)基質(zhì)得到徹底釋放，對(duì)作物營(yíng)養(yǎng)供給快，而未破碎小球藻藻液則通過(guò)活體代謝或死亡釋放胞內(nèi)養(yǎng)分，因此對(duì)植物供養(yǎng)較緩慢，且肥力較持久。

圖4 不同處理藻液對(duì)擬南芥生長(zhǎng)株高的影響Fig.4 Effects of different treatments of algae on the plant height growth of Arabidopsis thaliana

2.5小球藻藻液肥施用后對(duì)土壤酶活性的影響從圖6可以看出，加入普通有機(jī)肥后土壤中脲酶活性的變化最大，達(dá)到200 μg左右，與CK相比，不同處理藻液肥對(duì)土壤脲酶活性均起到不同程度的激活作用；而對(duì)于土壤蔗糖酶活性，培養(yǎng)前5 d，各處理間蔗糖酶活性無(wú)顯著差異，隨時(shí)間的延長(zhǎng)，肥料中的營(yíng)養(yǎng)元素在土壤中逐漸釋放，土壤蔗糖酶活性隨之升高，且施肥處理略高于對(duì)照組酶活性，但藻液肥與有機(jī)肥處理間酶活性無(wú)顯著性差異，培養(yǎng)15 d后，蔗糖酶活性隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)呈下降趨勢(shì)，由于蔗糖酶的活性與土壤有機(jī)碳、全氮含量有一定相關(guān)性[20]，因此，在培養(yǎng)后期，土壤中碳氮不斷被消耗導(dǎo)致其含量下降，使蔗糖酶因失去底物而降低活性。

圖5 不同處理藻液對(duì)擬南芥根長(zhǎng)的影響Fig.5 Effects of different treatments of algae on the root length of Arabidopsis thaliana

圖6 不同處理藻液對(duì)土壤酶活性的影響Fig.6 Effects of different treatments of algae on the activities of soil enzymes

3 討論與結(jié)論

在對(duì)眾多淡水微藻吸收氮、磷的能力的研究中發(fā)現(xiàn)，小球藻(Chlorellavulgaris)、柵藻(Scenedesmusobliquus)、衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)的脫氮除磷能力相對(duì)較高[21]。該研究結(jié)果表明，小球藻對(duì)富營(yíng)養(yǎng)污水的凈化效果較顯著，且對(duì)高濃度富營(yíng)養(yǎng)污水氨氮的吸附去除率高于對(duì)磷鹽的富集效率，在有氧條件下，硝酸鹽、亞硝酸鹽和銨鹽可以用于小球藻代謝過(guò)程中氨基酸和蛋白質(zhì)等物質(zhì)的合成；磷酸鹽可以直接被藻細(xì)胞吸收，并通過(guò)多種磷酸化途徑轉(zhuǎn)化成ATP和磷脂等有機(jī)物，使得藻細(xì)胞能同化污水中過(guò)剩的營(yíng)養(yǎng)鹽轉(zhuǎn)化為自身的生物量，從而降低污水中的氮、磷含量。

我國(guó)北方富營(yíng)養(yǎng)化污水的污染物成分相對(duì)較簡(jiǎn)單，主要以氮、磷營(yíng)養(yǎng)元素及無(wú)機(jī)鹽類為主，廢水培養(yǎng)微藻可以進(jìn)行有效資源的后續(xù)利用。該研究結(jié)果顯示，廢水資源化小球藻對(duì)作為生物藻液肥對(duì)擬南芥的生長(zhǎng)具有一定促進(jìn)作用，從廢水中吸收固定的富營(yíng)養(yǎng)元素以肥料的形式釋放到土壤中，經(jīng)過(guò)土壤微生物的作用，供植物生長(zhǎng)利用，土壤脲酶活性的測(cè)定結(jié)果表明，藻液肥施用后土壤的氮素狀況良好，擬南芥生長(zhǎng)情況與氮肥釋放效果有較強(qiáng)的一致性?；诟粻I(yíng)養(yǎng)污水培養(yǎng)而得到的微藻之所以可被用作農(nóng)業(yè)肥料，原因是一方面可以為農(nóng)作物提供其生長(zhǎng)所必須的氮、磷等營(yíng)養(yǎng)元素，促使葉菜類、馬鈴薯等作物達(dá)到增產(chǎn)增收的效果，另一方面能夠節(jié)約化肥施用量[19，22]。

國(guó)外學(xué)者對(duì)微藻廢水資源化的后續(xù)利用研究較多，主要圍繞廢水培養(yǎng)微藻來(lái)制備生物質(zhì)肥料。Wuang等[23]揭示了廢水培養(yǎng)微藻所獲取生物質(zhì)可作為生物肥料促進(jìn)小麥增收，且可節(jié)約土壤中25%的氮肥施用量；國(guó)內(nèi)有關(guān)將微藻廢水資源化與藻液肥在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上的高值化利用相結(jié)合的報(bào)道較少。因此，未來(lái)的研究應(yīng)將環(huán)境問(wèn)題最小化和有限資源的合理回收利用更緊密地結(jié)合，為今后發(fā)展環(huán)境友好型節(jié)肥農(nóng)業(yè)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

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