龐春艷,王　慧,王志華,馮秀媛,王永福

(1.包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院風(fēng)濕免疫科 包頭醫(yī)學(xué)院風(fēng)濕免疫研究所,內(nèi)蒙古 包頭 014010;2.內(nèi)蒙古自治區(qū)自體免疫學(xué)重點實驗室,內(nèi)蒙古 包頭 014010)

干燥綜合征(Sj?gren’s syndrome，SS)是一種以淋巴細(xì)胞浸潤為特征的自身免疫性疾病，由于外分泌腺分泌減少，臨床上主要表現(xiàn)為口、眼干燥等癥狀，?？衫奂岸鄠€臟器。但目前對于SS確切的發(fā)病機制尚不清楚。非肥胖糖尿病(non-obese diabetes，NOD)小鼠可自發(fā)地出現(xiàn)外分泌腺淋巴細(xì)胞的浸潤，血清中可檢測到多種自身抗體和炎性細(xì)胞因子，如抗SSA抗體、抗SSB抗體、抗M3R抗體、白細(xì)胞介素17(IL-17)和白細(xì)胞介素23(IL-23)等，進(jìn)而出現(xiàn)相應(yīng)的分泌功能減弱[1]，與人類的SS癥狀極其相似。因此，NOD小鼠是目前公認(rèn)的SS動物模型。國內(nèi)外研究[2-3]顯示：SS患者血清中白細(xì)胞介素10(IL-10)的表達(dá)水平較健康對照者下降，提示SS患者IL-10表達(dá)水平較低。房星星等[4]研究人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)對SS患者CD4+T細(xì)胞增殖的影響發(fā)現(xiàn)：MSCs通過促分泌轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)、白細(xì)胞介素16(IL-6)和IL-10從而抑制SS患者CD4+T細(xì)胞的活化增殖。Heoa等[5]研究發(fā)現(xiàn)：IL-10可以抑制Th17細(xì)胞的活化，誘導(dǎo)Treg細(xì)胞比例的增加，提示IL-10作為一種抗炎因子，對自身免疫性疾病起重要的治療作用。因此，IL-10可能是治療SS的靶點。

“睡美人”(sleeping beauty，SB)轉(zhuǎn)座系統(tǒng)屬于Tcl/mariner轉(zhuǎn)座子家族，是第一個應(yīng)用于高等哺乳動物細(xì)胞相關(guān)研究的轉(zhuǎn)座子，是目前所知的在脊椎動物中轉(zhuǎn)座效率最高的轉(zhuǎn)座系統(tǒng)。SB轉(zhuǎn)座系統(tǒng)在轉(zhuǎn)基因、基因治療和基因標(biāo)簽等方面均具有十分廣闊的應(yīng)用前景[6]。本研究將IL-10基因和轉(zhuǎn)座子序列整合到腺病毒載體以及含有轉(zhuǎn)座酶的腺病毒載體共同感染C57BL6小鼠脾細(xì)胞，將攜帶腺病毒載體的脾細(xì)胞種植到NOD小鼠皮下，觀察種植脾細(xì)胞后NOD小鼠脾細(xì)胞中CD4+IL-10+、CD4+IFN-γ+、Th17和Treg的變化以及Th1/Th2和Th17/Treg的平衡，為IL-10對SS的治療機制研究提供新的思路。

1　材料與方法

1.1實驗動物、主要試劑和儀器NOD小鼠購自南京大學(xué)-南京生物醫(yī)藥研究院，動物合格證號：201705875。兔抗小鼠的APC標(biāo)記的IL-10、PE標(biāo)記的IFN-γ、PE標(biāo)記的IL-17A、FITC標(biāo)記的CD4、PE 標(biāo)記的CD25和APC標(biāo)記的FOXP3一抗購自美國Abcam公司，Alexa Fluor 488山羊抗兔IgG購自美國Oregon公司，ELSIA試劑盒購自武漢新啟迪生物科技有限公司。流式細(xì)胞儀購自美國BD公司。

1.2含有IL-10基因的腺病毒載體的構(gòu)建化學(xué)合成轉(zhuǎn)座子、IL-10和轉(zhuǎn)座酶的序列，轉(zhuǎn)座子和IL-10序列插入同一腺病毒穿梭質(zhì)粒，IL-10序列位于轉(zhuǎn)座子序列的中間，轉(zhuǎn)座酶插入另一個腺病毒穿梭質(zhì)粒，將上述2個腺病毒穿梭質(zhì)粒分別與包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，通過Cre/loxP重組酶系統(tǒng)的作用實現(xiàn)重組，產(chǎn)生重組腺病毒。成功構(gòu)建含有IL-10基因的腺病毒載體和轉(zhuǎn)座酶的腺病毒載體。同時構(gòu)建不含IL-10只含有轉(zhuǎn)座子的腺病毒載體和無轉(zhuǎn)座酶的腺病毒載體作為陰性對照。上述腺病毒載體由上海吉凱基因公司構(gòu)建。經(jīng)測序發(fā)現(xiàn)插入的序列準(zhǔn)確無誤，每個病毒的滴度均為：1×1011PFU·mL-1。

1.3腺病毒載體感染C57BL6小鼠脾細(xì)胞實驗分為對照組、空載體組和治療組。含有IL-10基因和轉(zhuǎn)座子的腺病毒載體與含有轉(zhuǎn)座酶的腺病毒載體共同感染治療組中的C57BL6小鼠脾細(xì)胞；只含有轉(zhuǎn)座子的腺病毒載體和無轉(zhuǎn)座酶的陰性腺病毒載體共同感染空載體組的C57BL6小鼠脾細(xì)胞；對照組C57BL6小鼠脾細(xì)胞不做任何處理。將上述3組細(xì)胞處理48 h后收集，PBS洗滌2次，采用Trizol提取RNA，RT-PCR法檢測各組小鼠脾細(xì)胞中IL-10 mRNA表達(dá)水平，計算2-ΔΔCt，每組3個復(fù)空，重復(fù)5次。ΔCt=目的基因Ct值-內(nèi)參基因Ct值，ΔΔCt=實驗組Ct值-對照組Ct值。

1.4NOD小鼠皮下種植C57BL6小鼠脾細(xì)胞將上述3組細(xì)胞處理48 h后收集，PBS洗滌2次，100 μL PBS重懸細(xì)胞沉淀，分別注射于對照組、空載體組和治療組NOD小鼠右后腿的腘窩皮下，每組6只小鼠，每周1次，共6次。

1.5ELISA法檢測NOD小鼠血清中IL-10表達(dá)水平注射后4周處死NOD小鼠，心臟采血，離心分離血清，-80℃保存，ELISA法檢測NOD小鼠血清中IL-10表達(dá)水平。步驟如下：分別將100 μL標(biāo)本和不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品加入孔中，37℃孵育90 min，洗板3次；加抗體工作液100 μL，37℃孵育60 min，洗板3次；加酶結(jié)合物工作液100 μL，37℃孵育30 min，洗板5次；然后加100 μLTMB顯色液，37℃孵育10～20 min；最后加100 μL終止液，450 nm檢測吸光度(A)值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度值和A值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，再根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算血清中IL-10表達(dá)水平。

1.6NOD小鼠脾細(xì)胞中CD4+IL-10+、CD4+IFN-γ+、Th17和Treg細(xì)胞比例注射后4周處死NOD小鼠，無菌條件下取NOD小鼠脾臟，PBS洗滌3次，注射器研磨，細(xì)胞篩過濾，1 500 r·min-1離心10 min，紅細(xì)胞裂解液裂解10 min，1 200 r·min-1離心6 min，RPMI-1640懸細(xì)胞沉淀。將細(xì)胞懸液移至細(xì)胞培養(yǎng)皿中，加5 mL含10%FCS的完全培養(yǎng)基RPMI-1640，5%CO2、37℃培養(yǎng)。加PMA、ionomycin和monensin培養(yǎng)4 h，收集細(xì)胞，100 μL的Flow Staining Buffer 懸細(xì)胞，每一個檢測項目分6管，1管不加任何抗體，另外5管加0.125 μg anti-mouse CD4抗體，檢測Treg時再加0.06 μg 的CD25抗體，4℃避光孵育30 min；加預(yù)冷的Flow Cytometry Staining Buffer 1 000 r·min-1離心5 min，加1 mL新鮮配制的Fixation/Permeabilization工作液，4℃避光孵育30 min；Permeabilization buffer洗滌細(xì)胞2次，在已加抗體的其中4管中分別加0.5 μg的anti-mouse FoxP3、anti-mouse IL-17A、anti-mouse IL-10和anti-mouse IFN gamma抗體，4℃避光孵育30 min；Permeabilization buffer洗滌細(xì)胞2次，F(xiàn)low Cytometry Staining Buffer懸細(xì)胞沉淀，流式細(xì)胞儀檢測。

2　結(jié)　果

2.1C57BL6小鼠脾細(xì)胞中IL-10 mRNA表達(dá)水平腺病毒載體共同感染C57BL6小鼠脾細(xì)胞48 h，治療組脾細(xì)胞中IL-10 mRNA的2-ΔΔct為24.10±9.96，空載體組為2.18±2.53，對照組為1.00±0.00；治療組IL-10 mRNA表達(dá)水平，高于對照組和空載體組(F=72.71，P<0.01)。

2.2各組NOD小鼠血清中IL-10表達(dá)水平注射結(jié)束后4周處死NOD小鼠，對照組、空載體組和治療組IL-10表達(dá)水平分別為(173.04±103.14)、(175.00±222.21)和(559.07±200.02)ng·L-1，治療組NOD小鼠血清中IL-10表達(dá)水平明顯高于對照組和空載體組(F=8.89，P=0.003)。

2.3各組NOD小鼠脾細(xì)胞中CD4+IL-10+細(xì)胞和CD4+IFN-γ+細(xì)胞比例治療組CD4+IL-10+細(xì)胞比例明顯高于對照組和空載體組(F=72.09，P<0.05)。CD4+IFN-γ+細(xì)胞比例3組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(F=2.72，P>0.05)。治療組中IFN-γ+/IL-10+細(xì)胞比值明顯低于對照組和空載體組(F=23.50，P<0.05)。見表1。

2.2各組NOD小鼠脾細(xì)胞中Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞比例治療組NOD小鼠脾細(xì)胞中Th17比例(12.33±0.71)明顯低于對照組(16.40±2.19)和空載體組(15.93±1.29)(F=6.39，P<0.05)；治療組Treg細(xì)胞比例(2.13±0.25)明顯高于對照組(1.33±0.25)和空載體組(1.40±0.10)(F=12.98，P<0.05)。見圖1。

表1各組NOD小鼠脾細(xì)胞中CD4+IL-10+和CD4+IFN-γ+細(xì)胞比例及IFN-γ+/IL-10+細(xì)胞比值

GroupCD4+IL?10+CD4+IFN?γ+IFN?γ+/IL?10+Control6．03±0．6114．77±1．122．48±0．43Emptyvector6．63±0．8715．27±0．712．57±0．44Therapy17．63±2．11?△13．30±1．30?△0．76±0．14?△

*P<0.05 compared with control group；△P<0.05 compared with empty vector group.

圖1　各組NOD小鼠脾細(xì)胞中Th17細(xì)胞(A)和Treg細(xì)胞(B)比例

2.3各組NOD小鼠脾細(xì)胞中Th17/Treg比值治療組Th17/Treg細(xì)胞比值為5.82±0.34，與對照組(12.39±0.92)和空載體組(11.46±1.71)比較明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=29.33，P<0.05)。

3　討　論

SS是一種常見的自身免疫性疾病，常有口干、眼干等癥狀。研究[7-8]發(fā)現(xiàn)：IL-10是一種抗炎因子，在炎癥性疾病和自身免疫性疾病中具有重要的保護作用。Verhenne 等[9]將SB100X系統(tǒng)尾靜脈注射ADAMTS13-/-小鼠發(fā)現(xiàn)：ADAMTS13可以持續(xù)高表達(dá)25周，穩(wěn)定表達(dá)ADAMTS13的小鼠未出現(xiàn)嚴(yán)重的血小板減少或器官損傷，提示SB轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的治療方法可作為血小板減少性紫癜的基因治療方法，說明SB轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)可作為治療SS的一種手段。

Inoue 等[10]研究發(fā)現(xiàn)：白藜蘆醇可以增加NOD小鼠唾液腺中IL-10的表達(dá)，從而對SS的唾液腺功能的失調(diào)起到治療作用。因此，本研究將含有IL-10和SB轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)感染C57BL6小鼠脾細(xì)胞，再將這些脾細(xì)胞注射到NOD小鼠的右后腿的腋窩下，體內(nèi)外檢測均發(fā)現(xiàn)IL-10表達(dá)水平明顯升高，提示SB轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)不論在體外還是體內(nèi)均可以高效表達(dá)IL-10，從而為IL-10治療SS的作用機制研究提供理論依據(jù)。

Th1和Th2細(xì)胞及其比值的失衡在SS的發(fā)病中起重要的作用。Wu等[11]研究白芍總苷(TGP)治療SS的分子機制結(jié)果發(fā)現(xiàn)：將SS的動物模型小鼠分為對照組、羥氯喹(HCQ)組、TGP組和聯(lián)合(TGP+ HCQ)組，對照組IFN-γ、IL-4、Fas和FasL水平明顯高于其他3組；此外，與HCQ組比較，聯(lián)合組上述4種因子表達(dá)水平降低。與對照組比較，TGP組和聯(lián)合組IFN-γ和IL-4比值下降。上述結(jié)果表明：TGP可以通過影響Th1/Th2細(xì)胞因子平衡，同時降低IFN-γ、IL-4、Fas和FasL表達(dá)水平，從而起到治療SS的作用。本研究結(jié)果顯示：含有IL-10的SB轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)可以使NOD小鼠脾細(xì)胞中CD4+IL-10+細(xì)胞比例明顯升高，而CD4+IFN-γ+細(xì)胞略有下降，IFN-γ+/IL-10+比值明顯下降，提示含有IL-10 的SB轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)可以平衡Th1和Th2細(xì)胞的比值，進(jìn)而對SS起到治療作用。

Th17和Treg細(xì)胞及其分泌的細(xì)胞因子在自身免疫性疾病的發(fā)生和發(fā)展過程中起重要作用。Nanke等[12]檢測了15例SS患者唾液腺組織中IFN-γ+細(xì)胞和IL-17+細(xì)胞比例的結(jié)果發(fā)現(xiàn)：SS患者唾液腺組織中可以檢測到上述細(xì)胞的表達(dá)，提示Th1/Th17在SS的病理過程中起重要的作用。多項研究[13-14]表明：SS患者淚液中IL-17表達(dá)水平升高，與淚膜破裂時間(tear film breakup time，TBUT)和基礎(chǔ)淚液分泌實驗(Schirmer Ⅰ test)有密切關(guān)聯(lián)，提示IL-17參與了具有干眼癥的SS患者的發(fā)病過程。Lin等[15]采用唾液腺蛋白免疫野生型小鼠可出現(xiàn)SS的典型癥狀，在唾液腺的淋巴細(xì)胞病灶中可檢測Th17細(xì)胞的增加，免疫IL-17基因敲除的小鼠則不會出現(xiàn)SS的癥狀，過繼免疫Th17細(xì)胞后IL-17基因敲除的小鼠則會出現(xiàn)SS的典型癥狀，唾液的分泌明顯下降，血清中出現(xiàn)自身抗體，進(jìn)而出現(xiàn)明顯的炎癥反應(yīng)和組織損傷。Szodoray等[16]檢測了51例未分化結(jié)締組織病(undifferentiated connective tissue disease，UCTD)患者外周血Th17和Treg細(xì)胞分布的結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與對照組比較，UCTD組Th17細(xì)胞增加，若最終發(fā)展為系統(tǒng)性自身免疫性疾病(systemic autoimmune diseases，SAIDs)時，Th17細(xì)胞的比例進(jìn)一步增加。從對照到UCTD患者Th17/Treg比值逐漸升高，如發(fā)展為SAID患者將會出現(xiàn)最高值。Th17/Treg的失衡可能有助于疾病進(jìn)展，因此Th17/Treg可以作為評估預(yù)后的指標(biāo)。Wang等[17]研究發(fā)現(xiàn)：環(huán)孢素(Cys A)能抑制Th17細(xì)胞的表達(dá)，提示Cys A可以治療SS和其他自身免疫性疾病。本研究結(jié)果顯示：含有IL-10的SB轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)可以降低NOD小鼠脾細(xì)胞中Th17細(xì)胞比例，升高Treg細(xì)胞比例，明顯降低Th17/Treg比值，提示含有IL-10 的SB轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)可以通過調(diào)節(jié)Th17和Treg細(xì)胞比例及其平衡，從而對SS起到一定的治療作用。

綜上所述，通過SB轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)在體內(nèi)體外均可以高表達(dá)IL-10。IL-10高表達(dá)后NOD小鼠脾細(xì)胞中CD4+IL-10+細(xì)胞比例明顯升高，CD4+IFN-γ+細(xì)胞下降，IFN-γ+/IL-10+比值明顯下降，Th17細(xì)胞比例下降，Treg細(xì)胞比例上升，Th1/Th2和Th17/Treg比值明顯下降，提示含有IL-10 的SB轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)可以通過調(diào)節(jié)Th1、Th2、Th17和Treg細(xì)胞比例以及逆轉(zhuǎn)Th1/Th2和Th17/Treg平衡對SS起到一定的治療作用。

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