范英蘭 胡麗萍 朱竟赫 劉 禾 武曉琳 趙文婷 袁 宇

(1.遼寧省中醫(yī)藥研究院，沈陽 110034)(2.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，沈陽 110034)

近年來，心肌缺血性疾病嚴(yán)重威脅著人類的健康，如心律失常、心肌梗死、冠心病等。其發(fā)生率和死亡率呈逐年上升趨勢，嚴(yán)重影響著人們的生命健康安全。成功復(fù)制心肌缺血實(shí)驗(yàn)動物模型的重要性在心肌缺血性疾病的研究與治療方面有著不可比擬的重要性。在構(gòu)建一個(gè)恰當(dāng)?shù)膶?shí)驗(yàn)動物模型前提下，應(yīng)盡可能接近人類心肌缺血性疾病的發(fā)生發(fā)展特征，為探索心肌缺血性疾病奠定理論基礎(chǔ)，進(jìn)一步明確心肌缺血性疾病病因、發(fā)病機(jī)制，并為其防范與治療提供良好的研究平臺。目前，心肌缺血實(shí)驗(yàn)動物模型主要有：急性心肌缺血模型、慢性心肌缺血模型和離體心肌缺血模型。

1 急性心肌缺血模型

急性心肌缺血在臨床上主要表現(xiàn)為急性心絞痛、急性心肌梗死等癥狀，嚴(yán)重者可危及到患者的生命[1]。此模型滿足心肌缺血性疾病的發(fā)病特點(diǎn)，但僅僅適用于短期實(shí)驗(yàn)觀察研究。主要通過開胸手術(shù)、閉胸手術(shù)和藥物等方法建立[2-4]。

1.1 開胸手術(shù)法

開胸手術(shù)法是對實(shí)驗(yàn)動物實(shí)施麻醉，做氣管插管后連接到呼吸機(jī)，開胸后，通過結(jié)扎等手段阻塞一處冠狀動脈左前降支(LAD)或其他分支，從而造成梗死性心肌缺血。該法手術(shù)創(chuàng)傷較大，因此實(shí)驗(yàn)動物存活率并不理想。其中，冠脈結(jié)扎法是開胸手法中最常用的方法。不同動物應(yīng)選擇各自適宜的結(jié)扎部位。如大鼠選擇在肺動脈圓錐左緣與左心耳下緣2 mm處進(jìn)針用6～0無損傷縫線結(jié)扎[2]；兔在冠狀動脈左室支主干第1、2對角支之間結(jié)扎[5]；犬于冠狀動脈左前降支第二角支處穿線結(jié)扎[6]；小型豬結(jié)扎部位為LAD中遠(yuǎn)1/3處[7]。

1.2 閉胸手術(shù)法

閉胸冠狀動脈插管手術(shù)法一般是動脈穿刺后將栓塞物通過導(dǎo)管沿預(yù)先置入冠狀動脈內(nèi)的導(dǎo)絲送入靶血管。該法創(chuàng)傷較小，有利于實(shí)驗(yàn)動物后期的恢復(fù)，動物存活率較高，但要求實(shí)驗(yàn)技術(shù)人員必須具備豐富的心導(dǎo)管實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)。此法常運(yùn)用于犬、小型豬等體型較大的動物。常用的方法有球囊堵塞法及血栓堵塞法等。潘偉民等[8]自制銅網(wǎng)圈支架，利用球囊導(dǎo)管將其送入靶血管，成功構(gòu)建犬急性心肌缺血模型。用Seldingers法從右下肢根部切開分離股動脈，置入動脈鞘導(dǎo)絲，置入6F動脈鞘管，可成功復(fù)制球囊堵賽法模型[9-10]。劉建勛等[3]研究證實(shí)采用心導(dǎo)管介入技術(shù)，經(jīng)左冠狀動脈前降支注入自體血栓，成功制備小型豬心肌缺血模型。

1.3 藥物造模法

藥物造模法通過藥物減少或阻斷實(shí)驗(yàn)動物心臟冠狀動脈的血流量，是目前較為常用的造模方法。該法的優(yōu)點(diǎn)是比較接近人心絞痛的病理狀態(tài)，簡單有效，且給藥劑量比較小時(shí)動物恢復(fù)時(shí)間較短，因此同一實(shí)驗(yàn)動物可進(jìn)行多次反復(fù)實(shí)驗(yàn)研究。

常用的造模藥物有腦垂體后葉素(Pit) 和異丙腎上腺素(ISO)。Pit可造起冠狀動脈血管痙攣，外周阻力增加，心臟負(fù)荷加重，進(jìn)而引起供血不足性心肌損傷。趙靜等[11]選用Wistar大鼠，腹腔注射Pit 20 U/kg體質(zhì)量成功制備心肌缺血模型。王靜等[12]選用家兔，耳緣靜脈注射Pit 2.5U/kg，用0.9%生理鹽水稀釋至3 mL， 注射完畢后，持續(xù)靜脈滴注垂體后葉素注射液(Pit 18U加入0.9%的生理鹽水250 mL中)，成功制備家兔急性心肌缺血模型。楊巧巧等[13]選用SD大鼠，舌下靜脈快速推注Pit 0.5 U/kg(1U/mL)成功復(fù)制心肌缺血大鼠模型。

ISO為人工合成的β受體強(qiáng)激動劑，大劑量應(yīng)用能誘導(dǎo)心肌產(chǎn)生不可逆的缺血性損傷模型，其機(jī)制與脂質(zhì)過氧化損傷、膜通透性改變、增加心肌耗氧量、心肌鈣超載等因素有關(guān)[14-15]。但I(xiàn)SO具體有效使用劑量、給藥方式及給藥次數(shù)尚不統(tǒng)一。丁瑩等[16]發(fā)現(xiàn)腹腔注射鹽酸ISO 30 mg /kg可成功制備大鼠心肌缺血模型。李洪斌等[17]發(fā)現(xiàn)腹腔注射異丙腎上腺素4 mg/kg可成功誘導(dǎo)心肌缺血大鼠模型。趙悅等[18]皮下注射鹽酸異丙腎上腺素10 mg/kg，連續(xù)注射3 d后成功誘導(dǎo)出大鼠急性心肌缺血模型。楊勇等[19]通過不同注射方式及不同給藥劑量研究發(fā)現(xiàn)，腹腔注射ISO 3 mg/kg，連續(xù)注射2 d，可復(fù)制出模型穩(wěn)定的小鼠的急性心肌缺血模型。

2 慢性心肌缺血模型

由于冠狀動脈漸進(jìn)性阻塞或狹窄逐漸導(dǎo)致形成心肌缺血病變。與急性心肌缺血模型相比，更加符合臨床缺血性心臟病的臨床癥狀及病理生理過程，慢性心肌缺血模型適宜較長時(shí)間的心肌功能觀察和多次給藥[20]。制備方法主要有以下幾種。

2.1 冠脈外慢性收縮法

常用Ameriod收縮環(huán)制備慢性心肌缺血模型，將Ameroid縮窄環(huán)套于冠狀動脈血管外，多數(shù)為左冠狀動脈回旋支(LCX)以逐漸閉塞該血管，亦有少數(shù)于前降支(LAD)。張波等[21]選用實(shí)驗(yàn)用巴馬小型豬，采用胸腔鏡技術(shù)，在左冠狀動脈回旋支主干放置Ameroid縮窄環(huán)，術(shù)后第6周經(jīng)選擇性冠狀動脈造影證實(shí)造模成功率達(dá)80%。王建禮等[22]選用雄性新西蘭大白兔，體質(zhì)量(2.5±0.5)kg，在左冠狀動脈回旋支上放置Ameroid縮窄環(huán)。21 d后通過冠狀動脈血管造影證實(shí)兔心肌組織發(fā)生慢性缺血。王勇等[23]采用冠狀動脈前降支第一間隔起始部遠(yuǎn)端放置Ameroid縮窄環(huán)，術(shù)后12周通過冠狀動脈造影、超聲等手段證實(shí)已建立穩(wěn)定慢性心肌缺血模型。施冰等[24]選用健康實(shí)驗(yàn)用小型豬，體質(zhì)量(22.6±4.3)kg，雌雄不限。于左側(cè)第3肋間前外側(cè)切口，剪開心包，游離左回旋支起始部約2～3 cm并在該處套入Ameroid縮窄環(huán)，術(shù)后5周經(jīng)心電圖檢查、冠狀動脈造影、心臟核磁共振檢查及病理學(xué)檢查，證實(shí)慢性心肌缺血模型構(gòu)建成功。

2.2 冠脈內(nèi)慢性狹窄法

冠脈栓塞法是較為常用的方法之一。于實(shí)驗(yàn)動物前降支內(nèi)注入微栓塞球，利用血管造影及CFR測量等檢驗(yàn)技術(shù)，隨時(shí)間推移逐漸栓塞冠狀動脈，造成慢性心肌缺血。該法存在閉塞或狹窄程度不易控制的缺點(diǎn)，故常與高脂飲食法聯(lián)合應(yīng)用造成慢性心肌缺血模型。劉建勛等[25]先給予小型豬高脂飼料喂養(yǎng)2周后，以Launcher 6F右冠導(dǎo)引導(dǎo)管置于左冠狀動脈開口，造影后置入球囊導(dǎo)絲，在導(dǎo)絲指引下置入2.5 mm或3.0 mm球囊至LAD中部，以10 atm打開球囊堵閉LAD，擴(kuò)張3次。術(shù)后繼續(xù)給予高脂飼料2月，制備小型豬慢性心肌缺血模型。

2.3 不完全冠脈結(jié)扎法

冠狀動脈結(jié)扎法是復(fù)制急性心肌缺血模型的主要方法之一，但因其使冠脈完全閉塞，致使手術(shù)創(chuàng)傷較大，動物死亡率較高?；诖朔椒ǖ娜毕菪?，目前應(yīng)用不完全冠脈結(jié)扎法用以制備慢性心肌缺血模型。趙慶斌等[26]將兔用5/0無損傷帶針縫合線穿過左前降支下方， 將直徑不同的粗、細(xì)絲線各一根置于左前降支前緣，將絲線與左前降支一起結(jié)扎，隨后迅速抽出細(xì)絲線，相當(dāng)于血管90%狹窄。觀察左前降支遠(yuǎn)端血管充盈不明顯，左心室前壁和心尖部心肌顏色稍變暗，表明不完全結(jié)扎成功。

2.4 藥物法

目前ISO用于制備慢性心肌缺血模型是一種較為簡單及常用的方法，但其有效使用量國內(nèi)外報(bào)道各不同，且劑量差別較大[27-29]。本實(shí)驗(yàn)室采用比格犬三次小劑量(1.1 mg/kg)皮下注射ISO,心電檢測末次造模后0、0.25、0.5、1、2、4、6、12、24、48、72、96、120 h及144 h多個(gè)時(shí)間點(diǎn)的變化，證實(shí)成功建立穩(wěn)定的慢性心肌缺血模型[30]。李晶華等[31]選用雄性雜種犬，臀大肌注射ISO 0.4 mg/次，每日2次，連續(xù)5 d后，通過心電圖檢測及病理檢測證實(shí)成功復(fù)制了犬慢性心肌缺血模型。大鼠腹腔注射異丙腎上腺素4μg/kg，12 h 1次，連續(xù)48 h可成功制備大鼠慢性心肌缺血模型[32]。嚴(yán)標(biāo)文等[33]選用SD大鼠，腹腔注射ISO 0.04 mg/kg，連續(xù)6 d，通過心電檢測、心肌酶檢測及病理檢測證實(shí)成功制造了大鼠慢性心肌缺血模型。

2.5 高脂飲食與VD3、ISO聯(lián)合誘導(dǎo)法

潘永明等[34]選用小型豬適應(yīng)6 周后，在飼喂高脂飲食的同時(shí)，于造模 0、4、8 周時(shí)耳緣靜脈注射5 萬IU /kg VD3，從第 12 周開始每周 1 次耳緣靜脈注射ISO 25 μg /kg，直至第 24 周結(jié)束。連續(xù)飼養(yǎng)24 周后，通過測定動物體質(zhì)量、心電圖、活動、血脂、心肌酶、血液流變學(xué)、炎癥、心臟指數(shù)(CI) 和心肌缺血面積(MIS) 表明成功構(gòu)建了痰瘀互結(jié)證慢性心肌缺血小型豬模型。

3 離體心肌缺血模型

主要通過Langendorff灌注系統(tǒng)完成，根據(jù)不同研究目的，選擇缺氧(或缺血)，一定時(shí)間后再恢復(fù)給氧(或再灌注)，通過儀器記錄心肌功能的變化規(guī)律。該法可排除機(jī)體代謝對實(shí)驗(yàn)的影響，能夠更加真實(shí)準(zhǔn)確地反映出心肌耗氧狀況，給藥劑量及濃度易于掌控。家兔心臟體積適中，模型復(fù)制性好，因此，本法常選用家兔作為研究對象。王靈哲[35]選用新西蘭家兔離體心臟，行主動脈插管結(jié)扎，固定于改進(jìn)的Langendorff灌流裝置，待離體心臟復(fù)跳穩(wěn)定后，結(jié)扎左冠狀動脈前降支，并使用BF-420F生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)同步記錄家兔心電圖及左心室內(nèi)壓動態(tài)變化，結(jié)果表明家兔心肌缺血模型復(fù)制成功。

4 小結(jié)

成功構(gòu)建適宜的實(shí)驗(yàn)動物模型對于人類疾病的研究有著不可取代的重要性，多種構(gòu)建方法逐步開發(fā)，在擁有各自優(yōu)點(diǎn)的同時(shí)也均存在諸多局限性。其中，急性心肌缺血造模法均是借助物理、化學(xué)方法使血管急性阻塞造成心肌急性缺血，與臨床心肌缺血性疾病的發(fā)生發(fā)展的病理過程有著較大差異，此法受多種客觀因素的影響致使實(shí)驗(yàn)動物存活率很低，而且此模型只適宜短期實(shí)驗(yàn)觀察研究；離體心肌缺血造模法由于采用離體實(shí)驗(yàn)，破壞了機(jī)體本身的完整性，因此與整體動物的真實(shí)狀況存在著無法排除的差異性，而且離體心臟也無法長時(shí)間存活；慢性心肌缺血造模法雖然與人類心肌缺血性疾病的發(fā)生發(fā)展過程更為接近，但制備周期一般較長，且對實(shí)驗(yàn)人員的技術(shù)要求較高。因此，建立與人類心肌缺血性疾病的發(fā)生發(fā)展特點(diǎn)相近，制備周期較短，并能進(jìn)行長時(shí)間觀察的造模方法還有待于進(jìn)一步的探索與完善。