張德福，安 慧，張 健，趙禹宗，張 明，郭佳佳，馮 嬌，劉雪飛，李 春，白鳳翎，李鈺金，殷 喆，勵(lì)建榮,*

(1.渤海大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧省高等學(xué)校生鮮食品產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院，生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術(shù)國家地方聯(lián)合工程研究中心，遼寧錦州 121013;2.軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院微生物流行病研究所，病原微生物生物安全國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100071;3.渤海大學(xué)數(shù)理學(xué)院，遼寧錦州 121013;4.榮成泰祥食品股份有限公司，山東榮成 264309)

副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)是一種革蘭氏陰性嗜鹽菌,常存在于河海交匯處及近海的海水、海底沉積物、海產(chǎn)品和鹽漬食品中[1-2]。人們主要通過生食或食用了未充分煮熟的牡蠣等貝類導(dǎo)致急性胃腸炎,一般在食用污染的食物后24 h內(nèi)即發(fā)病,典型癥狀是腹瀉、腹痛、惡心、嘔吐、發(fā)熱,一般持續(xù)3 d即可自愈[1]。現(xiàn)在,副溶血弧菌已成為世界上多個(gè)沿海國家和地區(qū)急性胃腸炎的重要病原菌之一[3-4]。在我國,副溶血弧菌引起的食物中毒已高居微生物性食物中毒的第二位[4]。

近些年來,隨著生活水平的提高和交通運(yùn)輸條件的改善,越來越多的人接觸到海鮮食品,對(duì)海產(chǎn)品的消費(fèi)需求不斷增加。然而,細(xì)菌感染的快速傳播給養(yǎng)殖業(yè)造成極大的威脅。因此,養(yǎng)殖業(yè)者經(jīng)常以亞致死劑量預(yù)防細(xì)菌感染或作為促生長劑而使用大量的抗菌藥物[5-6];但是,藥物選擇壓力使敏感株死亡,耐藥株生存下來,這是養(yǎng)殖業(yè)不斷出現(xiàn)耐藥性致病菌的主要推動(dòng)因素[7]。其次,由于臨床和養(yǎng)殖業(yè)中抗菌藥物的不規(guī)范使用及畜禽糞便的不規(guī)范處理,不僅導(dǎo)致耐藥菌的大量出現(xiàn),藥物殘留造成的環(huán)境污染也加速了多藥耐藥(multi-drug resistance,MDR)細(xì)菌及其基因的傳播和擴(kuò)散,存在著其它細(xì)菌將耐藥性轉(zhuǎn)移給副溶血弧菌的風(fēng)險(xiǎn)[8]。耐藥性副溶血弧菌可以通過食物鏈傳播給人類,不僅給海水養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大經(jīng)濟(jì)損失,也嚴(yán)重威脅人民群眾的食品安全和身體健康[6,9-10]。丹麥等國家已有多起因食源性耐藥菌感染導(dǎo)致治療失敗而使患者死亡的事件[9],因此副溶血弧菌的耐藥問題應(yīng)引起重視。本文將對(duì)世界上多個(gè)國家副溶血弧菌耐藥性的情況及其耐藥機(jī)理的研究現(xiàn)狀進(jìn)行綜述,并對(duì)發(fā)展前景進(jìn)行分析。

1 世界上多個(gè)國家對(duì)副溶血弧菌耐藥性的報(bào)道

世界上多個(gè)國家和地區(qū)都有關(guān)于副溶血弧菌耐藥性的報(bào)道,主要集中于沿海國家和地區(qū)。因國家和地區(qū)地理位置的不同及菌株來源的差異等因素的影響,副溶血弧菌的耐藥譜存在較大差別,甚至對(duì)多種不允許應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的藥物也出現(xiàn)了耐藥,這應(yīng)當(dāng)引起相關(guān)人員的關(guān)注。

1.1 亞洲

1.1.1 東亞

1.1.1.1 中國 2017年,譚煥騰等[11]對(duì)2013～2015年的杭州地區(qū)腹瀉患者副溶血弧菌耐藥調(diào)查研究發(fā)現(xiàn),副溶血弧菌對(duì)常見抗菌藥物敏感性較高,但耐藥率有所上升,120株菌中的65.8%對(duì)氨芐西林耐藥,而90.0%以上的副溶血弧菌對(duì)喹諾酮類、第三代頭孢菌素類、氨基糖苷類、四環(huán)素類和磺胺類等較敏感。

2016年,周方滿等[12]對(duì)2307例急性腹瀉病患者糞便標(biāo)本中檢出的180株副溶血弧菌使用VITEK2 Compact進(jìn)行藥敏分析發(fā)現(xiàn),副溶血弧菌對(duì)青霉素類、第一代和第二代頭孢菌素類的耐藥率較高,如對(duì)氨芐西林、頭孢唑啉和頭孢西叮的耐藥率分別為96.7%、88.9%和46.6%。He等[13]對(duì)分離自2013～2014年上海水產(chǎn)品市場(chǎng)蝦中的400株副溶血弧菌的耐藥譜進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)其具有較高的耐藥性——99%的菌株對(duì)氨芐西林耐藥,對(duì)鏈霉素、利福平和大觀霉素耐藥的比較稍低,依次為45.25%、38.25%和25.50%。其中,斑節(jié)對(duì)蝦中分離到的副溶血弧菌有24%表現(xiàn)出多藥耐藥性。脊尾白蝦、凡納濱對(duì)蝦和羅氏沼蝦中的這一比例分別是19%、12%和6%。Xu等[14]從2012年11～12月和2013年7～8月間在中國北方六省水產(chǎn)品零售市場(chǎng)采集的260份水產(chǎn)品樣品中分離到145株副溶血弧菌,對(duì)8類、12種藥物的藥敏分析發(fā)現(xiàn),大多數(shù)菌株對(duì)鏈霉素耐藥(86.2%),對(duì)氨芐西林、頭孢唑啉、頭孢噻吩和卡那霉素的耐藥率分別為49.6%、43.5%、35.9%和22.1%,所有菌株都對(duì)阿奇霉素和氯霉素敏感。雷露等[15]對(duì)2012～2013年遼寧省101株副溶血弧菌臨床分離株用微量肉湯稀釋法進(jìn)行12類、16種抗菌藥物的藥敏實(shí)驗(yàn)表明,對(duì)氨芐西林、磺胺甲惡唑和鏈霉素耐藥性較強(qiáng),對(duì)其他藥物具有較高敏感性。Hu等[3]檢測(cè)了2014年從上海水產(chǎn)市場(chǎng)的10種甲殼類和貝類水產(chǎn)品中分離到208株副溶血弧菌的耐藥譜和質(zhì)粒及SXT/R391樣整合接合元件(integrative and conjugative element,ICE)的流行情況等,發(fā)現(xiàn)約74.5%的菌株有多藥耐藥現(xiàn)象,其中耐藥比例最高的三種藥物是氨芐西林、利福平和鏈霉素,耐藥率分別為94.2%、93.3%和77.9%。與較高比例的耐藥不同的是,攜帶質(zhì)粒DNA的較少,只有22.6%,而能檢測(cè)到SXT/R391整合接合元件的比例只有4.8%。Xie等[16]對(duì)即食食品中分離的副溶血弧菌耐藥性分析表明,89.7%對(duì)鏈霉素耐藥,51.3%對(duì)頭孢唑啉耐藥,51.3%對(duì)氨芐西林耐藥。

2015年,Xie等[17]自2013年5月至2014年1月從中國南方4省11個(gè)城市的水產(chǎn)品零售市場(chǎng)采集了224份樣品,從其中的98份樣品中分離到150株副溶血弧菌。藥敏分析發(fā)現(xiàn),分離到的大多數(shù)副溶血弧菌對(duì)鏈霉素(88.67%)、頭孢唑啉(66.00%)和氨芐西林(62.67%)耐藥,都對(duì)氯霉素敏感。

2011年,吳蓓蓓等[18]對(duì)分離自寧波地區(qū)的副溶血弧菌的研究表明,對(duì)青霉素類、磺胺類藥物耐藥率極高,超過95%,多個(gè)菌株有多藥耐藥情況。

綜上情況來看,我國研究人員分離的大多數(shù)菌株對(duì)氨芐西林耐藥最嚴(yán)重,其次為鏈霉素和頭孢唑啉,還有部分菌株對(duì)利福平有耐藥;大多數(shù)菌株對(duì)喹諾酮類、大環(huán)內(nèi)酯類、酰胺醇類等敏感性較高。

1.1.1.2 韓國 2016年,Kang等[19]自2014年6～10月收集了韓國西海岸的牡蠣中的71株副溶血弧菌,通過對(duì)9類、16種抗菌藥物的檢測(cè)分析發(fā)現(xiàn),所有株都對(duì)氨芐西林和萬古霉素耐藥,對(duì)頭孢噻吩、利福平和鏈霉素的耐藥率分別是52.2%、50.7%和50.7%。

2012年,Jun等[20]對(duì)韓國19株來自于市售海產(chǎn)品、3株來自于環(huán)境和2株來自于臨床的副溶血弧菌對(duì)8類、22種抗菌藥物的耐藥譜分析發(fā)現(xiàn),所有菌株至少對(duì)四類藥物耐藥,攜帶的耐藥基因有tetA(介導(dǎo)對(duì)四環(huán)素耐藥)和strB(介導(dǎo)對(duì)鏈霉素耐藥)等,其比例為25%和4.16%。

2011年,Oh等[21]研究了2005～2007年間分離自養(yǎng)殖魚類的180個(gè)樣品中的218株副溶血弧菌對(duì)10類、15種抗菌藥物的耐藥譜,發(fā)現(xiàn)65.1%的副溶血弧菌對(duì)至少一類抗菌藥物有耐藥性,其中對(duì)氨芐西林的耐藥率最高,達(dá)57.8%,其余的依次是利福平(11.9%)、鏈霉素(8.7%)和甲氧芐氨嘧啶(6.4%),對(duì)四類以上藥物耐藥的比例為5%。

1.1.2 東南亞 2016年,You等[22]分析了馬來半島西岸不同地方包括副溶血弧菌在內(nèi)的138株、15種弧菌的耐藥譜和質(zhì)粒存在情況。耐藥性較高的藥物有紅霉素、氨芐西林和美西林,而耐藥性較低的有氨曲南、頭孢吡肟、四環(huán)素、復(fù)方新諾明和磺胺類;所有菌都對(duì)亞胺培南、諾氟沙星、氧氟沙星、氯霉素、復(fù)方新諾明和土霉素敏感。95%的菌株對(duì)至少1類抗菌藥物耐藥,這些耐藥株有32個(gè)不同的質(zhì)粒類型,其分子量從2.2～24.8 kbp不等,這表明在馬來半島西岸的水生環(huán)境中,多藥耐藥弧菌是很普遍的。Tra等[23]調(diào)查了越南零售市場(chǎng)蝦中弧菌的流行情況和耐藥情況,202份樣品中201份檢出了弧菌,副溶血弧菌是最常見的,有96.5%的樣品中檢出。實(shí)驗(yàn)用的藥物中,副溶血弧菌中耐藥性由高到底居前三位的分別是氨芐西林(87.2%)、復(fù)方新諾明(18.5%)和四環(huán)素(24.6%),多藥耐藥的比例為16.9%。

2015年,Letchumanan等[7]研究了分離自馬來西亞Selangor 州的200株副溶血弧菌對(duì)8類、14種常用藥物的耐藥譜發(fā)現(xiàn),菌株表現(xiàn)出較高的耐藥性,包括一些二線和三線藥物,其中耐藥比例較高的分別是氨芐西林(88%)、阿米卡星(81%)、卡那霉素(70.5%)、頭孢噻肟(73%)和頭孢他啶(51.5%)。多藥耐藥指數(shù)為0.00～0.79,大多數(shù)樣品的為0.36(對(duì)5類抗菌藥物耐藥)。13株trh陽性菌株中,70%的菌株(9/13)對(duì)至少4類抗菌藥物耐藥,6株致病性副溶血弧菌含有質(zhì)粒,一株是染色體介導(dǎo)對(duì)氨芐西林耐藥,其他的是質(zhì)粒介導(dǎo)。86.5%(173/200)的菌株有1～7個(gè)質(zhì)粒。結(jié)果表明,雖然貝類中的副溶血弧菌處于安全的水平,但耐藥的菌株仍然是需要關(guān)注的問題,需要持續(xù)的監(jiān)控。

2014年,Sahilah等[24]篩查了馬來西亞三個(gè)地區(qū)37株副溶血弧菌基因組的耐藥基因,發(fā)現(xiàn)對(duì)不同抗菌物質(zhì)的耐藥比例不同,對(duì)桿菌肽的是92%(34/37),對(duì)青霉素的為89%(33/37),其次是氨芐西林68%(25/37)、頭孢呋辛38%(14/37)、頭孢他啶14%(5/37)和阿米卡星6%(2/37),都對(duì)氯霉素、環(huán)丙沙星、頭孢曲松、恩諾沙星、諾氟沙星、鏈霉素和萬古霉素敏感。

2012年,Banerjee等[25]調(diào)查了馬來西亞兩個(gè)地區(qū)養(yǎng)殖的凡納濱對(duì)蝦中副溶血弧菌等弧菌對(duì)磺胺類、四環(huán)素類等8類藥物的耐藥性,發(fā)現(xiàn)5種弧菌都對(duì)至少1類以上藥物耐藥,其中副溶血弧菌的耐藥性比例為10%。

從以上幾個(gè)研究人員從東南亞幾個(gè)國家分離的副溶血弧菌耐藥情況看,大多菌株對(duì)氨芐西林耐藥較嚴(yán)重,其次是頭孢他啶和阿米卡星,對(duì)其他藥物有敏感性較好,但多藥耐藥菌株較嚴(yán)重,比例可達(dá)10%以上。

1.1.3 南亞 2000年,Bhattacharya等[26]對(duì)在印度采集的蝦中分離出的副溶血弧菌進(jìn)行了耐藥譜分析發(fā)現(xiàn),約63%的分離株對(duì)氨芐西林、頭孢氨芐和卡那霉素耐藥,都對(duì)呋喃妥因、萘啶酸、四環(huán)素和諾氟沙星敏感。

1.2 北美洲

2008年,Baker-Austin等[27]在不同的季節(jié)采集了美國喬治亞州和南卡羅來納州附近大西洋海岸三個(gè)位置的海水和沉積物,分離到350株副溶血弧菌,并檢測(cè)了對(duì)11類、24種抗菌藥物的敏感性。結(jié)果,至少24%以上的菌株對(duì)10種以上藥物表現(xiàn)出耐藥,耐藥率較高的有β-內(nèi)酰胺類、氨基糖苷類等,但對(duì)毒力基因的分析發(fā)現(xiàn),毒力株的耐藥性略低。這說明,目前對(duì)非霍亂的弧菌的抗菌藥物治療需要重新進(jìn)行評(píng)估。

1.3 拉丁美洲

2016年,Carvalho等[28]從巴西不同地區(qū)紅樹林中生長的野生蟹的肉中分離到副溶血弧菌等多種細(xì)菌,所有弧菌對(duì)氨芐西林等的耐藥比例均達(dá)78%以上,給食用未正確烹飪蟹肉的消費(fèi)者的健康帶來一定風(fēng)險(xiǎn)。

2015年,Zavala-Norzagaray等[29]從墨西哥西北部的64只健康海龜中的17只中分離到副溶血弧菌,這些副溶血弧菌中的94.1%對(duì)至少1類常用藥物耐藥,尤其是氨芐西林。這對(duì)當(dāng)?shù)貝鄢院｝斎夂秃｝數(shù)暗娜丝赡芫哂袧撛诘娘L(fēng)險(xiǎn)。Costa等[30]調(diào)查了巴西冷凍牡蠣中87株副溶血弧菌對(duì)9類抗菌藥物的耐藥譜,所有菌株對(duì)至少一類藥物耐藥,85株(97.7%)是多藥耐藥,耐藥比例最多的是萬古霉素、氨芐西林和青霉素以及同時(shí)耐藥(46株),還檢測(cè)到對(duì)青霉素、氨芐西林和紅霉素耐藥的菌株。因此,生食牡蠣等貝類時(shí)其中攜帶的耐藥菌可能對(duì)消費(fèi)者健康具有一定的風(fēng)險(xiǎn)。Sperling等[31]調(diào)查了厄瓜多爾零售和養(yǎng)殖的蝦中弧菌的流行和耐藥情況,229份樣品中的219份(95.6%)檢出弧菌,最多的是副溶血弧菌,比例達(dá)80.8%。養(yǎng)殖蝦中的副溶血弧菌耐藥性最高的是氨芐西林(92.2%),對(duì)四環(huán)素(51.3%)和阿米卡星(22.1%)中介耐藥。所有副溶血弧菌中,68株對(duì)至少3類抗菌藥物耐藥,2株對(duì)7類抗菌藥物同時(shí)耐藥。

2011年,de Melo等[32]在巴西某地零售的50份鮮蝦和凍蝦中分離到10株副溶血弧菌,對(duì)7類抗菌藥物的分析發(fā)現(xiàn),5株同時(shí)對(duì)氨芐西林和阿米卡星耐藥,2株對(duì)阿米卡星中度耐藥,所有分離株都對(duì)氯霉素敏感。

從有限的數(shù)據(jù)中可以看出,拉丁美洲國家分離的副溶血弧菌耐藥性也對(duì)氨芐西林耐藥性最高,其次是阿米卡星和四環(huán)素等,有的菌株甚至對(duì)常用于治療革蘭氏陽性菌感染的萬古霉素也表現(xiàn)出耐藥,還有的部分細(xì)菌中檢測(cè)到耐藥質(zhì)粒,這更加劇了耐藥性播散的風(fēng)險(xiǎn)。

1.4 歐洲

近些年來,對(duì)氨芐西林和氨基糖苷類耐藥的副溶血弧菌時(shí)有報(bào)道,但一些非限制使用的一線抗菌藥物,如四環(huán)素和氟喹諾酮類仍然對(duì)副溶血弧菌具有較高的敏感性[33]。Lopatek等[33]對(duì)波蘭市場(chǎng)上活的雙殼類水產(chǎn)品中的副溶血弧菌進(jìn)行了調(diào)查。自2009～2012年共采集了400份樣品,在70份中鑒定出副溶血弧菌,其中56株對(duì)氨芐西林耐藥,45株對(duì)鏈霉素耐藥,都對(duì)四環(huán)素和氯霉素敏感,41株對(duì)至少2類以上抗菌藥物耐藥,只有1株對(duì)3類抗菌藥物耐藥。

2013年,Ottaviani等[34]分析了意大利的107株副溶血弧菌(87株于2009～2011年分離自貝類,8株分離自2007～2010年的胃腸炎病人糞便樣本,12株分離自1979～1996年懷疑因食用污染的海鮮而患腹瀉的日本病人)對(duì)20種藥物的耐藥性。所有菌株都對(duì)氨芐西林和阿莫西林耐藥,都對(duì)氯霉素和強(qiáng)力霉素敏感。62株(57.9%)對(duì)4類藥物耐藥,30株(28.0%)對(duì)5類藥物耐藥,而僅對(duì)3類和2類藥物耐藥的分別是11株(10.3%)和4株(3.7%)。

2009年,Daramola等[1]研究了2007年9月至2008年9月在英國林肯郡克利索普斯城亨伯河口附近采集的貽貝、水和沉積物中分離的76株副溶血弧菌的耐藥性。耐藥比例較高的有卡那霉素(87.8%)、慶大霉素(73.7%)、頭孢唑啉(48.7%)和四環(huán)素(20.0%),比例較低的有氨芐西林(1.3%)、環(huán)丙沙星(9.2%)和萬古霉素(3.9%)。對(duì)所有藥物敏感和只對(duì)1類藥物耐藥的菌株比例均為10.5%(8/76),剩下的78.9%對(duì)兩類或兩類以上的藥物耐藥。

2001年,Ottaviani等[35]檢測(cè)了意大利的新鮮的和冷凍的海產(chǎn)品來源的嗜鹽弧菌對(duì)18類、27種抗菌藥物的耐藥譜和其是否產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶。所有菌株都對(duì)氯霉素、亞胺培南、美羅培南敏感,但都對(duì)林可霉素耐藥。一些副溶血弧菌等菌株對(duì)β-內(nèi)酰胺類耐藥但不產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶。69株產(chǎn)生青霉素酶,但β-內(nèi)酰胺酶活性和對(duì)β-內(nèi)酰胺類耐藥間具有較低的相關(guān)性。Zanetti等[36]對(duì)意大利撒丁島北部海水環(huán)境分離株的副溶血弧菌等弧菌進(jìn)行體外藥物敏感性實(shí)驗(yàn)表明,這些細(xì)菌對(duì)頭孢噻肟、四環(huán)素和氯霉素等具有不同的耐藥性。80%的弧菌對(duì)氨芐西林耐藥。都對(duì)奧索利酸、復(fù)方新諾明、強(qiáng)力霉素、氟甲喹頭孢噻肟、萘啶酸和環(huán)丙沙星高度敏感。

從上述數(shù)據(jù)可以看出,歐洲國家副溶血弧菌分離株的耐藥譜表現(xiàn)出較高的差異,但大多數(shù)對(duì)氨芐西林耐藥性較高,這與其他國家和地區(qū)的一致;此外,還有較高比例的菌株表現(xiàn)出多藥耐藥性。

1.5 非洲

2016年,Igbinosa[37]研究了尼日利亞Benin城4個(gè)不同的魚池養(yǎng)殖設(shè)施中弧菌的耐藥譜及對(duì)公眾健康的影響。所有位點(diǎn)都檢出弧菌,其濃度103～106CFU/100 mL不等。550個(gè)分離株中69個(gè)是副溶血弧菌。對(duì)8類、20種抗菌藥物耐藥性較高的有氨芐西林、紅霉素、萘啶酸、磺胺類、三甲氧芐氨嘧啶、復(fù)方新諾明、四環(huán)素、氧氟沙星和氯霉素。多藥耐藥的比例為67.6%,它們都可以通過食物鏈傳播給人類,對(duì)公眾健康構(gòu)成風(fēng)險(xiǎn)。

2010年,Okoh等[38]分析了南非東開普省農(nóng)村社區(qū)處理廢水的植物中弧菌的耐藥譜。包括12株副溶血弧菌在內(nèi)的多種弧菌表現(xiàn)出典型的多藥耐藥現(xiàn)象,它們對(duì)磺胺甲惡唑、甲氧芐氨嘧啶、復(fù)方磺胺甲惡唑、氯霉素、鏈霉素、氨芐青霉素、四環(huán)素、萘啶酸和慶大霉素表現(xiàn)出耐藥。部分菌株攜帶有臨床菌株才能檢出的耐藥基因,這表明弧菌臨床株和環(huán)境株間具有耐藥基因的水平轉(zhuǎn)移。廢水處理植物可能成為多種耐藥基因的潛在“貯藏庫”,耐藥基因可能是污水處理廠下游的棲息地進(jìn)一步播散,對(duì)飲用這些水的社區(qū)居民健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅。Igbinosa等[39]的研究結(jié)果也確認(rèn)了這一潛在風(fēng)險(xiǎn)。

非洲地區(qū)對(duì)副溶血弧菌耐藥情況的相關(guān)報(bào)道較少,但情況也不容忽視。從現(xiàn)有的報(bào)道來看,副溶血弧菌的耐藥性較其他地區(qū)嚴(yán)重,耐藥譜較廣,多藥耐藥比例高,潛在的食品安全隱患及對(duì)公眾健康可以造成的影響需要引起關(guān)注。

1.6 小結(jié)

對(duì)上述報(bào)道綜合分析可見,不同國家和地區(qū)分離的副溶血弧菌耐藥譜存在較大差異,多個(gè)地區(qū)都分離到同時(shí)對(duì)三類或三類以上抗菌藥物耐藥的多藥耐藥菌株,且這些藥物大多都是應(yīng)用于臨床疾病治療的,因此對(duì)消費(fèi)者的健康和食品安全都存在巨大的隱患。此外,由于沒有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn),不同研究人員所檢測(cè)的藥物種類存在較大差異,不便于橫向比較不同國家和地區(qū)、不同來源的菌株間的耐藥性差異。

2 副溶血弧菌耐藥機(jī)制及耐藥性的播散

細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性一般是染色體上基因發(fā)生突變、插入或缺失導(dǎo)致編碼蛋白改變,或者通過移動(dòng)元件或質(zhì)粒等獲得外源耐藥基因;前者一般是不可傳播的,但大多數(shù)細(xì)菌耐藥是后者引起的。近幾十年來,細(xì)菌耐藥性的研究一直是微生物學(xué)研究的熱點(diǎn)之一,先后導(dǎo)致了耐藥質(zhì)粒、整合子、整合接合元件等可移動(dòng)遺傳元件的發(fā)現(xiàn),它們是細(xì)菌耐藥基因等水平轉(zhuǎn)移的主要載體[40]。一般,細(xì)菌耐藥機(jī)制主要有四種:一是產(chǎn)生分解或修飾藥物的酶類;二是細(xì)菌外膜蛋白缺失或突變,降低細(xì)胞膜通透性,使抗菌藥物不易進(jìn)入或無法進(jìn)入細(xì)胞；三是外排泵過度表達(dá),將攝入的抗菌藥物排出體外,使抗菌藥物在細(xì)菌體內(nèi)不能達(dá)到有效濃度;四是藥物靶點(diǎn)發(fā)生改變,使藥物不能結(jié)合或親合力降低。

2.1 副溶血弧菌耐藥機(jī)制

基因突變產(chǎn)生藥物水解酶或通過移動(dòng)元件、質(zhì)粒等獲得外源耐藥基因編碼的藥物水解酶是副溶血弧菌產(chǎn)生耐藥的重要機(jī)制。副溶血弧菌染色體基因VPA0095與喹諾酮耐藥基因qnrA相關(guān),這已在肺炎克雷伯菌、產(chǎn)酸克雷伯菌和奇異變形桿菌等腸桿菌科的多個(gè)細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)[6]。Aedo等[6]對(duì)智利某醫(yī)院2004年的11個(gè)副溶血弧菌流行株基因組進(jìn)行PCR篩查發(fā)現(xiàn),VPA0095存在于受試的所有菌株基因組DNA上;將VPA0095克隆后連接至載體上,然后轉(zhuǎn)化入受體菌中進(jìn)行藥敏分析發(fā)現(xiàn),VPA0095能夠降低受體菌對(duì)喹諾酮的敏感性。2015年,Chiou等[41]發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新的β-內(nèi)酰胺酶基因——A類羧芐青霉素水解β-內(nèi)酰胺酶家族(CARB)blaCARB-17,介導(dǎo)副溶血弧菌對(duì)青霉素的固有耐藥;而且,該基因的類似物也存在于GenBank中的293株副溶血弧菌基因組序列和91株食源性副溶血弧菌中,進(jìn)一步表明了這個(gè)基因介導(dǎo)固有耐藥。Hasegawa等[42]研究發(fā)現(xiàn),副溶血弧菌臨床分離株ST550對(duì)氯霉素、氨基糖苷類和β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物耐藥的機(jī)理是其產(chǎn)生了氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶、氨基糖苷腺苷酰轉(zhuǎn)移酶和氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶和TEM型青霉素酶。Joseph等[43]研究了副溶血弧菌和溶藻弧菌人體分離株和環(huán)境分離株對(duì)氯霉素、四環(huán)素、氨芐西林、慶大霉素和β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物的耐藥譜,所有菌株都對(duì)氯霉素和四環(huán)素敏感,大多數(shù)菌株因產(chǎn)生了β-內(nèi)酰胺酶而對(duì)氨芐西林耐藥。

副溶血弧菌耐藥機(jī)制研究較多的是外排泵過度表達(dá),如耐藥結(jié)節(jié)細(xì)胞分化家族(Resistance nodulation cell division,RND)型外排泵。RND型外排泵底物非常廣泛,在革蘭氏陰性菌耐藥中起著重要的作用,它是由RND蛋白、膜融合蛋白和外膜蛋白形成三聯(lián)復(fù)合體,將底物通過細(xì)胞膜直接排出。Matsuo等[44]鑒定了副溶血弧菌的11種RND型外排泵發(fā)現(xiàn),表達(dá)外排泵VmeCD、VmeEF、VmeYZ的菌株對(duì)多種抗菌藥物的最小抑菌濃度提高了,其他四種RND型外排泵只有與外膜蛋白VpoC共表達(dá)時(shí)才發(fā)揮作用。而且,它們的共表達(dá)使酶的底物特異性降低,耐藥性更強(qiáng)。vmeAB和vmeCD缺失突變株的副溶血弧菌顯著降低了對(duì)多種抗菌藥物的最小抑菌濃度,也使兔回腸積液減少,毒力下降,說明RND型外排泵不僅介導(dǎo)副溶血弧菌的固有耐藥,而且也發(fā)揮毒力作用。Morita等[45]發(fā)現(xiàn),副溶血弧菌對(duì)諾氟沙星耐藥可能是通過norM基因編碼的外排泵系統(tǒng)。這個(gè)系統(tǒng)不僅介導(dǎo)對(duì)諾氟沙星、環(huán)丙沙星的耐藥,而且對(duì)結(jié)構(gòu)不相關(guān)的復(fù)合物,如乙啡啶、卡那霉素、鏈霉素等也有作用。NorM與大腸桿菌膜蛋白YdhE相似,轉(zhuǎn)化了ydhE基因的大腸桿菌對(duì)諾氟沙星、環(huán)丙沙星、吖啶黃和四苯膦耐藥,對(duì)乙啡啶無效果,說明NorM和YdhE的底物特異性不同。

相比以上兩種機(jī)制,對(duì)副溶血弧菌通過外膜蛋白變化和藥物靶點(diǎn)改變而產(chǎn)生耐藥的研究較少。Koga等[46]分離到兩株多粘菌素B耐藥的副溶血弧菌,V2PXR和P1R4PXR,比較了耐藥株與敏感株間細(xì)胞被膜的化學(xué)組成和外膜蛋白的構(gòu)成。結(jié)果表明,無論培養(yǎng)基中是否有多粘菌素B,兩個(gè)耐藥株的細(xì)胞被膜蛋白成分都比敏感株高,都產(chǎn)生主要外膜蛋白b′。當(dāng)培養(yǎng)基中有多粘菌素時(shí),耐藥株產(chǎn)生一個(gè)新的26 K外膜蛋白,當(dāng)細(xì)菌生長在較低的氯化鈉濃度時(shí)這個(gè)蛋白也會(huì)產(chǎn)生。

2.2 副溶血弧菌耐藥基因的傳播

除基因突變外,耐藥基因水平轉(zhuǎn)移已成為細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性并將耐藥性傳播開來的主要因素——攜帶有抗性基因的可移動(dòng)元件,如整合子、質(zhì)粒、噬菌體等在細(xì)菌間傳播已成為耐藥基因水平轉(zhuǎn)移的主要載體。

2.2.1 質(zhì)粒介導(dǎo)副溶血弧菌耐藥基因傳播 質(zhì)粒是獨(dú)立于染色體外的可遺傳DNA,攜帶的各種決定簇給予了宿主相應(yīng)的耐藥表型;各種抗生素抗性基因大多通過質(zhì)粒的接合、轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)導(dǎo)等方式獲得,這就使細(xì)菌新耐藥性的出現(xiàn)更頻繁且耐藥性更強(qiáng)[47]。2015年,Li等[10]從318份肉和水產(chǎn)品中分離到54株副溶血弧菌,這些菌對(duì)氨芐西林表現(xiàn)出高度耐藥性;在其中一株副溶血弧菌V43中檢測(cè)到β-內(nèi)酰胺酶基因blaPER-1,這株菌對(duì)三代和四代頭孢菌素都表現(xiàn)出耐藥性。與其他的blaPER-1陽性副溶血弧菌不同的是,V43攜帶有一個(gè)大約200 kbp的可接合質(zhì)粒,而另一株副溶血弧菌V4則攜帶有blaCMY-2基因,介導(dǎo)對(duì)三代頭孢菌素的耐藥,這個(gè)基因位于大約150 kbp的IncA/C型可接合質(zhì)粒上,形成traB-traV-traA-ISEcp1-blaCMY-2-blc-sugE-encR-orf1-orf2-orf3-orf4-dsbC-traC的遺傳結(jié)構(gòu),介導(dǎo)耐藥基因的傳播。這表明,超廣譜β-內(nèi)酰胺酶和AmpC型β-內(nèi)酰胺酶通過可接合質(zhì)粒介導(dǎo)了副溶血弧菌對(duì)廣譜頭孢菌素的耐藥,結(jié)公眾健康造成潛在的威脅。

2.2.2 整合子介導(dǎo)副溶血弧菌耐藥基因傳播 整合子是細(xì)菌基因組中一種常見的基因捕獲系統(tǒng),也是一種古老的移動(dòng)元件,在耐藥基因的獲得、表達(dá)和傳播中具有重要作用。整合子的結(jié)構(gòu)由5′保守區(qū)(5′-conserved segment,5′-CS)、3′保守區(qū)(3′-conserved segment,3′-CS)和中間的可變區(qū)(virable region,VR)3部分組成。5′-CS的整合酶(integrase,IntI)通過識(shí)別5′-CS的特異性重組位點(diǎn)attI和基因盒(gene cassette)重組位點(diǎn)attC將捕獲的耐藥基因盒按5′-3′的方向插入至attI和attC之間或兩個(gè)attC之間,形成基因盒陣列(gene cassette array,GCA),并通過自身攜帶的啟動(dòng)子(Pc)使耐藥基因表達(dá)[48-49]。整合子的3′-CS通常為長度可變的sul1基因(編碼抗磺胺類藥物的二氫葉酸合成酶)和qacED1(編碼季銨鹽類消毒劑外排蛋白)。整合子既可以整合到質(zhì)粒或染色體上,亦可以作為轉(zhuǎn)座子的組成部分參與轉(zhuǎn)移,使耐藥基因在同種屬和跨種屬細(xì)菌間廣泛傳播。2015年,Jiang等[50]研究了日本刺參中分離的87株副溶血弧菌的耐藥譜和分子耐藥機(jī)制。發(fā)現(xiàn)所有菌株都對(duì)氨芐西林和頭孢唑林耐藥,對(duì)其他幾類藥物的耐藥比例分別為鏈霉素43.7%、頭孢呋辛鈉18.4%、四環(huán)素4.6%、復(fù)方新諾明2.3%和四種喹諾酮類藥物2.3%,56.2%的菌株表現(xiàn)出對(duì)至少3類藥物耐藥的多藥耐藥性。除了兩株四環(huán)素耐藥株外其他耐藥菌內(nèi)都檢測(cè)到耐藥基因;主要耐藥基因有blaTEM、sul2、strA和strB,沒有檢測(cè)到blaSHV、blaCTX-M、blaOXA、sul1、sul3、tetA、tetM和tetQ。gyrA的喹諾酮耐藥決定區(qū)和parC基因有點(diǎn)突變。所有分析株都攜帶有1型整合子,而無2型、3型整合子等。

2.2.3 整合接合元件介導(dǎo)副溶血弧菌耐藥基因傳播 研究表明,攜帶抗性基因簇的SXT/R391家族的整合接合元件與耐藥性的播散高度相關(guān)[51-52]。整合接合元件最早發(fā)現(xiàn)于一株1992年印度爆發(fā)霍亂的流行菌株O139群霍亂弧菌MO10,攜帶多種抗生素耐藥基因,且其耐藥性是由其染色體上一種可自我轉(zhuǎn)移的遺傳元件SXT介導(dǎo)的;后來發(fā)現(xiàn)1972年分離自南非的雷氏普羅威登斯菌所攜帶的“F因子”實(shí)質(zhì)上是一種與STX密切相關(guān)的遺傳元件,命名為R391;R391賦予宿主卡那霉素耐藥性及重金屬離子Hg2+抗性[40,53-54]。SXT、R391以及后來發(fā)現(xiàn)的多個(gè)相關(guān)的元件具有高度類似的保守骨架結(jié)構(gòu),以及固定的染色體插入/重組位點(diǎn),因此被劃分為同一個(gè)SXT/R391家族。SXT/R391有5個(gè)外源DNA高頻插入位點(diǎn)(稱為熱點(diǎn)區(qū)域HS1-HS5)和4個(gè)可變外源DNA插入?yún)^(qū)(VRI-VRIV)[40,53-54]。

2008年,Taviani等[55]對(duì)2002～2003年在莫桑比克某地環(huán)境中分離的一些弧菌進(jìn)行接合整合元件和1型整合子的調(diào)查時(shí)發(fā)現(xiàn),1型整合子對(duì)霍亂弧菌、溶藻弧菌等的耐藥基因表達(dá)有作用,而另外一部分霍亂弧菌和副溶血弧菌等攜帶的整合接合元件則沒有耐藥基因。

2012年,Rodríguezblanco等[8]研究了伊比利亞半島海水養(yǎng)殖魚類的細(xì)菌中SXT/R391相關(guān)的整合接合元件,在12株細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)了ICEs的存在。其中一個(gè)ICEs的可變區(qū)III有編碼四環(huán)素耐藥的位點(diǎn),而HS4有編碼利福平和季銨類化合物抗性的基因,可變區(qū)IV包含汞抗性操縱子;實(shí)驗(yàn)表明,這些遺傳元件能夠介導(dǎo)耐藥性、重金屬抗性等在養(yǎng)殖環(huán)境中的細(xì)菌中傳播。

3 展望

目前,對(duì)副溶血弧菌的防治仍然依賴于化學(xué)藥物的使用,這已致使對(duì)多類藥物耐藥的副溶血弧菌的產(chǎn)生,給副溶血弧菌的防治帶來困難,最終將可能造成無藥可用的境況。因此,可以通過研發(fā)噬菌體等不易產(chǎn)生選擇性壓力的其他抗菌產(chǎn)品減少藥物的使用。另一方面,需要加強(qiáng)對(duì)副溶血弧菌耐藥機(jī)制的研究,為耐藥性副溶血弧菌的防治和其他新產(chǎn)品的開發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

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