顏明艷， 王 月， 顧華鑫， 王有基， 李瓊珍， 范志鋒， 孫 彬， 胡夢(mèng)紅

(1. 上海海洋大學(xué) 水產(chǎn)與生命學(xué)院， 上海 201306; 2. 廣西壯族自治區(qū)水產(chǎn)研究所，南寧 530021)

鱟(Horseshoe crab)，隸屬于節(jié)肢動(dòng)物門(mén)(Arthropoda)、肢口綱(Merostomata)、劍尾目(Xiphosura)，有“活化石”之稱?，F(xiàn)今世界上僅存二亞科三屬的4種鱟，分別為圓尾鱟(Carcinoscorpiusrotundicauda)、中國(guó)鱟(Tachypleustridentatus)、南方鱟(Tachypleusgigas)和美洲鱟(Limuluspolyphemus)。近年來(lái)，有關(guān)鱟生物學(xué)方面的研究進(jìn)展迅速。鱟血液中含有多種活性物質(zhì)，這些活性物質(zhì)的生物活性不僅可以起到抗菌、抗病毒的作用，甚至能抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、誘導(dǎo)癌細(xì)胞分化。

早在1956年人們就開(kāi)始了對(duì)鱟血液及其與細(xì)菌內(nèi)毒素關(guān)系的研究[1]。此后，鱟試劑的應(yīng)用滲入到各個(gè)領(lǐng)域，如檢測(cè)生物學(xué)、醫(yī)學(xué)研究、食品加工等方面。范林等[2]研究發(fā)現(xiàn)，鱟試劑動(dòng)態(tài)濁度法可準(zhǔn)確檢測(cè)重組人凝血因子Ⅷ細(xì)菌內(nèi)毒素。Solano等[3]發(fā)現(xiàn)鱟試劑可用于檢測(cè)抗蛇毒血清的內(nèi)毒素含量。

鱟試劑按其來(lái)源可分為兩種，一種是中國(guó)鱟試劑(Tachypleus Amebocyte Lysate)，縮寫(xiě)為T(mén)AL，原材料為中國(guó)鱟血液；另一種是美洲鱟試劑(Limulus Amebocyte Lysate)，縮寫(xiě)為L(zhǎng)AL，提取自美洲鱟的血液。TAL與LAL的功能相同。世界上擁有鱟資源的國(guó)家并不多，而我國(guó)占有世界上95%的中國(guó)鱟資源[4]。我國(guó)生產(chǎn)鱟試劑的原材料主要提取自中國(guó)鱟的血細(xì)胞[5]。目前，在福建廈門(mén)、廣東湛江、廣西北海等鱟棲息地集中分布了我國(guó)生產(chǎn)鱟試劑的工廠。

1　鱟試劑的生產(chǎn)工藝和應(yīng)用領(lǐng)域

鱟工廠采集鱟血液的步驟：1)抓捕。在鱟棲息地捕捉中國(guó)鱟。2)運(yùn)輸。在密封的空間運(yùn)輸，同時(shí)將鱟身上的沙子等雜物去除，檢查中國(guó)鱟是否受傷(鱟試劑廠不采集受傷鱟的血液)。3)提取血液。將與鱟細(xì)胞接觸的所有玻璃器皿嚴(yán)格消毒，用1%碘酒，70%酒精對(duì)中國(guó)鱟頭胸腹部關(guān)節(jié)部位進(jìn)行消毒，之后用玻璃插管直接插入鱟心臟包膜讓血液經(jīng)插管流入裝有抗凝劑的貯存瓶中，每只鱟大約采100 mL血液，保持抗凝劑與采血量體積比為1∶1。4)放生。采完血的鱟在當(dāng)天帶到距被捕地大約113～129 km的地方放生，防止短時(shí)間再次被捕采血。研究顯示適量抽血不會(huì)影響鱟的生活和生殖能力[6]，但需要足夠的時(shí)間才能使采血鱟恢復(fù)健康。

鱟試劑是一種生物試劑，其提取過(guò)程是先從中國(guó)鱟的藍(lán)色血液中分離出變形細(xì)胞，然后提取細(xì)胞溶解物后經(jīng)低溫冷凍干燥形成鱟試劑。鱟試劑按實(shí)驗(yàn)方法可分為凝膠法鱟試劑和光度測(cè)定法鱟試劑(濁度法和顯色基質(zhì)法)。其中，凝膠法鱟試劑是定性檢測(cè)或半定量?jī)?nèi)毒素的方法，其原理是與內(nèi)毒素反應(yīng)產(chǎn)生凝集。而光度測(cè)定法鱟試劑則是定量檢測(cè)內(nèi)毒素的方法。鱟試劑按使用特點(diǎn)可分為4種，分別為普通鱟試劑、高靈敏度鱟試劑、特異性鱟試劑及定量法鱟試劑。不同分類的鱟試劑的靈敏度不同，制備方法也略有不同，本文介紹了其中一種較為普遍的制備方法。其具體制備過(guò)程是將采集到的與抗凝劑混合的鱟血用三羥氨甲烷等緩沖液將pH調(diào)至7.1±0.3，然后以1600 r/min的速度離心10 min，收集其沉淀細(xì)胞后加洗滌液(如3%NaCl)洗滌3次，離心除去洗液后得到濃集的鱟血細(xì)胞，在其中加入3倍量的崩解液(注射用水、0.9%NaCl注射液等)，搖勻密封，在4℃下冷藏24 h后再離心10 min，速度為3000 r/min，除去細(xì)胞破裂后的碎片，取得的上清液即是變形細(xì)胞溶解物。然后進(jìn)行靈敏度標(biāo)定。標(biāo)定后將其分裝并凍干封口得到成品鱟試劑[7]。

鱟試劑是目前檢測(cè)內(nèi)毒素最有效、最簡(jiǎn)便的試劑。因其操作簡(jiǎn)單、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)在藥品檢驗(yàn)、食品、醫(yī)療用具、臨床醫(yī)學(xué)研究等多個(gè)領(lǐng)域均有應(yīng)用。鱟試劑產(chǎn)生凝集是一系列酶反應(yīng)的過(guò)程。細(xì)胞漿顆粒存在于鱟血細(xì)胞中，其含有一種酶系統(tǒng)，包括B因子(factor B)、C因子(factor C)、凝固酶原(proctting enzyme)和凝固蛋白原(coagulogen)，功能是與內(nèi)毒素起凝集作用。具體過(guò)程為：C因子被內(nèi)毒素激活，而B(niǎo)因子則被活化C因子啟動(dòng)成為活化B因子，活化B因子會(huì)激活凝固酶原生成凝固酶，而凝固蛋白原由于凝固酶的酶解作用轉(zhuǎn)變?yōu)槟痰鞍?，最后，凝固蛋白通過(guò)交聯(lián)酶作用產(chǎn)生凝集反應(yīng)[8]。在凝固酶原和G因子存在條件下，鱟試劑還可與CMPS類物質(zhì)產(chǎn)生凝集作用[9]。

2　鱟試劑產(chǎn)業(yè)在中國(guó)的發(fā)展現(xiàn)狀

我國(guó)現(xiàn)有的鱟試劑廠主要分布在福建廈門(mén)、廣東湛江、廣西北海等中國(guó)鱟棲息地。例如作為國(guó)內(nèi)最早生產(chǎn)鱟試劑的廠家的福建廈門(mén)鱟試劑生物科技股份有限公司于1987年就已經(jīng)成功研制出鱟試劑，該公司的特異性鱟試劑(即棄G因子鱟試劑)是國(guó)內(nèi)首創(chuàng)產(chǎn)品，于1995年開(kāi)始批量生產(chǎn)。該試劑可以避免G因子旁路對(duì)其的干擾，且只對(duì)內(nèi)毒素起反應(yīng)，使得檢測(cè)結(jié)果更加可靠，無(wú)論是在藥檢還是臨床檢驗(yàn)方面都是必不可少的檢測(cè)試劑。目前該公司已有透析專用鱟試劑盒、顯色基質(zhì)鱟試劑、凝膠法鱟試劑、動(dòng)態(tài)濁度法鱟試劑、特異性鱟試劑、內(nèi)毒素等一系列鱟試劑產(chǎn)品。其中，2005年推出的顯色基質(zhì)定量鱟試劑盒使用簡(jiǎn)單方便，抗干擾能力強(qiáng)，靈敏度高達(dá)0.005 EU/mL，質(zhì)量也已達(dá)到國(guó)際領(lǐng)先水平。福州新北生化工業(yè)有限公司，也是一家以研發(fā)、生產(chǎn)鱟試劑及其他各種生物試劑產(chǎn)品的企業(yè)。該公司不僅有在藥品領(lǐng)域中檢測(cè)注射藥品中熱原質(zhì)的產(chǎn)品，還有在臨床領(lǐng)域檢測(cè)人體血液中細(xì)菌內(nèi)毒素和真菌多糖的試劑盒。在廣東，如湛江博康海洋生物有限公司，也已從事細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)與鱟試劑研究和生產(chǎn)30多年，是全球早期成功研究鱟試劑的專業(yè)生產(chǎn)企業(yè)，該公司于2012年研制的“真菌(1，3)-β-D葡聚糖檢測(cè)試劑盒(動(dòng)態(tài)濁度法)”產(chǎn)品，打破了美國(guó)在該項(xiàng)技術(shù)領(lǐng)域的壟斷。此外，北海興龍生物制品有限公司、湛江安度斯公司等專業(yè)生產(chǎn)中國(guó)鱟試劑(TAL)及相關(guān)產(chǎn)品的公司，其產(chǎn)品也獲得國(guó)內(nèi)外的廣泛認(rèn)可。

3　鱟試劑相關(guān)產(chǎn)業(yè)發(fā)展面臨的問(wèn)題

3.1　研究基礎(chǔ)薄弱

鱟試劑產(chǎn)業(yè)作為新興產(chǎn)業(yè)，我國(guó)對(duì)其的研究較少，基礎(chǔ)還較為薄弱。我國(guó)生產(chǎn)的鱟試劑與國(guó)際同類產(chǎn)品有一定差距，具體表現(xiàn)在鱟試劑的靈敏度、質(zhì)量、穩(wěn)定性、各支的均一性及內(nèi)毒素各種標(biāo)準(zhǔn)品、鱟試劑對(duì)照品等方面。深入研究鱟試驗(yàn)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)機(jī)制并完善以其為基礎(chǔ)的內(nèi)毒素定量分析技術(shù)已刻不容緩。

3.2　原材料供應(yīng)逐年下降

以年產(chǎn)量150萬(wàn)支的鱟試劑公司為例，每年需要5000對(duì)(即1萬(wàn)只)成年鱟提供血源。然而，作為原材料的中國(guó)鱟數(shù)量卻急劇減少，遠(yuǎn)不能滿足鱟試劑廠對(duì)中國(guó)鱟血液的需求。翁朝紅等[10]調(diào)查發(fā)現(xiàn)，中國(guó)鱟在浙江舟山地區(qū)幾近絕跡，福建東山灣海域每年被捕數(shù)量也僅千對(duì)。從前在中國(guó)東部和南部沿海比比皆是的中國(guó)鱟，現(xiàn)在大部分海域已經(jīng)找不到其蹤跡了。不僅上岸產(chǎn)卵的成鱟寥寥可數(shù)，潮間帶上的幼鱟也非常少見(jiàn)。廣西北部灣是我國(guó)中國(guó)鱟的主要棲息地，但棲息于此的中國(guó)鱟數(shù)量正在逐年減少，從20世紀(jì)90年代以前的60～70萬(wàn)對(duì)減少到2010年的每年約30萬(wàn)對(duì)[11]。我國(guó)中國(guó)鱟資源已經(jīng)面臨枯竭。作為原材料的中國(guó)鱟枯竭將直接導(dǎo)致鱟試劑產(chǎn)業(yè)的停滯不前。

3.3　鱟試劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)不夠完善

盡管我國(guó)對(duì)于鱟試劑的質(zhì)量制定了相關(guān)政策，但目前，我國(guó)對(duì)于鱟試劑相關(guān)產(chǎn)業(yè)的重視程度不夠高，相關(guān)政策的執(zhí)行力度不夠嚴(yán)格，加上相關(guān)部門(mén)的監(jiān)督力度不夠，導(dǎo)致了鱟試劑質(zhì)量的參差不齊，且鱟試劑容易受到多種不穩(wěn)定因素的影響，如鱟動(dòng)物個(gè)體差異、制備過(guò)程中器具消毒不嚴(yán)格等，致使同一廠家批號(hào)不同的鱟試劑質(zhì)量也有所差異，這使得鱟試劑靈敏度的復(fù)核值與其標(biāo)示值不盡相同。規(guī)范鱟試劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，加大對(duì)鱟試劑靈敏度的復(fù)核監(jiān)測(cè)力度等措施對(duì)于鱟試劑的質(zhì)量至關(guān)重要。

4　建議

中國(guó)鱟資源銳減將直接影響鱟試劑產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。早在20世紀(jì)80年代，我國(guó)科學(xué)工作者就開(kāi)始呼吁保護(hù)鱟資源，但受限于當(dāng)時(shí)的人口增長(zhǎng)、經(jīng)濟(jì)缺乏發(fā)展等因素，我國(guó)的鱟資源并沒(méi)有受到應(yīng)有的保護(hù)[12]。中國(guó)鱟從卵細(xì)胞受精至性成熟需要13～15年的時(shí)間[13]，這漫長(zhǎng)的生長(zhǎng)時(shí)間使得中國(guó)鱟資源的恢復(fù)十分困難。因此，為了中國(guó)鱟試劑產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展，開(kāi)展中國(guó)鱟的人工繁育、野外放流、棲息地保護(hù)等工作刻不容緩。此外，提高鱟試劑提取效率、完善鱟試劑的制造工藝，規(guī)范采血技術(shù)，減少對(duì)采血鱟的傷害，立法保障采血鱟的放生等舉措對(duì)于鱟試劑的可持續(xù)發(fā)展也不可或缺。具體建議如下。

4.1　規(guī)范鱟試劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

不同廠家甚至是同一廠家不同批次的鱟試劑在質(zhì)量參數(shù)、生產(chǎn)工藝等方面都會(huì)有不同程度的差異。這將導(dǎo)致鱟試劑檢測(cè)內(nèi)毒素的結(jié)果不準(zhǔn)確。因此，研究影響鱟試劑質(zhì)量的因素并制定相應(yīng)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)對(duì)保證鱟試劑質(zhì)量至關(guān)重要。鱟試劑制備的關(guān)鍵在于其靈敏度、穩(wěn)定性及自身凝集等。一般要求穩(wěn)定的靈敏度，大于24 h的自凝時(shí)間，適宜的pH、具有一定的緩沖能力等。達(dá)不到標(biāo)準(zhǔn)的鱟試劑，既浪費(fèi)了寶貴的中國(guó)鱟藍(lán)色血液，也會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌內(nèi)毒素的檢測(cè)結(jié)果不準(zhǔn)確。

確定鱟試劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)既需要得到國(guó)家的重視，有關(guān)部門(mén)監(jiān)督復(fù)核鱟試劑靈敏度的力度也應(yīng)加強(qiáng)。確定出廠鱟試劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，使我國(guó)鱟試劑工廠有統(tǒng)一的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，增加了鱟試劑內(nèi)毒素檢查準(zhǔn)確性的同時(shí)，也為鱟試劑的進(jìn)一步發(fā)展奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

4.2　規(guī)范鱟試劑廠的采血過(guò)程

鱟試劑企業(yè)不可因盲目追求一時(shí)的利益而過(guò)度捕撈鱟、隨意加大采血?jiǎng)┝康?，?yīng)注重長(zhǎng)期發(fā)展，做好中國(guó)鱟的保護(hù)工作。在中國(guó)鱟的運(yùn)輸過(guò)程中應(yīng)注意對(duì)鱟的保護(hù)，不采受傷的中國(guó)鱟的血液。在采血過(guò)程中則應(yīng)該注意無(wú)菌消毒和采血的量。利用完中國(guó)鱟要放回原棲息地，不能為了節(jié)約成本而隨意丟棄，且要離抓捕地113～129 km處放生，防止中國(guó)鱟還沒(méi)有完全康復(fù)就再次被捕捉采血，從而導(dǎo)致中國(guó)鱟的死亡。

企業(yè)可以和科學(xué)工作者合作研究采血后的鱟所需的營(yíng)養(yǎng)以及怎樣使血細(xì)胞快速恢復(fù)，以利于企業(yè)暫養(yǎng)采血鱟一段時(shí)間，并在短時(shí)間多次采血后再放回。人工飼養(yǎng)鱟既可以節(jié)約運(yùn)輸成本，減少鱟在運(yùn)輸過(guò)程中受到的傷害，增加抽血成功率，還可以避免因潮汛等原因造成捕捉的鱟數(shù)量減少?gòu)亩绊懫髽I(yè)按計(jì)劃生產(chǎn)供應(yīng)的情況發(fā)生。鱟試劑的制備過(guò)程要嚴(yán)格執(zhí)行無(wú)菌操作，公司可以建造一個(gè)無(wú)菌室，在無(wú)菌室進(jìn)行鱟試劑的制備，減少鱟試劑被污染的可能性。企業(yè)也應(yīng)該斥資幫助中國(guó)鱟種群的恢復(fù)，使得企業(yè)有鱟可以采血，利于企業(yè)自身的可持續(xù)發(fā)展。政府部門(mén)加強(qiáng)對(duì)于公司的監(jiān)管措施，嚴(yán)格規(guī)范鱟試劑公司對(duì)于鱟的采血及釋放等過(guò)程，對(duì)于違反規(guī)定的公司進(jìn)行嚴(yán)懲。

4.3　加強(qiáng)科研人員團(tuán)隊(duì)建設(shè)

鱟試劑產(chǎn)業(yè)作為新興產(chǎn)業(yè)，在我國(guó)發(fā)展緩慢，研究基礎(chǔ)薄弱，這與我國(guó)從事相關(guān)研究的科研人員不足有一定的關(guān)系。政府應(yīng)充分調(diào)動(dòng)科研人員對(duì)于鱟試劑的研究熱情，大力推動(dòng)科研工作，客觀分析我國(guó)鱟試劑產(chǎn)業(yè)的研究現(xiàn)狀，找出問(wèn)題的關(guān)鍵，有針對(duì)性的進(jìn)行研究，從而解決問(wèn)題。如深入研究鱟試驗(yàn)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)機(jī)制等技術(shù)。為了拓展鱟試劑產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，也應(yīng)該加強(qiáng)鱟試劑的基礎(chǔ)研究，不僅要鼓勵(lì)科研人員從事鱟試劑的相關(guān)研究，政府及相關(guān)機(jī)構(gòu)還應(yīng)加強(qiáng)對(duì)鱟試劑相關(guān)科研人員的培養(yǎng)，完善鱟試劑生產(chǎn)工藝從而加快鱟試劑相關(guān)研究的發(fā)展。

4.4　恢復(fù)中國(guó)鱟種群

中國(guó)鱟資源面臨枯竭，可通過(guò)人工養(yǎng)殖和稚鱟放流等方法促進(jìn)中國(guó)鱟種群恢復(fù)。目前，已有很多關(guān)于中國(guó)鱟人工養(yǎng)殖技術(shù)的研究。中國(guó)鱟的研究工作可以追溯到20世紀(jì)50年代[14]，到了80年代，學(xué)者們以中國(guó)鱟的人工飼養(yǎng)、人工育苗技術(shù)等方面為重點(diǎn)進(jìn)行了研究[15-17]；90年代，洪水根[18]、廖永巖[19]等進(jìn)行了進(jìn)一步研究；近十幾年來(lái)，更多的學(xué)者對(duì)中國(guó)鱟的人工繁殖技術(shù)進(jìn)行了研究[20-25]，大大推進(jìn)了中國(guó)鱟在我國(guó)的研究進(jìn)程。王駿博[23]研究發(fā)現(xiàn)，在適宜的灘涂地區(qū)人工養(yǎng)殖或放流幼鱟，幼鱟完全可以在自然區(qū)域生長(zhǎng)發(fā)育。廖永巖和洪水根[24]也認(rèn)為可以在合適的條件下放流人工育苗養(yǎng)殖成的幼鱟，從而使鱟種群逐漸恢復(fù)，有效保護(hù)鱟資源。迄今為止，中國(guó)鱟人工繁殖技術(shù)已經(jīng)獲得成功。依靠這些已有的成果和經(jīng)驗(yàn)，加快中國(guó)鱟的人工增養(yǎng)殖、幼體食性和孵育特性等方面研究的步伐可以為中國(guó)鱟資源恢復(fù)提供理論基礎(chǔ)，從而通過(guò)增殖放流方式在一定程度上恢復(fù)中國(guó)鱟資源。

4.5　提高公眾保育意識(shí)

人類活動(dòng)的干擾是中國(guó)鱟資源枯竭的一個(gè)重要原因。雖然中國(guó)鱟是國(guó)家二級(jí)保護(hù)動(dòng)物，但是很多漁民都不知道鱟的寶貴，甚至對(duì)其進(jìn)行捕殺、食用等違法行為，造成鱟資源的枯竭。所以，提高民眾保護(hù)鱟的意識(shí)是有效保護(hù)鱟的一個(gè)重要措施，可以大大減少人類活動(dòng)對(duì)鱟造成的傷害。民眾的力量是無(wú)窮的，我們應(yīng)該引導(dǎo)廣大民眾保護(hù)鱟，讓他們意識(shí)到鱟的寶貴，了解到鱟資源瀕臨滅絕的情況，積極參與到保護(hù)鱟的行動(dòng)中。政府則應(yīng)加大執(zhí)法力度，對(duì)非法捕撈、販賣(mài)鱟的行為予以打擊和嚴(yán)懲，從而促使大眾自覺(jué)遵守法律。

就鱟試劑產(chǎn)業(yè)目前在中國(guó)的發(fā)展現(xiàn)狀而言，相關(guān)企業(yè)應(yīng)增強(qiáng)自身責(zé)任意識(shí)，健全公司管理制度，提高中國(guó)鱟的保育意識(shí)，以保護(hù)中國(guó)鱟為前提開(kāi)展企業(yè)制造鱟試劑的工作。政府部門(mén)應(yīng)該規(guī)范鱟試劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，鼓勵(lì)科研人員從事鱟血液學(xué)基礎(chǔ)研究和鱟試劑生產(chǎn)工藝改良等工作，從而促進(jìn)該產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

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