錢鐵馬, 楊光參, 王艷偉

(1. 華盛頓大學(xué) 物理學(xué)院, 華盛頓州 西雅圖 98105; 2. 溫州大學(xué) 物理與電子信息學(xué)院, 浙江 溫州 325035)

DNA作為一種生物大分子,與中性高分子和簡單電解質(zhì)相比,它是一種有著不同性質(zhì)的聚電解質(zhì)。當溶于極性溶液時,DNA將離解成高帶電量的聚離子, 且周圍布滿了許多小的平衡離子。由于DNA附近不同化合價的平衡離子分布不均勻,導(dǎo)致DNA的長程靜電相互作用和熵發(fā)生變化,DNA的構(gòu)象就會發(fā)生變化。

本文分析了DNA在不同濃度的不同價態(tài)的抗衡離子環(huán)境下發(fā)生凝聚的區(qū)別,并且使用原子力顯微鏡(AFM)研究了DNA分子凝聚形態(tài)隨著不同價態(tài)的離子和不同的離子濃度的變化情況,系統(tǒng)分析離子價態(tài)對DNA凝聚形態(tài)的影響。

1 實驗原理

1.1 AFM實驗原理

在AFM系統(tǒng)中,使用微小懸臂來感測針尖與樣品之間的相互作用,此作用力會使微懸臂擺動,當擺動形成時會使照在懸臂末端的激光的反射光位置改變而造成偏移量,激光檢測器會記錄此偏移量,也會把此時的信號傳給反饋系統(tǒng),以利于系統(tǒng)做適當?shù)恼{(diào)整,最后將樣品的表面特性以影像的方式呈現(xiàn)。原子力顯微鏡與樣品間的相互作用以范德華力為主,其作用勢能一般用Lennard-Jones勢能函數(shù)表示如下:

式中,r是兩原子的核間距,δ是勢能為0時原子核間距,ε是勢阱深度,是勢能曲線上最低點勢能的絕對值。

當懸臂尖端的原子與樣品靠近,開始時吸引力起主導(dǎo)作用,隨著距離的減小,兩者之間的吸引力與排斥力將趨于平衡,當兩者進一步靠近時,范德華力以斥力為主。

1.2 實驗材料

1.3 實驗過程

云母片切割成為邊長為1 cm的正方形,用雙面膠粘在圓形鐵片上,利用其作為襯底制作樣品。不同種類的凝聚劑用超純水稀釋以達到最終濃度。AFM型號為島津公司的SPM-9600,探針購自Nanoworld,懸臂彈性系數(shù)為42 N/m,共振頻率為320 kHz.模式采用氣態(tài)的輕敲模式,圖像采集的掃描頻率為2 Hz,像素為512×512，圖片使用時經(jīng)過平滑去噪處理以提高對比度。

實驗過程中先把各種凝聚劑稀釋到預(yù)計濃度,混合均勻之后加入DNA,使DNA的最終濃度為1 mg/L。用移液器取約15 μL的DNA溶液滴在新解離的云母片上,沉積5 min,然后用200 μL的超純水沖洗,氮氣吹干,放入干燥器2 h以上,待掃描。

2 結(jié)果與討論

2.1 AFM結(jié)果與討論

2.1.1 Mg2+與DNA作用

在鎂離子濃度(c(Mg2+)為3 mmol/L和10 mmol/L)溶液中加入DNA,然后在云母表面沉積,用純水沖走表面上的多余分子,最后用氮氣吹干。由AFM獲得的結(jié)果見圖1。

圖1 不同Mg2+濃度下λ-DNA的凝聚形態(tài)

從圖1中可以看到,當Mg2+濃度為3 mmol/L時,DNA分子處于自由舒展的狀態(tài),以此可以看出Mg2+對DNA凝聚沒有作用,DNA還處于自然狀態(tài)。當Mg2+濃度為10 mmol/L時,DNA出現(xiàn)網(wǎng)格形狀,可見大濃度的Mg2+對DNA的形態(tài)也有影響,所以Mg2+作為沉積條件時濃度不能太大。

圖2 不同鈷離子濃度下λ-DNA的凝聚形態(tài)

2.1.3 [C10N4H30]4+與DNA作用

在不同濃度(20、50、100 μmol/L)的[C10N4H30]4+溶液中加入DNA,然后在云母表面沉積,水沖最后用氮氣吹干,其實驗現(xiàn)象如圖3所示。

通過觀察[C10N4H30]4+導(dǎo)致的DNA凝聚可以發(fā)現(xiàn),當濃度為20 μmol/L時,DNA分子已經(jīng)凝聚成較小的核心,凝聚程度十分明顯,比3價離子效果明顯很多；當[C10N4H30]4+的濃度達到50 μmol/L時,DNA的凝聚更加明顯,可以看到多個核心聚集在一起的情況,從而導(dǎo)致更緊密的凝聚；當濃度增加到100 μmol/L時,DNA凝聚得更加緊密,幾乎成球狀結(jié)構(gòu)。由此可以發(fā)現(xiàn)[C10N4H30]4+對DNA的凝聚有更顯著的作用。

2.2 DLS的實驗結(jié)果與討論

用動態(tài)光散射儀(DLS)觀察多價離子的濃度和多價離子的種類對DNA粒徑的影響。由于多價離子會使DNA凝聚,因而粒徑會發(fā)生變化。測量數(shù)據(jù)見表1，其中每個粒徑r數(shù)值為5次測量的平均值。

表1 粒徑測量數(shù)據(jù)

表1(續(xù))

3 結(jié)語

References)

[1] Helen H. Surface Biology of DNA by Atomic Force Microscopy[J]. Annu Rev Phys Chem, 2001,52:71-92.

[2] Valeria C, Davide S, Giovanni B, et al. Atomic force microscopy study of DNA conformationin the presence of drugs[J]. EurBiophys J ,2011,40:59-68.

[3] Christine C, Nicholas H. Evidence That Both Kinetic and Thermodynamic Factors Govern DNA Toroid Dimensions: Effects of Magnesium(II) on DNA Condensation by Hexammine Cobalt(III) [J]. Biochemistry，2004, 43:5380-5387.

[4] Siqian H, Patricia A, Victor B. Condensation of DNA by Multivalent Cations: Experimental Studies of Condensation Kinetics[J]. Biopolymers, 2000, 53:329-341.

[5] Besil K, Vitaly B, Victoe B. Hexamminecobalt(III)-induced condensation of calf thymus DNA: circular dichroism and hydration measurement[J]. Nucleic Acids Research, 2001, 29:2795-2801.

[6] 王艷偉, 胡高銘,林瑜,等. 乙醇與三氯六氨絡(luò)合鈷共同作用導(dǎo)致的DNA凝聚[J]. Biopolymers,2000,53:329.

[7] Ye F, Jan H. Early Intermediates in Spermidine-Induced DNA Condensation on theSurface of Mica[J]. Journal of the American Chemical Society, 1998, 120:8903-8909.

[8] Nguyen T, Rouzina I, Shklovskii B. Reentrant condensation of DNA induced by multivalent counterions[J]. Journal of Chemical Physics, 1999, 112:2562-2568.

[9] Besteman K, Van Eijk K, Lemay S G. Charge inversion accompanies DNA condensation by multivalent ions[J]. Nature physics, 2007,3:641-644.