胡倍源(綜述) 覃 偉 董瓊珠 欽倫秀,,3(審校)

(1復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院普外科 上海 200040;2復(fù)旦大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究院 上海 200032;3復(fù)旦大學(xué)腫瘤轉(zhuǎn)移研究所 上海 200040)

原發(fā)性肝癌是常見(jiàn)的消化系統(tǒng)惡性腫瘤,全球范圍內(nèi)每年新發(fā)病例數(shù)超過(guò)85萬(wàn),病死人數(shù)高達(dá)70萬(wàn),其中一半發(fā)生在中國(guó),發(fā)病率有逐年上升的趨勢(shì),已成為我國(guó)惡性腫瘤第二大死因[1]。在所有原發(fā)性肝癌中,肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是最常見(jiàn)的類(lèi)型,約占90%[2],具有易復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移、死亡率高、預(yù)后差等特點(diǎn)。臨床上大多數(shù)HCC患者明確診斷時(shí)已是中、晚期,因而喪失了手術(shù)治療的時(shí)機(jī)。

索拉非尼作為一種抗腫瘤的新型多靶向性口服藥物,通過(guò)抑制酪氨酸激酶受體(如VEGFR、PDGFR、c-Kit和RET)和下游的 Raf 絲氨酸/蘇氨酸激酶(serine/threonine kinase)活性,從而發(fā)揮抑制腫瘤血管生成和促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡等方面的作用[3]。Ⅲ期臨床試驗(yàn) SHARP和Oriental研究證實(shí),索拉非尼(sorafenib)可以延長(zhǎng)晚期肝癌患者生存期,并且在不同的國(guó)家地區(qū)、不同的肝病狀態(tài)被證明有明確的生存獲益,成為進(jìn)展期HCC的標(biāo)準(zhǔn)一線療法。然而,HCC對(duì)其耐藥性的出現(xiàn)顯著影響療效。耐藥可分為原發(fā)性(HCC原本就對(duì)索拉非尼缺乏敏感性)和獲得性(開(kāi)始敏感,治療過(guò)程中出現(xiàn)耐藥)兩類(lèi),但其機(jī)制尚不清楚且不盡相同。因而,進(jìn)一步探討HCC對(duì)索拉非尼的耐藥機(jī)制具有一定的臨床價(jià)值。

索拉非尼耐藥相關(guān)信號(hào)通路目前,比較公認(rèn)的參與索拉非尼耐藥的信號(hào)通路包括PI3K/Akt、JAK/STAT和Ras/Raf/MEK/ERK。有研究發(fā)現(xiàn)HCC細(xì)胞可通過(guò)上調(diào)EGFR及其配體引起下游通路Ras/Raf/MEK/ERK的持續(xù)活化,從而誘導(dǎo)索拉非尼原發(fā)性耐藥的產(chǎn)生[4-5]。PI3K/Akt及JAK/STAT等通路與肝癌的繼發(fā)性耐藥有關(guān)[6-7]。

Rudalska等[8]利用一種能夠直接在活體小鼠肝癌組織中進(jìn)行shRNA篩選的系統(tǒng)(RNAi掃描)來(lái)鑒定可能參與肝癌耐藥的相關(guān)基因:敲除Mapk14(p38a)基因抑制了Mapk14依賴(lài)的MEK-ERK和Atf2信號(hào)通路的激活,進(jìn)而增強(qiáng)索拉非尼對(duì)小鼠HCC的療效并延長(zhǎng)了小鼠生存時(shí)間。與上述研究結(jié)果一致的是,Mapk14-Atf2信號(hào)通路的激活與接受索拉非尼治療的肝癌患者臨床療效欠佳密切相關(guān)。應(yīng)用Mapk14抑制劑可明顯改善肝癌患者對(duì)索拉非尼治療的敏感性,提高療效。Rui等[9]研究發(fā)現(xiàn)HCC細(xì)胞可通過(guò)分泌GRP78激活EGFR/SRC/STAT3信號(hào)通路,增強(qiáng)HCC細(xì)胞對(duì)索拉非尼的耐受性。Tomonari等[10]通過(guò)對(duì)比肝癌耐藥細(xì)胞與親代敏感細(xì)胞的膜表面蛋白表達(dá)差異,發(fā)現(xiàn)多重耐藥轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白MRP3的表達(dá)水平顯著升高,而經(jīng)典的耐藥相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白(如Akt/pAkt、mTOR/pmTOR和ERK/pERK)的量未出現(xiàn)明顯變化;敲除MRP3基因后,可恢復(fù)肝癌細(xì)胞對(duì)索拉非尼的敏感性。有研究表明,NUPR1通過(guò)激活下游RELB/IER3/RUNX2通路促進(jìn)HCC細(xì)胞的生長(zhǎng)、侵襲和增強(qiáng)其對(duì)索拉非尼的耐藥性[11]。MDIG可以通過(guò)抑制H3K9me3/p21的表達(dá)促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖及降低其對(duì)索拉非尼的敏感性[12]。FGF19及其受體FGFR4過(guò)表達(dá)能減少活性氧(reactive oxygen species,ROS)的產(chǎn)生和抑制細(xì)胞凋亡,從而導(dǎo)致肝癌細(xì)胞耐藥的發(fā)生[13]。由于肝癌細(xì)胞產(chǎn)生對(duì)索拉非尼耐藥性的機(jī)制復(fù)雜,單獨(dú)使用針對(duì)某一耐藥靶點(diǎn)的抑制劑往往療效甚微,而使用聯(lián)合方案又會(huì)帶來(lái)的巨大毒性作用和不良反應(yīng),故目前急需研發(fā)針對(duì)多耐藥靶點(diǎn)的抑制劑。

肝癌細(xì)胞自身改變對(duì)耐藥的影響

自噬 自噬被認(rèn)為是細(xì)胞的一種防御和應(yīng)激調(diào)控機(jī)制,參與消除、降解和消化一些受損、變性、衰老及失去功能的細(xì)胞、細(xì)胞器和變性蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子的過(guò)程[14]。He等[15]研究發(fā)現(xiàn)miR-21可通過(guò)激活A(yù)kt/PTEN通路,抑制肝癌細(xì)胞的自噬發(fā)生和促使肝癌細(xì)胞對(duì)索拉非尼產(chǎn)生耐藥。Wu等[16]也發(fā)現(xiàn)肝癌細(xì)胞可通過(guò)ADRB2介導(dǎo)的Akt依賴(lài)途徑破壞Beclin1/VPS34/Atg14復(fù)合體形成,抑制自噬的發(fā)生和誘導(dǎo)缺氧誘導(dǎo)因子1α (hypoxia inducible factor 1α,HIF1α)的表達(dá),進(jìn)而對(duì)HCC細(xì)胞進(jìn)行糖代謝重編程和誘導(dǎo)索拉非尼耐藥性的產(chǎn)生。然而,Luo等[17]發(fā)現(xiàn),PSMD10可通過(guò)促進(jìn)肝癌細(xì)胞發(fā)生自噬,進(jìn)而誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞對(duì)索拉非尼或常規(guī)化療藥物產(chǎn)生耐藥。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示,自噬在誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞對(duì)索拉非尼耐藥過(guò)程中扮演著雙重角色,可能在腫瘤不同的進(jìn)展階段發(fā)揮著不同的作用,也可能是由于不同受體激活下游不同通路導(dǎo)致自噬的促進(jìn)或抑制,但具體選擇機(jī)制仍需進(jìn)一步研究加以證實(shí)。

上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化 上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)概念于20世紀(jì)80年代早期由Elizabeth Hay提出[18],她觀察到在雞胚原條中上皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化。在EMT期間,上皮細(xì)胞失去相互連接和細(xì)胞極性,重組細(xì)胞骨架,改變細(xì)胞形態(tài)以及重編程某些基因表達(dá)。這種改變?cè)鰪?qiáng)了細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力,促進(jìn)了侵襲表型的轉(zhuǎn)變[19]。EMT被普遍認(rèn)為與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移關(guān)系密切,亦有文章表明其與肺癌[20]、胰腺癌[21]、乳腺癌[22]等耐藥有關(guān)。近期有學(xué)者指出EMT在肝細(xì)胞癌耐藥中亦扮演著重要的角色。Xia等[23]通過(guò)比較復(fù)發(fā)和非復(fù)發(fā)HCC患者組織樣本中的microRNA表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)miR-216a/217的表達(dá)水平與EMT程度密切相關(guān)。過(guò)表達(dá)miR-216a/217的肝癌細(xì)胞通過(guò)減少靶基因PTEN和SMAD7的表達(dá),激活了PI3K/Akt和TGF-β信號(hào)通路,從而促使肝癌細(xì)胞耐藥的發(fā)生和肝癌復(fù)發(fā)。此外,Zhang等[24]發(fā)現(xiàn)Gal-1可通過(guò)激活PI3K/Akt通路,誘導(dǎo)HCC細(xì)胞發(fā)生EMT;相關(guān)臨床數(shù)據(jù)也表明,Gal-1的高表達(dá)與HCC不良預(yù)后及肝癌細(xì)胞耐藥密切相關(guān)。Chen等[25]發(fā)現(xiàn)血管生成素樣蛋白1(angiopoietin-like 1,ANGPTL1)可以阻斷MET受體-AKT/ERK-Egr-1-Slug信號(hào)通路,抑制肝癌細(xì)胞EMT及干性的表達(dá),從而增加耐藥細(xì)胞對(duì)索拉非尼的敏感性,這一結(jié)果也間接提示EMT在肝癌對(duì)索拉非尼耐藥中發(fā)揮著重要作用。

鐵死亡 與傳統(tǒng)意義上的細(xì)胞凋亡和壞死不同,鐵死亡(ferroptosis)是由鐵依賴(lài)性脂質(zhì)過(guò)氧化物的過(guò)度積累而導(dǎo)致的細(xì)胞死亡形式。在細(xì)胞內(nèi),鐵參與線粒體中發(fā)生的氧化磷酸化過(guò)程,該過(guò)程產(chǎn)生ATP的同時(shí)也伴隨ROS的產(chǎn)生。當(dāng)ROS水平超過(guò)細(xì)胞抗氧化能力時(shí)可導(dǎo)致氧化應(yīng)激反應(yīng),直接和間接損害細(xì)胞內(nèi)大分子物質(zhì)(如蛋白質(zhì)、核酸和脂質(zhì)),進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞損傷或死亡[26]。最近,一項(xiàng)研究顯示HCC細(xì)胞可通過(guò)增加金屬硫蛋白的生成,減少谷胱甘肽生成和削弱脂質(zhì)過(guò)氧化作用,抑制索拉非尼引起的鐵死亡,進(jìn)而導(dǎo)致肝癌細(xì)胞耐藥[27]。這一新的發(fā)現(xiàn)可能為肝癌細(xì)胞的耐藥機(jī)制研究開(kāi)辟新的方向。

腫瘤起始細(xì)胞 腫瘤起始細(xì)胞(tumor-initiating cells,T-ICs)是一群具有自我更新、多向分化潛能,且能啟動(dòng)和重建腫瘤組織表型能力的癌細(xì)胞。大量研究均表明,T-ICs參與了腫瘤的轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)和對(duì)放化療的耐受。Lo等[28]研究發(fā)現(xiàn)耐藥細(xì)胞株中T-ICs的比例較敏感株顯著增加。Tovar等[29]同樣證實(shí)了耐藥細(xì)胞中T-ICs的比例增加,除此之外,他們還篩選出敏感株和耐藥株的差異表達(dá)基因。其中,胰島素樣生長(zhǎng)因子(insulin-like growth factor,IGF)與纖維母細(xì)胞生長(zhǎng)因子(fibroblast growth factor,FGF)上調(diào)最為顯著,其下游Akt通路被激活后均可增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的干性和對(duì)索拉非尼產(chǎn)生耐藥。另有研究表明,C8orf可抑制NOTCH2信號(hào)通路,進(jìn)而減弱肝癌起始細(xì)胞的自我更新能力和增強(qiáng)索拉非尼的敏感性[30]。目前關(guān)于T-ICs的定義還頗具爭(zhēng)議,用于分選肝癌起始細(xì)胞的表面標(biāo)志物尚未明確,故現(xiàn)有治療都無(wú)法針對(duì)腫瘤干細(xì)胞進(jìn)行殺傷,這些問(wèn)題都將是未來(lái)研究的方向。

腫瘤微環(huán)境對(duì)肝癌耐藥影響

腫瘤相關(guān)基質(zhì)細(xì)胞 腫瘤與環(huán)境,兩者既相互依存、相互促進(jìn),又相互拮抗、相互斗爭(zhēng)。目前認(rèn)為腫瘤微環(huán)境與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移、耐藥等有著密切聯(lián)系[31]。Chen等[32]發(fā)現(xiàn)在索拉非尼治療后,腫瘤內(nèi)缺氧增加,由缺氧誘導(dǎo)的基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1α(stromal cell derived factor-1α,SDF1α)表達(dá)上調(diào),通過(guò)趨化因子SDF1α/CXCR4軸,HCC細(xì)胞可募集骨髓細(xì)胞,促進(jìn)血管生成,還能直接調(diào)節(jié)EMT表型轉(zhuǎn)化,引起耐藥;另外還發(fā)現(xiàn)缺氧促進(jìn)免疫抑制,瘤內(nèi)CD8+T淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)減少,程序性死亡配體1表達(dá)增加,調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cell,Treg)及M2型巨噬細(xì)胞數(shù)量增加,因此作者嘗試了PD-L1抑制劑、CXCR4抑制劑與索拉非尼聯(lián)用,取得了不錯(cuò)的治療效果。Amalia等[33]發(fā)現(xiàn)層粘連蛋白(Ln)-332,一種由肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cell,HSC)產(chǎn)生的異源三聚體糖基化蛋白,與肝癌細(xì)胞表面配體α3β1整合蛋白結(jié)合后,引起下游被索拉非尼泛素化的FAK發(fā)生磷酸化,進(jìn)而引發(fā)耐藥。Zhou等[34]觀察到對(duì)患者和小鼠腫瘤模型使用索拉非尼治療后,其腫瘤相關(guān)中性粒細(xì)胞(tumor-associated neutrophils,TAN)顯著增多,伴隨CCL2 和 CCL17表達(dá)升高,使巨噬細(xì)胞以及Treg的遷移活性增加;隨后證實(shí)索拉非尼引起的缺氧可以通過(guò)HCC細(xì)胞的HIF1α/NF-κB/CXCL5通路募集TAN,TAN分泌細(xì)胞因子CCL2和CCL17,分別與巨噬細(xì)胞上的受體CCR2 以及Treg上的受體CCR4結(jié)合,募集巨噬細(xì)胞和Treg到HCC細(xì)胞周?chē)源龠M(jìn)其生長(zhǎng)、進(jìn)展和對(duì)索拉非尼耐受。

外泌體 外泌體(exosome)是細(xì)胞衍生的囊泡,可能存在于所有生物液體中,包括唾液、尿液、血液、腹水和腦脊髓液,體液如血清和血漿等,以及細(xì)胞培養(yǎng)物的培養(yǎng)基。外泌體直徑在30～100 nm,密度范圍在1.13～1.19 g/mL[35],成分復(fù)雜多變,如mRNA、microRNA、DNA、熱休克蛋白、酶、MHC受體、四糖蛋白、脂筏、細(xì)胞骨架元素及膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白等[36]。目前在乳腺癌、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、腎癌、卵巢癌中均有外泌體參與腫瘤耐藥過(guò)程的報(bào)道[37-40]。在肝癌方面,Zhen等[41]發(fā)現(xiàn)來(lái)自高侵襲性肝癌細(xì)胞的外泌體比來(lái)自低侵襲性肝癌細(xì)胞的外泌體有更強(qiáng)的效力,高侵襲性肝癌細(xì)胞外泌體激活了敏感細(xì)胞HGF/c-Met/Akt 信號(hào)通路,導(dǎo)致細(xì)胞凋亡被抑制,進(jìn)而使敏感細(xì)胞對(duì)索拉非尼敏感性降低。外泌體作為近年研究的熱點(diǎn),與肝癌耐藥方面的研究非常少,這與肝癌耐藥細(xì)胞誘導(dǎo)難度大、細(xì)胞外泌體分泌量少密切相關(guān)。隨著外泌體試劑盒的改進(jìn)與誘導(dǎo)方法的改良,這一瓶頸可能會(huì)得到突破。

腫瘤血管選定 血管選定這一現(xiàn)象最早由Holash等[42]在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中證實(shí),腫瘤在早期階段利用組織中現(xiàn)有血管促進(jìn)自身的生長(zhǎng)。而Kuczynski等[43]首次發(fā)現(xiàn)肝癌最初只依賴(lài)于自己生成的血管,但隨著索拉非尼治療的開(kāi)始,肝癌細(xì)胞可以通過(guò)“劫持”附近肝組織的正常血管為自己提供血供,從而避開(kāi)了索拉非尼對(duì)血管生成的抑制。此外他們還發(fā)現(xiàn),血管選定過(guò)程是可逆的。在停用索拉非尼后,肝癌組織會(huì)重新使用自己生成的血管,而這個(gè)現(xiàn)象為解釋“耐藥后停藥一段時(shí)間,腫瘤可再次對(duì)原抗血管生成藥物產(chǎn)生反應(yīng)”提供了一種可能。miRNA測(cè)序和功能成像提示在血管選定期間腫瘤出現(xiàn)了EMT,說(shuō)明腫瘤細(xì)胞的遷徙促使了這一現(xiàn)象發(fā)生,抑制腫瘤細(xì)胞的遷徙或許能為抗腫瘤耐藥提供一個(gè)新的選擇。

結(jié)語(yǔ)索拉非尼的原發(fā)性耐藥和獲得性耐藥的機(jī)制不盡相同,涉及多分子、多通路。盡管目前已從腫瘤細(xì)胞和腫瘤微環(huán)境水平探討了影響索拉非尼的耐藥因素及其相應(yīng)機(jī)制,但大多數(shù)實(shí)驗(yàn)局限在細(xì)胞和動(dòng)物模型水平,其實(shí)驗(yàn)結(jié)果能否外推到人體仍有待進(jìn)一步證實(shí)。近期,一些新技術(shù)的出現(xiàn)(如細(xì)胞的3D打印技術(shù)和類(lèi)器官培養(yǎng)技術(shù)等)將有助于我們更好地利用疾病模型或者藥物篩選平臺(tái)開(kāi)展研究。此外,液體活檢技術(shù)的進(jìn)步可以更準(zhǔn)確地識(shí)別索拉非尼敏感性分子標(biāo)志物,篩選索拉非尼最大獲益人群,也可預(yù)測(cè)索拉非尼耐藥出現(xiàn)的風(fēng)險(xiǎn)與時(shí)間節(jié)點(diǎn),有利于尋找針對(duì)性干預(yù)和逆轉(zhuǎn)的新策略,指導(dǎo)臨床精準(zhǔn)用藥,提高療效。同時(shí),隨著休眠腫瘤細(xì)胞等概念的提出,以及胃腸菌群參與腫瘤耐藥過(guò)程的發(fā)現(xiàn),其必定會(huì)進(jìn)一步明確肝癌耐藥的相關(guān)機(jī)制。