黃 強(qiáng)(綜述) 周 梁(審校)

(復(fù)旦大學(xué)附屬眼耳鼻喉科醫(yī)院耳鼻喉科 上海 200031)

外泌體是直徑30～100 nm、起源于多泡體(multivesicular Body,MVB)的細(xì)胞外囊泡。其具有磷脂雙分子層結(jié)構(gòu),表面表達(dá)CD9、CD63等具有特征性的標(biāo)志蛋白,外泌體內(nèi)包裹著包括mRNA、ncRNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等在內(nèi)的物質(zhì)。起初,研究者們認(rèn)為外泌體是轉(zhuǎn)運(yùn)細(xì)胞內(nèi)代謝產(chǎn)物的工具,但是目前越來越多的證據(jù)顯示外泌體在介導(dǎo)細(xì)胞間通訊[1]、調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)[2]、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞耐藥[3]和轉(zhuǎn)移[4]等方面發(fā)揮著巨大作用,更印證了Paget[5]提出的“種子與土壤”假說[6]。而頭頸部惡性腫瘤作為全身常見的惡性腫瘤之一,化療耐藥、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等問題一直困擾著廣大臨床工作者和研究人員,因此本文就目前關(guān)于外泌體在鼻咽癌、舌癌、喉癌以及口腔鱗癌等頭頸部惡性腫瘤中的研究進(jìn)展作一綜述。

外泌體與鼻咽癌鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,NPC)是鼻咽部上皮組織常見的惡性腫瘤,在我國兩廣地區(qū)具有較高的發(fā)病率[7],大于60%的NPC患者就診時(shí)已經(jīng)有局部淋巴結(jié)浸潤[8]。因此,更加深刻地認(rèn)識(shí)NPC的內(nèi)在機(jī)制變得尤為關(guān)鍵。目前在NPC外泌體方面的研究成果較多,外泌體在腫瘤發(fā)生發(fā)展、演化以及診斷和預(yù)后方面都具有極為重要的作用

外泌體miRNA與NPC miRNA是一類具有高度保守性的長度在20～24 nt之間的內(nèi)源性非編碼RNA,能夠通過降解或抑制靶mRNA調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄后水平的基因表達(dá)。在腫瘤發(fā)生發(fā)展演化中扮演了十分重要的角色。眾所周知,NPC與EBV感染密切相關(guān),而Pegtel等[9]率先發(fā)現(xiàn)病毒miRNA可通過外泌體運(yùn)輸?shù)姆绞絺鬟f給未被病毒感染的細(xì)胞。Gourzones等[10]也證實(shí)在裸鼠種植模型和患者血清中都能較為特異性地探測(cè)到EBV感染的NPC細(xì)胞分泌的含有mir-BART7-3p的外泌體,這些發(fā)現(xiàn)有望成為潛在的鑒別NPC和非NPC的腫瘤生物標(biāo)記物。

NPC細(xì)胞通過釋放富含miRNA的外泌體促使其適應(yīng)不斷變化的微環(huán)境。Harmati等[11]使用阿霉素以及光敏劑Ag-Tio2刺激NPC細(xì)胞株5-8F,均可顯著增加外泌體數(shù)量并能改變外泌體中miRNA的表達(dá)譜,而其中變化幅度最顯著的均是作為癌基因而存在的miRNA。這提示在外界環(huán)境不佳的條件下,腫瘤細(xì)胞可以通過釋放有利于腫瘤進(jìn)展的miRNA從而促進(jìn)其惡性表型以及轉(zhuǎn)移形成等過程。

外泌體miRNA參與調(diào)控NPC細(xì)胞增殖、侵襲以及免疫調(diào)節(jié)從而促進(jìn)腫瘤發(fā)展。Ye等[12]通過miRNA芯片技術(shù)比較了NPC患者血清以及TW03細(xì)胞系來源的外泌體,發(fā)現(xiàn)均存在miR-24-3p、miR-891a、miR-106a-5p、miR-20a-5p和miR-1908的顯著升高,生物信息學(xué)分析推測(cè)這些miRNA可能參與了MARK1信號(hào)通路的下調(diào),從而影響了細(xì)胞的增殖和分化。其中TW03細(xì)胞系來源的外泌體可通過抑制T細(xì)胞增殖和Th1/Th17細(xì)胞分化以及誘導(dǎo)促進(jìn)Treg細(xì)胞的產(chǎn)生,從而削弱T細(xì)胞的功能,并通過促進(jìn)CD4+或者CD8+細(xì)胞釋放促炎因子 IL-1β、IL-6和IL-10以及減少IFNγ、IL-2、IL-17等抑炎因子等來調(diào)控腫瘤免疫微環(huán)境。后續(xù)實(shí)驗(yàn)[13]則證實(shí)了與T細(xì)胞增殖分化等密切相關(guān)的纖維母細(xì)胞生長因子11(fibroblast growth factor 11,FGF11) 是miR-24-3p的直接靶點(diǎn),外泌體miR-24-3p可通過抑制FGF11的表達(dá)從而抑制T細(xì)胞功能。相反地,通過靶向miR-24-3p的RNA海綿特異性敲低外泌體miR-24-3p的表達(dá)水平可以恢復(fù)T細(xì)胞增殖和Th1/Th17細(xì)胞分化的能力。這均說明了外泌體miRNA在NPC發(fā)生、發(fā)展以及演化過程中發(fā)揮著重要作用。

外泌體LMP1與NPC 潛伏膜蛋白1(latent membrane protein 1,LMP1)被認(rèn)為是EBV感染B淋巴細(xì)胞過程中最為重要的癌基因,并與細(xì)胞生長調(diào)控以及增殖過程密切相關(guān)[14]。Dukers等[15]首先揭示了LMP1與外泌體之間的潛在聯(lián)系。而Meckes等[16]經(jīng)過進(jìn)一步實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)NPC源性外泌體內(nèi)高表達(dá)的LMP1不僅可以增加受體細(xì)胞及受體細(xì)胞外泌體內(nèi)表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)的含量,而且高表達(dá)的LMP1與EGFR的外泌體被內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等攝取后通過激活ERK和PI3K/Akt信號(hào)通路參與細(xì)胞增殖等過程。這提示外泌體LMP1可以影響外泌體組分及其性狀,參與并直接調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖等惡性進(jìn)程。

另外從間接調(diào)控方面來看,Aga等[17]發(fā)現(xiàn)LMP1能增加外泌體內(nèi)缺氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia inducible factor 1α,HIF-1α)的表達(dá),而HIF-1α是腫瘤細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化以及發(fā)展中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子,直接促進(jìn)了腫瘤發(fā)展;Ceccarelli等[18]則證實(shí)NPC細(xì)胞中LMP1的表達(dá)能顯著增加腫瘤細(xì)胞外泌體中纖維母細(xì)胞生長因子2(fibroblast growth factor 2,FGF2)的表達(dá),而后者被認(rèn)為是具有促進(jìn)血管生成作用的潛在促癌因子。

這些研究均證實(shí)外泌體LMP1能從直接調(diào)控和間接調(diào)控兩方面影響著NPC的進(jìn)展。鑒于此,靶向LMP1的治療顯得尤為關(guān)鍵。有研究[19]發(fā)現(xiàn),在LMP1定向分揀進(jìn)入外泌體的過程中CD63扮演著重要的角色,用CRISPR/Cas9技術(shù)敲除CD63后發(fā)現(xiàn)細(xì)胞外泌體中LMP1的含量明顯下降。這指明了一種阻斷LMP1下游信號(hào)通路的策略,同時(shí)也為治療NPC提供了一種新的思路。

外泌體Galectin9與NPC 半乳凝素9(galectin-9,Gal-9)在調(diào)節(jié)T細(xì)胞生物學(xué)作用、自身免疫以及炎性反應(yīng)中具有重要作用[20]。有研究[21-22]證實(shí),EBV感染的NPC細(xì)胞產(chǎn)生富含Gal-9的外泌體,而Gal-9是成熟Th1細(xì)胞膜表面死亡受體Tim-3的特異性激動(dòng)劑[23],兩者結(jié)合可介導(dǎo)成熟Th1細(xì)胞的凋亡過程。Klibi等[22]發(fā)現(xiàn)通過阻斷外泌體中的Gal-9/Tim-3的相互作用,可以顯著減緩對(duì)Th1細(xì)胞的抑制并增強(qiáng)其抗腫瘤作用。說明外泌體Gal-9在促進(jìn)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞生長、誘導(dǎo)成熟的CD4+Th1+凋亡方面具有重要作用,提示腫瘤細(xì)胞可能通過產(chǎn)生外泌體以逃脫免疫監(jiān)視[24],這也預(yù)示著此種策略可作為治療NPC的免疫療法之一。

外泌體其他內(nèi)容物與NPC Shi等[25]證實(shí)間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cell,MSC)可以產(chǎn)生高表達(dá)纖維母細(xì)胞生長因子19(fibroblast growth factor 19,FGF19)的外泌體,與NPC細(xì)胞共培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)其可以通過FGF19-FGFR4依賴的級(jí)聯(lián)式ERK信號(hào)通路影響NPC細(xì)胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)的過程,從而參與到腫瘤細(xì)胞惡性進(jìn)展的過程中。這也更加深刻地指明除了腫瘤本身產(chǎn)生的外泌體對(duì)其的作用外,間充質(zhì)干細(xì)胞來源的外泌體等因素對(duì)腫瘤的影響。

除此之外,在NPC細(xì)胞外泌體中還存在種類繁多的與其發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的因子,包括HS1相關(guān)蛋白X-1(HAX-1)[26]、HIF-1α[17]、LMP1相關(guān)mRNA[27]、基質(zhì)金屬蛋白酶13(MMP-13)[28]等。這些因子在傳遞病毒蛋白、參與細(xì)胞轉(zhuǎn)移、調(diào)控腫瘤演化發(fā)展以及免疫調(diào)節(jié)等方面發(fā)揮了重要的作用,相互作用,共同推動(dòng)了NPC的惡性進(jìn)展[21]。

外泌體與口腔鱗癌口腔鱗癌(oral squamous cell carcinoma,OSCC)發(fā)病率占頭頸部惡性腫瘤的24%[29],淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致患者五年生存率較低的主要因素。而腫瘤來源的外泌體被認(rèn)為腫瘤細(xì)胞與腫瘤微環(huán)境進(jìn)行交流的重要方式,并參與到細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)移、遷移浸潤等一系列影響之中[30-31]。

外泌體miRNA與口腔鱗癌 Sakha等[32]發(fā)現(xiàn)高度轉(zhuǎn)移的OSCC細(xì)胞株HOC313-LM來源的外泌體可通過激活ERK和AKT信號(hào)通路誘導(dǎo)細(xì)胞增殖,并發(fā)現(xiàn)外泌體中高表達(dá)的miRNA-1246通過直接靶向DENND2D基因(DENN/MADD domain containing 2D)增強(qiáng)了轉(zhuǎn)移性較差的細(xì)胞株HOC313-P的細(xì)胞遷移能力。Li等[33]通過miRNA測(cè)序發(fā)現(xiàn)不同氧濃度條件下OSCC外泌體差異miRNA之中,miRNA-21的表達(dá)水平差異最為顯著,并發(fā)現(xiàn)外泌體miRNA-21在降低細(xì)胞E-鈣黏蛋白表達(dá)的同時(shí)顯著增加了Snail和波形蛋白的表達(dá)水平。這些研究提示外泌體特異性miRNA在口腔鱗癌細(xì)胞遷移以及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化中具有重要作用,有可能與腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。

Dickman等[34]通過RT-qPCR技術(shù)發(fā)現(xiàn)在OSCC外泌體中miRNA-142-3p的表達(dá)水平明顯高于細(xì)胞內(nèi)。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)miRNA-142-3p的濃度升高時(shí),通過靶向作用于轉(zhuǎn)化生長因子-β受體1(transforming growth factor-beta receptor 1,TGFBR1)下調(diào)細(xì)胞內(nèi)TGFBR1的表達(dá)水平使得諸如克隆形成、增殖生長等惡性表征減弱。這提示miRNA在細(xì)胞和外泌體內(nèi)表達(dá)水平不同,miRNA分揀進(jìn)入外泌體是具有特異性的,即腫瘤細(xì)胞將具有惡性特征的miRNA分揀進(jìn)入外泌體,然后傳遞給其他腫瘤細(xì)胞以及基質(zhì)細(xì)胞等從而影響和改變腫瘤細(xì)胞的一系列惡性行為。

其他 據(jù)既往研究[35-36]證實(shí),腫瘤細(xì)胞攝取和內(nèi)化外泌體取決于細(xì)胞表面的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖 (heparin sulfate proteoglycans,HSPGs),而肝素可以競(jìng)爭性結(jié)合HSPGs的共受體。Sento等[37]通過肝素處理OSCC后發(fā)現(xiàn),肝素可通過阻斷腫瘤細(xì)胞與外泌體的融合內(nèi)化,阻斷外泌體對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖分化等影響,這也為臨床治療OSCC提供了一個(gè)新的思路。

外泌體與舌癌盡管目前手術(shù)和放化療水平的進(jìn)展迅速,但舌癌患者仍然具有高居不下的轉(zhuǎn)移率和死亡率[38],舌癌細(xì)胞來源的外泌體在其中占有重要的地位。

外泌體CAV1與舌癌 小窩蛋白1(caveolin-1,CAV1)在多種類型的細(xì)胞中均有表達(dá)[39],文獻(xiàn)[40]報(bào)道CAV1在介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲等惡性行為方面具有重要作用。Vered等[41]發(fā)現(xiàn),舌鱗癌細(xì)胞株HSC-3能產(chǎn)生富含CAV1的外泌體,能將CAV1通過外泌體運(yùn)輸?shù)男问綇哪[瘤細(xì)胞橫向轉(zhuǎn)移至腫瘤微環(huán)境中。這說明含有CAV1的外泌體在舌鱗癌發(fā)生發(fā)展中可能具有重要的作用。

外泌體蛋白質(zhì)與舌癌 有研究者[42]通過研究舌鱗癌Tca8113細(xì)胞和正?？谇火つぜ?xì)胞外泌體之間的蛋白組學(xué)表達(dá)差異,發(fā)現(xiàn)腫瘤拒絕抗原1(gp96)和纖維母細(xì)胞生長因子受體2(fibroblast growth factor receptor 2,FGFR2)蛋白具有最顯著的差異。目前研究[43]證實(shí),gp96參與抗原遞呈過程,在抗腫瘤特異性免疫反應(yīng)中具有重要作用,推測(cè)腫瘤細(xì)胞可能通過產(chǎn)生富含gp96的外泌體排除自身抗原,從而逃避免疫監(jiān)視;而FGFR2在口腔鱗癌[44]和胃癌、直腸癌[45]等腫瘤中均存在表達(dá),在腫瘤的發(fā)生發(fā)展和演化中具有重要的促進(jìn)作用。

其他 廖貴清等[46]較先從舌鱗癌細(xì)胞株Tca8113培養(yǎng)上清液中分離純化外泌體,并通過體外抗瘤試驗(yàn)表明,負(fù)載外泌體的樹突狀細(xì)胞(dendritic cell,DC)誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(cytotoxic T lymphocyte,CTL)對(duì)Tca8113細(xì)胞的殺傷率明顯強(qiáng)于未負(fù)載外泌體的對(duì)照組。提示外泌體在抗原遞呈等腫瘤免疫領(lǐng)域具有很強(qiáng)的應(yīng)用前景,有望形成新型的腫瘤疫苗。

外泌體與喉癌目前外泌體在喉癌(laryngeal squamous cell carcinoma,LSCC)研究中的報(bào)道相對(duì)較少。Wang等[47]通過研究發(fā)現(xiàn),LSCC患者血清中外泌體miRNA-21和HOTAIR的表達(dá)水平與患者臨床分級(jí)、T分期以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān),更重要的是通過miRNA-21和HOTAIR的聯(lián)合檢驗(yàn)?zāi)軌蚝Y查可能罹患LSCC的患者,具有較高的敏感性和特異性。這預(yù)示著miRNA-21和HOTAIR的聯(lián)合檢驗(yàn)可以作為潛在的LSCC患者診斷的標(biāo)志物以及預(yù)后評(píng)價(jià)的指標(biāo)之一。外泌體與LSCC之間的聯(lián)系有待于進(jìn)行更多的基礎(chǔ)及臨床研究來揭示。

結(jié)語頭頸部惡性腫瘤作為全球第六大惡性腫瘤,較高的發(fā)病率及較差的預(yù)后一直以來制約著患者的生活水平和壽命[48]。雖然發(fā)現(xiàn)外泌體的時(shí)間不長,但外泌體在頭頸部惡性腫瘤以及其他腫瘤中潛在的研究價(jià)值卻越來越受到關(guān)注。外泌體內(nèi)各種“貨物”通過細(xì)胞間物質(zhì)交換、傳遞參與了頭頸部惡性腫瘤的增殖遷移、耐藥轉(zhuǎn)移以及免疫調(diào)節(jié)等各個(gè)生物學(xué)過程,推動(dòng)了腫瘤的惡性發(fā)展,這有助于更加深刻地認(rèn)識(shí)頭頸部惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展的內(nèi)在機(jī)制。與此同時(shí),研究者們一直致力于篩選頭頸部惡性腫瘤患者血清等體液中存在的外泌體作為合理穩(wěn)定的生物標(biāo)志物以期能進(jìn)行早期篩查、靶向治療和預(yù)后判斷等方面。

盡管外泌體在頭頸部惡性腫瘤中的研究日益豐富,但是仍然存在許多問題亟待解決。就外泌體本身而言,外泌體是否依據(jù)其形態(tài)和功能具有更細(xì)致的分類是擺在眾多研究者面前的重要問題[49];外泌體被細(xì)胞攝取后外泌體內(nèi)的成分是否一定能夠發(fā)揮作用也值得我們進(jìn)一步探尋[50]。而在頭頸部惡性腫瘤的診治方面,外泌體作為生物標(biāo)志物在特異性、敏感性、穩(wěn)定性和臨床適用性等方面是否優(yōu)于傳統(tǒng)的血清標(biāo)志物;利用外泌體作為頭頸部惡性腫瘤化療藥物載體給藥是否存在抗原性以及毒性等問題都有待論證。這些問題都值得我們進(jìn)一步探索外泌體以及外泌體在頭頸部惡性腫瘤中的作用。