許芳 趙陽(yáng) 武其文

腫瘤是威脅人類(lèi)生命健康的一大重要因素，據(jù)統(tǒng)計(jì)全球1/8的死者死于癌癥，我國(guó)每一分鐘有6人確診為癌癥。由于傳統(tǒng)成像技術(shù)固有的局限性和缺乏特異性的腫瘤標(biāo)志物導(dǎo)致多數(shù)惡性腫瘤預(yù)后不良和5年生存率較差。找到一種合理有效的方法對(duì)腫瘤患者進(jìn)行早期診斷和治療具有重要意義，循環(huán)腫瘤細(xì)胞（circulating tumor cells，CTCs）作為新興的腫瘤標(biāo)志物，可用于篩查、檢測(cè)、診斷、預(yù)后預(yù)測(cè)、分層、治療反應(yīng)監(jiān)測(cè)等。已證明在乳腺癌、前列腺癌、結(jié)直腸癌等惡性腫瘤中，CTCs計(jì)數(shù)可作為獨(dú)立的預(yù)后判斷指標(biāo)。但外周血中CTCs數(shù)量的稀有及其結(jié)構(gòu)的異質(zhì)性和聚集特性是影響其分離和分析的主要障礙［1］。幾種較常見(jiàn)的循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測(cè)實(shí)驗(yàn)方法：免疫細(xì)胞化學(xué)法、逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)、納米免疫磁珠富集檢測(cè)法等，由于自身各自的缺點(diǎn)在臨床應(yīng)用中均受到不同程度的限制。目前，基因組學(xué)家強(qiáng)調(diào)對(duì)原發(fā)性腫瘤和部分轉(zhuǎn)移灶進(jìn)行大規(guī)模測(cè)序以全面分析和理解癌癥基因組特征［2］。高通量測(cè)序從分子層面對(duì)CTCs進(jìn)行基因序列分析以適應(yīng)臨床需要。該技術(shù)采用大規(guī)模平行測(cè)序，能夠一次對(duì)數(shù)百萬(wàn)至數(shù)十億個(gè)DNA片段進(jìn)行序列測(cè)定，可完成在相對(duì)較低成本及不增加樣本量情況下，對(duì)上百個(gè)腫瘤相關(guān)基因、全外顯子以及全基因組進(jìn)行檢測(cè)。高通量測(cè)序技術(shù)與CTCs的綜合運(yùn)用在未來(lái)研究中展現(xiàn)出廣闊的前景，本文就二者的應(yīng)用作一綜述。

1 循環(huán)腫瘤細(xì)胞

1.1 循環(huán)腫瘤細(xì)胞概述

CTCs常作為循環(huán)上皮細(xì)胞被檢測(cè)，在健康人群中非常罕見(jiàn)，但在各種實(shí)體瘤患者血液中可檢測(cè)到［3］，被稱(chēng)為新興的腫瘤標(biāo)志物，早在100多年前被提出，是原發(fā)性或轉(zhuǎn)移性腫瘤脫落進(jìn)入到外周血液循環(huán)中的腫瘤細(xì)胞［4?5］。CTCs與原發(fā)腫瘤具有相似的遺傳特征，并可攜帶這些遺傳信息隨血液循環(huán)播散至全身各個(gè)器官［6］。原發(fā)腫瘤每天可釋放上萬(wàn)個(gè)腫瘤細(xì)胞，但只有約0.01%CTCs可存活。有研究者采用白細(xì)胞分離法分別從7例直腸癌患者、5例乳腺癌患者以及3例胃癌患者外周血中獲得平均循環(huán)腫瘤細(xì)胞數(shù)各為 17.1（10?34）、10.0（2?27）、24.0（2?42），并對(duì)這些CTCs進(jìn)行了成功培養(yǎng)［7］。隨著對(duì)CTCs的深入研究發(fā)現(xiàn)CTCs在血液運(yùn)行過(guò)程中部分會(huì)發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial mesenchy?mal transition，EMT），這與干細(xì)胞表型有關(guān)，且EMT可幫助CTCs抵抗細(xì)胞凋亡信號(hào)，更好的存活和躲避治療藥物的攻擊，增強(qiáng)侵襲遷移能力［1］。CTCs表現(xiàn)出的這些生物學(xué)特點(diǎn)是我們甄選CTCs作為研究腫瘤的依據(jù)，是機(jī)遇也是挑戰(zhàn)，未來(lái)需要更深入的研究。

1.2 循環(huán)腫瘤細(xì)胞臨床價(jià)值

CTCs的臨床應(yīng)用范圍從診斷、預(yù)后預(yù)測(cè)、合理治療方案選擇到臨床病理分期等。如根據(jù)早期腫瘤患者或術(shù)后近期內(nèi)血液中有無(wú)CTCs再評(píng)估是否需要對(duì)那些具有高危轉(zhuǎn)移因素的患者進(jìn)行放化療方面有重要指導(dǎo)作用［8］。CTCs可作為評(píng)估晚期癌癥患者治療是否有效的早期指標(biāo)以及發(fā)現(xiàn)潛在靶向治療的新方法［9］。在結(jié)直腸癌中，KRAS基因的外顯子2突變是表皮生長(zhǎng)因子受體抑制劑治療的不利標(biāo)志［10］。CTCs還可能為原發(fā)性腫瘤和轉(zhuǎn)移腫瘤的分析提供遺傳信息。鑒于疾病發(fā)展過(guò)程中，惡性腫瘤可能會(huì)發(fā)生獲得性遺傳變異，CTCs作為一個(gè)實(shí)時(shí)的液體活檢可避免對(duì)轉(zhuǎn)移組織進(jìn)行多次侵害性的病理活檢［11］。此外，CTCs計(jì)數(shù)還可作為監(jiān)測(cè)化療療效的標(biāo)志物，評(píng)估乳腺癌和前列腺癌患者對(duì)化療的反應(yīng)［12?14］。根據(jù) Scher和 Jia等［15］2 008 項(xiàng)研究數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，CTCs計(jì)數(shù)作為一個(gè)連續(xù)變量分析時(shí)，結(jié)合乳酸脫氫酶基點(diǎn)是一個(gè)重要的預(yù)后變量（一致性概率估計(jì)0.72至0.75）。在用醋酸阿比特龍治療前列腺癌的第二階段，有研究者根據(jù)治療后CTCs的變化評(píng)估47位難治性、去勢(shì)抵抗的前列腺癌患者對(duì)治療的反應(yīng)，結(jié)果顯示治療后CTCs數(shù)量明顯減少，且ERG基因的重排和CTCs數(shù)量的減少之間具有明顯的相關(guān)性（r=0.762，P=0.001）［16］。對(duì)于膀胱癌切除術(shù)患者而言術(shù)前CTCs的存在是無(wú)癌生存期的獨(dú)立的不良預(yù)兆。最近一項(xiàng)研究表明CTCs依然是膀胱癌患者接受膀胱癌根除術(shù)但沒(méi)有輔以化療的癌癥特異性死亡率的獨(dú)立預(yù)兆［17］。

綜合上述觀點(diǎn)我們不難發(fā)現(xiàn)CTCs作為一種液體活檢標(biāo)本，相比于影像學(xué)、病理組織學(xué)，血清標(biāo)志物具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，能夠提供更多的臨床信息。

2 循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測(cè)方法

2.1 免疫學(xué)技術(shù)

檢測(cè)CTCs最具有代表性的免疫學(xué)技術(shù)是基于免疫磁珠平臺(tái)的Cellsearch系統(tǒng)，該系統(tǒng)是目前唯一得到美國(guó)食品和藥物管理局批準(zhǔn)的CTCs檢測(cè)系統(tǒng)［18］。該方法利用包被有上皮細(xì)胞粘附分子（epithelial cell adhesion molecule，EpCAM）抗體的免疫磁珠，通過(guò)抗原抗體反應(yīng)與外周血中所有表達(dá)EpCAM的細(xì)胞結(jié)合，從而分離捕獲CTCs，然后利用熒光標(biāo)記的細(xì)胞角蛋白（cytokeratins，CK）抗體對(duì)CTCs進(jìn)行識(shí)別鑒定。然而，關(guān)于是否所有的循環(huán)CK細(xì)胞都是腫瘤細(xì)胞仍然存在爭(zhēng)議。相反，對(duì)于重要的細(xì)胞亞群，如發(fā)生EMT的細(xì)胞存在漏檢，且因其無(wú)法檢測(cè)EpCAM陰性的細(xì)胞，使得檢測(cè)CTCs的敏感性和特異性降低。Li等［19］應(yīng)用Cellsearch系統(tǒng)和依據(jù)細(xì)胞大小的膜濾法（isola?tion by size of epithelial tumor，ISET）對(duì) 61 例食管鱗狀細(xì)胞癌患者進(jìn)行檢測(cè)，ISET方法檢測(cè)出CTCs有20例（32.8%），檢測(cè)出循環(huán)腫瘤微栓子3例（4.9%），而Cellsearch系統(tǒng)分別檢測(cè)出1例（1.6%）和0例。另外，該方法主要側(cè)重于循環(huán)腫瘤的計(jì)數(shù)，缺乏在基因?qū)用娴纳钊?，在展現(xiàn)信息全面方面表現(xiàn)出一定的弊端，一項(xiàng)轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者的研究報(bào)告顯示單純根據(jù)CTCs計(jì)數(shù)轉(zhuǎn)換治療并不能提高患者的總體生存率［20］。免疫學(xué)技術(shù)作為一種傳統(tǒng)檢測(cè)方法，應(yīng)用廣泛，但隨著技術(shù)發(fā)展其弊端日益凸顯。

2.2 CTCs芯片技術(shù)

CTCs芯片技術(shù)使用抗EpCAM抗體包被的微流體裝置，基于EpCAM經(jīng)常在肺癌、結(jié)直腸癌、乳腺癌、前列腺癌、頭頸部腫瘤中過(guò)度表達(dá)，能夠從血液中特異性捕獲CTCs，細(xì)胞可快速分離并可視化，早期研究表明該技術(shù)在多種轉(zhuǎn)移癌中的檢出率達(dá)99%，且CTCs的數(shù)量多（平均50 CTCs/mL）［21?22］。然而，該技術(shù)主要用于 CTCs的捕獲和分離，因仍以抗體為基礎(chǔ)，同樣可因腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT，上皮抗原消失而敏感性降低。

2.3 逆轉(zhuǎn)錄 PCR（reverse transcription PCR，RT?PCR）技術(shù)

自20世紀(jì)90年代以來(lái)，RT?PCR開(kāi)始用于檢測(cè)外周血中的腫瘤特異性核苷酸［10］。相比于依賴抗體結(jié)合的檢測(cè)方法其敏感性明顯提高，且可用于檢測(cè)血液中游離的RNA，應(yīng)用范圍廣。但限于常見(jiàn)的靶RNA的非特異性表達(dá)、標(biāo)本及PCR產(chǎn)物的污染、PCR擴(kuò)增過(guò)程中條件控制不當(dāng)、非特異性細(xì)胞低水平的非法轉(zhuǎn)錄等原因，使RT?PCR方法的檢測(cè)結(jié)果出現(xiàn)較高的假陽(yáng)性率。此外，該技術(shù)無(wú)法用于觀察腫瘤細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征。

3 高通量測(cè)序在循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測(cè)中的應(yīng)用

3.1 高通量測(cè)序技術(shù)

高通量測(cè)序又稱(chēng)下一代測(cè)序（next generation se?quencing，NGS）或深度測(cè)序，以能一次并行對(duì)幾十萬(wàn)到幾百萬(wàn)條DNA分子進(jìn)行序列測(cè)定和一般讀長(zhǎng)較短著稱(chēng)，引起業(yè)內(nèi)廣泛關(guān)注。2015年初，國(guó)家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)首次批準(zhǔn)了26家腫瘤診斷與治療采用高通量測(cè)序技術(shù)的應(yīng)用試點(diǎn)單位，這預(yù)示著我國(guó)正逐步進(jìn)入規(guī)范化的腫瘤高通量測(cè)序檢測(cè)行列。高通量測(cè)序檢測(cè)CTCs的實(shí)驗(yàn)過(guò)程主要包括：抽取CTCs DNA?制備測(cè)序文庫(kù)?測(cè)序?生物信息分析，獲取高純度的CTCs DNA是檢測(cè)的前提，而先進(jìn)的生物信息學(xué)分析技術(shù)是獲取檢測(cè)結(jié)果的保障。

3.2 高通量測(cè)序的應(yīng)用

3.2.1 結(jié)直腸癌

高通量測(cè)序可揭示體細(xì)胞單核苷酸多態(tài)性和拷貝數(shù)變化，2013年 Heitzer等人［23］利用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)68個(gè)結(jié)直腸癌相關(guān)基因進(jìn)行序列分析，比較原發(fā)腫瘤和轉(zhuǎn)移灶的突變譜及相應(yīng)的CTCs，在相應(yīng)的CTCs中檢測(cè)到已知的原發(fā)腫瘤和轉(zhuǎn)移灶的突變驅(qū)動(dòng)基因［如結(jié)腸腺瘤樣息肉（APC），KRAS，PIK3CA］，并發(fā)現(xiàn)CTCs也存在基因突變。并且，利用深度測(cè)序分析這些突變的來(lái)源，發(fā)現(xiàn)原本在CTCs檢測(cè)出的大多數(shù)突變也存在于原發(fā)腫瘤和轉(zhuǎn)移灶。檢測(cè)腫瘤基因拷貝數(shù)往往受到正常細(xì)胞摻雜和非整倍數(shù)因素的影響，且正常細(xì)胞會(huì)干擾腫瘤細(xì)胞的基因信號(hào)，給全面分析腫瘤基因帶來(lái)挑戰(zhàn)，下一代測(cè)序技術(shù)提供了精確到堿基水平的基因信息，使檢測(cè)不同類(lèi)型的基因變異以及確定基因片段大小、位置等信息成為可能。

3.2.2 胰腺癌

RNA測(cè)序可顯示腫瘤轉(zhuǎn)移的相關(guān)路徑，有研究人員采用微流控器對(duì)來(lái)自小鼠胰腺癌模型的內(nèi)源性CTCs進(jìn)行高效捕獲，并對(duì)CTCs進(jìn)行單分子RNA測(cè)序，可篩選出Wnt2作為候選基因在CTCs中表達(dá)活躍［24］。在胰腺癌細(xì)胞中通過(guò)Wnt2的表達(dá)抑制失巢凋亡，增強(qiáng)非依賴貼壁球體的形成，增加體內(nèi)轉(zhuǎn)移傾向。胰腺腫瘤細(xì)胞形成非粘附的腫瘤球體與多個(gè)Wnt基因表達(dá)上調(diào)有關(guān)，11例胰腺癌中有5例CTCs的Wnt信號(hào)表達(dá)豐富。由此對(duì)CTCs進(jìn)行分子分析可確定治療靶點(diǎn)，預(yù)防腫瘤遠(yuǎn)處擴(kuò)散。

3.2.3 肺癌

有研究顯示通過(guò)對(duì)肺癌的CTCs外顯子組進(jìn)行測(cè)序可發(fā)現(xiàn)其轉(zhuǎn)移和突變。Ni等人［25］對(duì)11例肺癌患者的CTCs進(jìn)行外顯子基因組測(cè)序分析，發(fā)現(xiàn)特征性腫瘤相關(guān)的單核苷酸變異和CTCs外顯子的插入和缺失。這些突變可提供個(gè)體化治療所需的信息，如耐藥和表型轉(zhuǎn)變。此外，同一病人的每個(gè)CTCs，無(wú)論腫瘤亞型，具有的重復(fù)性拷貝數(shù)變異（copy number variation，CNV）模式與轉(zhuǎn)移瘤類(lèi)似，同樣是肺腺瘤的不同患者，CTCs的CNV模式相似，而小細(xì)胞肺癌患者的CNV明顯不同于肺腺瘤患者。這表明特定基因位點(diǎn)的CNV可提示癌癥轉(zhuǎn)移，腫瘤特異性CNV的重復(fù)性提供了潛在的基于CTCs的臨床診斷價(jià)值。

3.2.4 膀胱移行細(xì)胞癌

2013年Guo等［26］利用全基因和全外顯子測(cè)序?qū)?9例膀胱移行細(xì)胞癌患者基因組進(jìn)行分析，除了證實(shí)已被確定在移行細(xì)胞癌（transitional cell car?cinoma，TCC）中發(fā)生突變的基因外，還發(fā)現(xiàn)STAG2和ESPL1基因頻繁的突變以及FGFR3和TACC3重復(fù)性融合在姐妹染色單體的結(jié)合和分離（sister chromatid cohesion and segregation，SCCS）過(guò)程中發(fā)揮重要作用。研究表明基因突變對(duì)SCCS過(guò)程的影響可能參與了膀胱腫瘤的發(fā)生，為找到一種新的治療方法提供了思路。Sharron等［27］在2014年利用RNA測(cè)序?qū)Π螂滓菩屑?xì)胞癌進(jìn)行分析，確定了一個(gè)在T1NPBCa（T1 nonprogressive bladder cancer）和 T1PBCa（T1 progres?sive bladder cancer）間表達(dá)差異顯著的基因標(biāo)志?；谔卣鞯姆謱语@示基因識(shí)別標(biāo)志與腫瘤由T1期發(fā)展到T2期的時(shí)間密切相關(guān)，表明分子標(biāo)志可作為高評(píng)分T1膀胱癌發(fā)展的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子。

3.2.5 頭頸癌

受各種因素的影響，近年來(lái)頭頸部腫瘤的發(fā)病率和致死率持續(xù)上升，其中以青年患者尤為突出，美國(guó)在2014年有73 240例患者確診為頭頸癌，27 450例患者死于頭頸癌［28］。早在2011年發(fā)表在Science雜志上的2篇文章同時(shí)報(bào)道了利用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)頭頸部鱗癌進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)在頭頸部腫瘤患者中存在大量的堿基突變，其中以TP53、CDKN2A、PIK3CA、NOTCH1基因的突變最為普遍，在HPV陰性的腫瘤患者中，這種突變更為常見(jiàn)［29?30］。2014 年有學(xué)者對(duì)TP53、NOTCH1基因在頭頸腫瘤中的變化進(jìn)行了更為詳細(xì)深入的研究和報(bào)道［31?32］。Farah等［33］分別從轉(zhuǎn)化性研究、個(gè)性化醫(yī)學(xué)、驗(yàn)證目標(biāo)基因、癌癥藥物基因組、藥物靶點(diǎn)、未來(lái)可能采取的治療方法等方面詳細(xì)描述了NGS在頭頸癌中的應(yīng)用。

3.2.6 乳腺癌

對(duì)乳腺腫瘤進(jìn)行分子層面分析可促進(jìn)耐藥機(jī)制的研究，如雌激素受體靶向治療乳腺癌出現(xiàn)耐藥是由于ESR1基因發(fā)生了突變［34］。由于血液CTCs非常少，高純度的DNA量獲取困難，一般難以達(dá)到高通量測(cè)序平臺(tái)檢測(cè)的下限，這也是高通量測(cè)序技術(shù)的一大重要挑戰(zhàn)。最近的一項(xiàng)研究很好的解決了這一問(wèn)題，該研究綜合運(yùn)用全基因組擴(kuò)增（whole genome amplification，WGA）和NGS對(duì)比分析了乳腺癌細(xì)胞株和經(jīng)乳腺癌細(xì)胞株轉(zhuǎn)染而成的癌細(xì)胞，提出在WGA過(guò)程中使用DNA無(wú)創(chuàng)管可解決WGA試驗(yàn)與細(xì)胞固定劑不相容問(wèn)題［35］。

通過(guò)上述實(shí)例，我們不難看出高通量測(cè)序技術(shù)在檢測(cè)循環(huán)腫瘤細(xì)胞，從分子層面研究腫瘤疾病等方面具有重大的應(yīng)用價(jià)值。相信隨著技術(shù)的不斷發(fā)展和完善，高通量測(cè)序技術(shù)可以揭示更多的腫瘤基因信息，為腫瘤的預(yù)防、診斷、治療奠定夯實(shí)的理論基礎(chǔ)，為腫瘤病人帶去真正的福利。

4 展望

目前，人們?cè)絹?lái)越重視從基因?qū)用娣治瞿[瘤疾病，CTCs很早就開(kāi)始進(jìn)入人們視野，但限于在外周血中的量稀少以及受技術(shù)的限制，無(wú)法廣泛應(yīng)用。近年來(lái)，隨著各種CTCs富集和檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，尤其是在高通量測(cè)序技術(shù)的推動(dòng)下，CTCs又重新受到人們的關(guān)注。對(duì)CTCs的研究有利于更好的理解為什么同一種癌癥中的細(xì)胞具有不同的侵襲和轉(zhuǎn)移能力、對(duì)同一種藥物產(chǎn)生不同的治療效果，更好的為癌癥患者提供個(gè)體化的治療方案。2015年國(guó)家衛(wèi)生計(jì)生委婦幼司發(fā)布了第一批高通量測(cè)序技術(shù)臨床應(yīng)用試點(diǎn)單位，這是對(duì)高通量測(cè)序的高度認(rèn)可。高通量測(cè)序技術(shù)應(yīng)用的范圍非常廣泛：人類(lèi)千人基因組計(jì)劃、動(dòng)植物全基因組研究、表觀遺傳研究和甲基化分析、微生物基因組測(cè)序組裝、外顯子組基因測(cè)序分析、小RNAs序列分析、單細(xì)胞全基因組測(cè)序等等。目前高通量測(cè)序呼聲最響的是在無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用。近期我院正著力于高通量測(cè)序技術(shù)平臺(tái)實(shí)驗(yàn)室的創(chuàng)建，高通量測(cè)序進(jìn)入公眾視野指日可待。

為了使高通量測(cè)序技術(shù)更好地走進(jìn)臨床，發(fā)揮更大的應(yīng)用價(jià)值，應(yīng)與其它技術(shù)更好的結(jié)合，如高效的細(xì)胞分離和富集技術(shù)，全基因組擴(kuò)增技術(shù)。另外，要加快精密型實(shí)驗(yàn)室的建設(shè)。此外，高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)科研工作者和臨床醫(yī)生來(lái)說(shuō)是一個(gè)新的領(lǐng)域，在測(cè)序過(guò)程中產(chǎn)生龐大的數(shù)據(jù)需依賴于復(fù)雜的生物信息學(xué)技術(shù)分析，這并不是簡(jiǎn)單易懂的，為此應(yīng)該朝著更加簡(jiǎn)捷化和自動(dòng)化發(fā)展。最后高通量測(cè)序技術(shù)作為一種新興的技術(shù)，還處在探索前進(jìn)階段，應(yīng)朝著更加規(guī)范化發(fā)展，真正發(fā)揮其價(jià)值?？傊S著高通量測(cè)序技術(shù)的臨床開(kāi)展和各技術(shù)環(huán)節(jié)的日益完善，其必將結(jié)出豐碩之果，我們深信基于測(cè)序技術(shù)的基因數(shù)據(jù)分析方法將成為主流發(fā)展方向，有望改變個(gè)性化醫(yī)療的前景。

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