李呈貞(綜述) 韓振格 何東儀(審校)

(1上海市長(zhǎng)寧區(qū)光華醫(yī)院檢驗(yàn)科 上海 200052; 2上海市中醫(yī)藥研究院中西醫(yī)結(jié)合關(guān)節(jié)炎研究所 上海 200052)

在低等真核生物中催化H3K79甲基化的賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶被稱為Dot1(disruptor of telomeric silencing 1)。在哺乳動(dòng)物中保守的同源蛋白被稱為Dot1樣蛋白(Dot1-like,DOT1L)。在釀酒酵母、果蠅和人類(lèi)中,Dot1/DOT1L被認(rèn)為是催化H3K79甲基化的唯一甲基轉(zhuǎn)移酶。研究發(fā)現(xiàn)DOT1L與染色質(zhì)沉默、基因表達(dá)調(diào)控、DNA損傷修復(fù)、細(xì)胞周期調(diào)控、胚胎發(fā)育、白血病的發(fā)生發(fā)展等多種生物學(xué)過(guò)程有密切的聯(lián)系[1],DOT1L已成為針對(duì)表觀遺傳修飾因子的重要藥物靶點(diǎn),本文對(duì)Dot1/DOT1L在生理和病理方面的研究進(jìn)展作一綜述。

Dot1/DOT1L活性及其調(diào)控

H3K79甲基轉(zhuǎn)移酶活性 組蛋白甲基化由一組組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶催化完成。基于其催化結(jié)構(gòu)域,賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶迄今可分為兩類(lèi)。第1類(lèi)包含進(jìn)化上保守的SET結(jié)構(gòu)域,第2類(lèi)不具備SET結(jié)構(gòu)域,僅包含一個(gè)進(jìn)化上保守的蛋白質(zhì)DOT1(端粒沉默干擾物)和其同源物。DOT1及其同源物含有與Ⅰ類(lèi)甲基化酶相似的甲基轉(zhuǎn)移酶催化結(jié)構(gòu)域[2]。

Dot1是一種進(jìn)化上相對(duì)保守的組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶。DOT1家族都包含一個(gè)4個(gè)模體(motif)的保守區(qū)域[2]:Ⅰ、post Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ。酵母Dot1(yDot1)和人類(lèi)同源蛋白DOT1L(hDot1L)的晶體結(jié)構(gòu)顯示,它們都擁有一個(gè)開(kāi)放的α/β結(jié)構(gòu),此結(jié)構(gòu)包含了1個(gè)Ⅰ類(lèi)SAM依賴性甲基轉(zhuǎn)移酶的典型結(jié)構(gòu)——7股β片段[3-4]。 由于DOT1的結(jié)構(gòu)和精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶相似[5-6],因此猜測(cè)DOT1也能催化精氨酸甲基化。然而,使用逆相高效液相色譜(HPLC)等方法都未能證明DOT1具有精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶活性[5]。因此,盡管人類(lèi)和酵母DOT1蛋白在結(jié)構(gòu)上更類(lèi)似于精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶,但DOT1家族不能完成精氨酸甲基化修飾。

2002年,幾個(gè)小組分別采用不同的方法發(fā)現(xiàn),組蛋白H3的球狀結(jié)構(gòu)域中的第79位賴氨酸即H3K79容易甲基化,而yDot1和hDot1L正是催化這一反應(yīng)的酶[5,7]。有研究通過(guò)選擇性剪切和表達(dá)序列標(biāo)簽分析確定了5個(gè)小鼠Dot1 mRNA(mDot1a-mDot1e),其中mDot1a與人類(lèi)Dot1蛋白(hDot1L)同源性最高,有84%的氨基酸序列相一致,且相似性高達(dá)88%,同時(shí)研究還證實(shí)mDot1a在體內(nèi)具備特異性催化H3K79甲基化的酶活性[8]。Dot1及其同系物幾乎全權(quán)負(fù)責(zé)H3K79甲基化,在酵母、果蠅和老鼠中敲除Dot1會(huì)導(dǎo)致H3K79甲基化完全喪失[5-6,9]。

影響Dot1/DOT1L表達(dá)和H3K79甲基化的因素 ENCODE全基因組甲基化測(cè)序數(shù)據(jù)顯示,DOT1L基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島在人類(lèi)各種組織中均呈現(xiàn)極低的DNA甲基化水平,說(shuō)明其在人類(lèi)組織中廣泛表達(dá)。然而,在小鼠早期胚胎著床前發(fā)育時(shí)DOT1L mRNA水平呈低轉(zhuǎn)錄水平[10],在成年后廣泛表達(dá)于小鼠器官[8]。提示DOT1L基因的表達(dá)受某種特定信號(hào)的調(diào)節(jié)。永生小鼠內(nèi)髓集合管細(xì)胞在暴露于二甲亞砜時(shí)DOT1L mRNA水平上調(diào),但轉(zhuǎn)錄因子上調(diào)小鼠DOT1L轉(zhuǎn)錄的機(jī)制還不明確[8]。在小鼠腎集合管細(xì)胞DOT1L mRNA的水平受醛固酮抑制[11];在熱帶爪蟾蛻變期間,DOT1L通過(guò)T3反應(yīng)元件(T3 response element,TRE)結(jié)合配體甲狀腺受體激活轉(zhuǎn)錄[12]。

H3K79的1、2、3甲基化(H3K79me1、H3K79me2和H3K79me3)水平與染色質(zhì)區(qū)域、所處細(xì)胞周期及發(fā)育階段呈動(dòng)態(tài)相關(guān)[13]。組蛋白“串?dāng)_”影響H3K79甲基化水平。Dot1/DOT1L介導(dǎo)的H3K79的2和3甲基化依賴于H2BK120(哺乳動(dòng)物)/K123(酵母)和H2BK34的單泛素化[14-18]。H3K79的2和3甲基化需要泛素化H2B和釀酒酵母Dot1富含賴氨酸區(qū)域之間的相互作用[19-20]。在泛素化依賴的H3K79的3甲基化的另一機(jī)制中,COMPASS復(fù)合體或蛋白酶體ATP酶Rpt4和Rpt6連接泛素化的H2B和H3K79[21-22]。在轉(zhuǎn)錄延伸時(shí),H2BK123單泛素化需要Paf1復(fù)合體(與RNA聚合酶Ⅱ延伸相關(guān))參與,進(jìn)而引起H3K79甲基化[23],而該P(yáng)af1復(fù)合體的一些組件如Rtf1和Paf1,也與COMPASS和Dot1相互作用[23-24]。另外,DOT1L與磷酸化RNA聚合酶Ⅱ有相互作用,這可能導(dǎo)致了轉(zhuǎn)錄延伸區(qū)域周?chē)鶫3K79甲基化[25]。總體而言,轉(zhuǎn)錄延伸復(fù)合物增強(qiáng)了Dot1/DOT1L介導(dǎo)H3K79的2和3甲基化。其他可能原因:泛素化H2B促進(jìn)染色質(zhì)結(jié)構(gòu)改變,增加H3K79甲基化的可能性[26]。在釀酒酵母中,另一個(gè)影響H3K79me1、H3K79me2和H3K79me3水平的組蛋白“串?dāng)_”機(jī)制是組蛋白H4的N-端堿性區(qū)域和Dot1酸性區(qū)域之間的相互作用[27-28]。SIR3和Dot1競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合組蛋白H4的堿性區(qū)域。K16乙酰化組蛋白H4抑制SIR3與H4的N-端的結(jié)合,同時(shí)促進(jìn)Dot1依賴的H3K79甲基化。 此外,在人類(lèi)細(xì)胞中通過(guò)過(guò)表達(dá)H4K16乙?；窼IRT1來(lái)降低局部H3K79me2水平,這表明沉默蛋白SIRT1和DOT1L競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合組蛋白H4[29]。相反,在錐蟲(chóng)中H3K76 2或3甲基化不需要組蛋白H4的N-端[30]。

有些基因是保持H3K79甲基化水平的關(guān)鍵。在釀酒酵母中,Swi4(調(diào)節(jié)亞基)和Swi6(DNA結(jié)合部分)都是轉(zhuǎn)錄復(fù)合物SCB-結(jié)合因子的組成部分,二者均是維持H3K79me2水平所必需的,但在維持H3K79me3水平中并不需要[31]。相比之下,ARD1(N-端乙?；D(zhuǎn)移酶A復(fù)合物的催化亞基)在維持H2B單泛素化和H3K79me3水平中是必需的,而H3K79me2則不需要[32]。

H3K79的非甲基化形式比甲基化形式更加豐富?；谫|(zhì)譜結(jié)果,H3K79me1檢測(cè)率比H3K79me2高,而H3K79me3在小鼠和人類(lèi)中很少發(fā)現(xiàn)[9,33-34]。特定的去甲基化酶還未發(fā)現(xiàn),甲基化H3K79向去甲基化轉(zhuǎn)化的機(jī)制尚未提出。相反,不同形式H3K79甲基化修飾暗示以下幾種催化過(guò)程:首先,Dot1催化1到2、2到3的甲基化需要Bre1依賴性H2BK123泛素化[35-36]。第二,在基因轉(zhuǎn)錄過(guò)程中H3K79me1水平降低的同時(shí),H3K79me2水平則升高,這表明此改變有助于激活轉(zhuǎn)錄[37]。與此相一致的是,在異染色質(zhì)形成過(guò)程中H3K79me2是降低的[38]。但是甲基化水平與表達(dá)水平并不相關(guān),可能是因?yàn)樵诟叨绒D(zhuǎn)錄區(qū)域轉(zhuǎn)錄時(shí)發(fā)生組蛋白替換[39]。由此推測(cè),著絲粒區(qū)H3K79me3的積累可能是由于此區(qū)域異染色質(zhì)組蛋白替換緩慢所致[40-41]。第三,H3K79甲基化發(fā)生在新結(jié)合到核小體的組蛋白以及已存在的組蛋白[34-35]。H3K79甲基化受到細(xì)胞分裂過(guò)程中組蛋白稀釋的影響,即復(fù)制依賴型組蛋白交換解釋了H3K79甲基化的變化[38]。隨著受精,H3K79甲基化的損耗獨(dú)立于DNA的合成[41]。最后,在芽殖酵母中90%的H3K79發(fā)生甲基化,提示在該生物體內(nèi)去甲基化酶的活性被高效的甲基化所掩蔽[38,42]。

H3K79甲基化的可逆性 雖然H3K79甲基化的形成特征明顯,并受到多個(gè)過(guò)程的嚴(yán)格調(diào)節(jié),但該位點(diǎn)主動(dòng)去甲基化的過(guò)程卻知之甚少。迄今,除H3K79外,其他已知的甲基化修飾的組蛋白賴氨酸殘基都可以被至少一種組蛋白去甲基化酶去甲基化[2]。一系列證據(jù)表明H3K79甲基化可能是可逆的,因?yàn)樗軇?dòng)態(tài)調(diào)節(jié)。首先,在酵母和人類(lèi)細(xì)胞中,H3K79me2水平隨細(xì)胞周期而波動(dòng)[7,31]。其次,在小鼠和果蠅早期胚胎發(fā)育期間H3K79me2是去甲基化的,這表明非活性去甲基化酶可能存在于成熟卵母細(xì)胞中[6,41]。再次,二羥戊二酸(2-HG)對(duì)α-酮戊二酸(α-KG,雙加氧酶的輔因子)的拮抗作用表明合成2-HG和突變異檸檬酸脫氫酶(isocitrate dehydrogenase,IDH)存在使H3K79me2的整體水平升高,其中IDH是催化異檸檬酸氧化脫羧為α-KG的NADP依賴酶[43]。這些結(jié)果表明雙加氧酶可能催化體內(nèi)H3K79me2去甲基化,下調(diào)H3K79me2水平。因此,亟需尋找到H3K79特異性去甲基化酶。

Dot1在細(xì)胞周期調(diào)節(jié)中的作用細(xì)胞周期是單向的不可逆過(guò)程,以確保正常的細(xì)胞分裂。研究發(fā)現(xiàn),H3K79me1、H3K79me2和H3K79me3水平與染色質(zhì)區(qū)域、所處細(xì)胞周期及發(fā)育階段呈動(dòng)態(tài)相關(guān),表明其在細(xì)胞周期調(diào)控中發(fā)揮作用[13]。

在哺乳動(dòng)物中,DOT1L甲基化H3K79被認(rèn)為是在G1/S轉(zhuǎn)換期調(diào)節(jié)細(xì)胞周期進(jìn)程的關(guān)鍵因素。老年大鼠肺組織的H3K79me3水平較年輕大鼠肺組織低;因此,低甲基化H3K79可能是與衰老(細(xì)胞周期不可逆轉(zhuǎn)阻滯于G0/G1期)相關(guān)的組蛋白標(biāo)記[44]。然而,與老年大鼠肺組織H3K79低甲基化相反的是,H3K79me1和H3K79me2在快速老化小鼠(SAMP)的大腦中是上調(diào)的[45]。一種解釋是,H3K79甲基化程度對(duì)衰老的影響取決于不同的有機(jī)體,或者H3K79甲基化水平在SAMP中升高可能是衰老模型的結(jié)果。

小鼠DOT1L也參與分化胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cell,ESC)和紅系祖細(xì)胞的細(xì)胞周期過(guò)程。雖然DOT1L缺失的ESC仍保持增殖和多能性的能力,但在體外分化中顯示出嚴(yán)重的增殖缺陷,導(dǎo)致在G2/M期累積。有趣的是,DOT1L敲除的未分化和分化ESC都顯示出非整倍性,而表型則是在分化時(shí)變化更明顯[46]。另外,在DOT1L敲除的ESC中可以觀察到細(xì)胞凋亡[9],但在敲低細(xì)胞中未見(jiàn)[46]。與ESC相反,在紅系祖細(xì)胞中敲除DOT1L能觀察到的結(jié)果是G0/G1期累積,而非G2/M期[47],這表明DOT1L對(duì)細(xì)胞周期的影響可能具有細(xì)胞特異性。

然而,在細(xì)胞周期中H3K79甲基化的變化在進(jìn)化上不是保守的,H3K79甲基化調(diào)控的相關(guān)功能也不是保守的。Dot1/DOT1L介導(dǎo)的H3K79甲基化在細(xì)胞增殖中的作用具有物種或組織特異性。在芽殖酵母、錐蟲(chóng)、小鼠ESC和人癌細(xì)胞中,Dot1/DOT1L缺失或沉默會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞增殖的降低,而心臟特異性DOT1L的缺失會(huì)導(dǎo)致心臟組織增殖。因此,Dot1/DOT1L在不同類(lèi)型細(xì)胞中對(duì)增殖功能的影響還需要有針對(duì)性的進(jìn)一步研究。

Dot1在發(fā)育過(guò)程中的作用研究顯示mDot1廣泛表達(dá)于各組織中,如肝、腎、肺、心、腦、腸及卵巢等組織,另外研究發(fā)現(xiàn)在兩細(xì)胞階段的胚胎,甚至在體外19.5天的受精卵中均發(fā)現(xiàn)mDot1的存在[8],這表明mDot1存在于不同的發(fā)育階段,有可能在細(xì)胞生長(zhǎng)和分化中發(fā)揮著重要作用。目前針對(duì)Dot1和H3K79甲基化的研究在多種組織及細(xì)胞中取得了巨大的進(jìn)步。

Dot1在心臟功能中的作用 在mDOT1L敲除的胚胎中觀察到心血管發(fā)育缺陷,提示mDOT1L可能在心臟發(fā)育中起作用[9],這與離體研究心肌生成觀察到的H3K79甲基化增加能誘導(dǎo)心血管標(biāo)志物基因表達(dá)相一致[48]。此外,在小鼠心肌中特異敲除mDOT1L可引起擴(kuò)張型心肌病(dilated cardiomyopathy,DCM)[49],這是一種心肌疾病,臨床表現(xiàn)為心腔擴(kuò)張和收縮功能障礙。mDOT1L介導(dǎo)的H3K79甲基化直接調(diào)節(jié)抗肌萎縮蛋白的轉(zhuǎn)錄[2]。鑒于抗肌萎縮蛋白參與構(gòu)成抗肌萎縮蛋白-糖蛋白復(fù)合物(dystrophin-glycoprotein complex,DGC),而DGC參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和心臟收縮期間緩解機(jī)械應(yīng)力,因此抗肌萎縮蛋白表達(dá)下調(diào)能引起DGC不穩(wěn)定,進(jìn)而導(dǎo)致肌膜損傷?？辜∥s蛋白基因突變是人類(lèi)DCM和肌營(yíng)養(yǎng)不良癥的病因。在mDOT1L心肌特異性基因敲除小鼠中觀察到的DCM現(xiàn)象,可通過(guò)異位表達(dá)抗肌萎縮蛋白的截?cái)喙δ苡虻靡匝a(bǔ)救[49],這表明抗肌萎縮蛋白是DOT1L介導(dǎo)心臟功能的主要下游靶標(biāo)。與正常心臟組織相比,人類(lèi)原發(fā)性DCM心臟組織中DOT1L表達(dá)水平顯著下降[49],提示DOT1L失調(diào)可能是人類(lèi)DCM發(fā)病的因素之一。

Dot1在紅細(xì)胞生成中的作用 DOT1L敲除的胚胎在10.5天表現(xiàn)出嚴(yán)重的貧血,說(shuō)明胎兒紅細(xì)胞生成受到損害[47]。mDOT1L在紅細(xì)胞生成中的作用可能與先前報(bào)道的H3K79甲基化在紅系特異性β-珠蛋白周?chē)患嘘P(guān)[50]。為此,卵黃囊衍生的造血細(xì)胞中mDOT1L的不足能引起G0/G1細(xì)胞周期阻滯,而且在體外生長(zhǎng)刺激物存在時(shí)使培養(yǎng)的紅系祖細(xì)胞凋亡,但對(duì)骨髓系的生長(zhǎng)和分化沒(méi)有影響[47]。RT-qPCR和CHIP分析表明,mDOT1L通過(guò)激活GATA2發(fā)揮其在紅細(xì)胞生成中的作用。DOT1L缺陷的造血細(xì)胞下調(diào)GATA2,引起髓系轉(zhuǎn)錄因子PU.1去阻遏,從而阻止紅細(xì)胞分化[47]。

Dot1在骨關(guān)節(jié)中的作用 髖關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis,OA)是最常見(jiàn)的引起疼痛和殘疾的關(guān)節(jié)疾病。OA發(fā)病有多方面的原因,其中包括顯著遺傳傾向[51]。關(guān)節(jié)間隙寬度(joint space width,JSW)是關(guān)節(jié)內(nèi)軟骨厚度的參照物,因此最小JSW(mJSW)是在臨床試驗(yàn)和流行病學(xué)中研究膝關(guān)節(jié)和髖關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎的主要參數(shù)。通過(guò)全基因組關(guān)聯(lián)研究(GWAS)分析發(fā)現(xiàn)染色體19p13.3上的rs12982744多態(tài)性與OA的JSW有關(guān),而此SNP位于DOT1L基因上,提示DOT1L可能與OA發(fā)病有關(guān)[52-53]。最近發(fā)現(xiàn)DOT1L是腸道Wnt基因激活必不可少的特異酶,DOT1L也是果蠅體內(nèi)控制高水平Wnt信號(hào)通路下游基因表達(dá)所需的酶[54]。而Wnt信號(hào)在軟骨和骨形成及滑膜關(guān)節(jié)發(fā)育中起著關(guān)鍵作用[55]。Wnt突變?cè)谏缙谀芤鸢l(fā)育畦性(WNT3突變)。研究發(fā)現(xiàn)[52],沉默DOT1L在體外可抑制軟骨生成;在ADTC5細(xì)胞(軟骨細(xì)胞系)中敲除DOT1L會(huì)降低軟骨分化,并降低軟骨生成過(guò)程中蛋白多糖和膠原含量及礦化作用,同時(shí)Wnt靶基因的表達(dá)也有明顯的降低。此外,在ATDC5軟骨模型系統(tǒng)中DOT1L與TCF和Wnt信號(hào)交互作用[52]。這些發(fā)現(xiàn)表明,DOT1L通過(guò)調(diào)節(jié)Wnt靶基因的轉(zhuǎn)錄影響軟骨細(xì)胞分化,進(jìn)而參與OA發(fā)病過(guò)程。這使得DOT1L成為干預(yù)髖關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎的潛在治療靶點(diǎn),已開(kāi)發(fā)小分子抑制劑并啟動(dòng)Ⅰ期臨床試驗(yàn)[53]。

通過(guò)調(diào)節(jié)DOT1L的活動(dòng)來(lái)控制DOT1L依賴性疾病DOT1L缺陷抑制正常細(xì)胞周期進(jìn)程,因環(huán)境和物種的不同最終導(dǎo)致異常增殖,包括G1期停滯、有絲分裂停滯、衰老、非整倍體和細(xì)胞凋亡。 在人體敲除或沉默DOT1L能防止癌細(xì)胞擴(kuò)散。DOT1L缺陷型肺癌細(xì)胞會(huì)走向衰老,這可能是一種用來(lái)消除增殖活躍癌細(xì)胞的方法[44]。DOT1L下調(diào)也能導(dǎo)致LS174T結(jié)腸癌細(xì)胞的死亡,但HEK293T 細(xì)胞卻不會(huì)死亡[56]?；旌献V系白血病(mixed lineage leukemia,MLL)融合蛋白誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)化細(xì)胞局部會(huì)有H3K79甲基化,但沒(méi)有DOT1L的情況下會(huì)發(fā)生G1期停滯或凋亡[57]。特異的DOT1L抑制劑(如EPZ004777)能使MLL融合蛋白誘導(dǎo)的白血病細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞凋亡[58]。相反,致白血病融合蛋白CALM-AF10能使DOT1L從染色質(zhì)解離并降低H3K79me2總體水平[33]?？傊?下調(diào)DOT1L是一個(gè)潛在的癌癥治療策略,因?yàn)镈OT1L的缺失能抑制癌細(xì)胞的增殖。

盡管如此,靶向DOT1L可能對(duì)正常細(xì)胞是有害的,DOT1L介導(dǎo)的H3K79甲基化在發(fā)育、造血和維護(hù)器官功能方面有重要作用,提示臨床應(yīng)用DOT1L抑制劑一定要慎重考慮。 Daigle等[58]用DOT1L抑制劑EPZ004777治療能殺死MLL重排型白血病細(xì)胞,但對(duì)非MLL重排型白血病細(xì)胞或造血干細(xì)胞無(wú)影響。這種差異提供了MLL融合白血病有效的治療手段,但在其他實(shí)體瘤中需對(duì)其控制細(xì)胞增殖的能力進(jìn)行評(píng)估。