劉雯雯，程　田，馬珊珊，黃團結(jié)，劉艷霞，程　康，李　鵬，許　玲，楊　璐，張　濤，關(guān)方霞

1)鄭州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院干細胞研究室 鄭州 450001　2)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院骨科 鄭州 450052

脊髓損傷(spinal cord injury，SCI)是一種嚴(yán)重的中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷，目前尚未發(fā)現(xiàn)有效的治療手段。表觀遺傳調(diào)控是一種以染色質(zhì)為基礎(chǔ)的基因表達調(diào)控，其中組蛋白乙?；潜碛^遺傳調(diào)控中較為廣泛的一類研究。研究[1]發(fā)現(xiàn)組蛋白的乙?；脚c多種神經(jīng)疾病相關(guān)。有報道[2]表明組蛋白去乙?；?histone deacetylase，HDAC)抑制劑能調(diào)節(jié)神經(jīng)干細胞的分化。TSA是一種穩(wěn)定且高效的HDAC抑制劑。有研究[3]證實TSA能夠?qū)π∈笕毖阅X損傷等腦損傷疾病發(fā)揮神經(jīng)保護作用，但是關(guān)于TSA在SCI后是否具有神經(jīng)保護功能的研究尚未見報道。所以本研究以此為背景，探究TSA對SCI小鼠的神經(jīng)保護作用。

1　材料與方法

1.1材料TSA購于美國Sigma公司，ELISA試劑盒購于美國 Tsz Biosciences 公司，碘化丙啶購自美國Sigma公司，二氫乙錠(HEt)購于美國Medchemexpress公司，TUNEL試劑盒購于南京建成生物工程研究所，兔抗髓磷脂堿性蛋白(myelin basic protein, MBP)單克隆抗體購于英國Abcam公司，兔抗NeuN單克隆抗體購于美國CST公司，熒光二抗CY3購于上海生工生物有限公司，RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄及實時定量PCR試劑盒均購于日本TaKaRa公司。實驗所用雄性C57BL/6小鼠，8～12周齡，體重20～26 g，購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。實驗動物方案由鄭州大學(xué)動物護理與使用委員會批準(zhǔn)。

1.2SCI動物模型的建立腹腔注射100 g/L的水合氯醛(0.33 mL/kg)麻醉小鼠。將已麻醉的小鼠放置在實驗臺上，沿著背部中線剪開皮膚，去除T9/10水平椎板，暴露硬脊膜。將小鼠固定在立體定位儀上，采用改良小鼠Allen′s法擊打T10節(jié)段制備小鼠SCI模型[4]。致傷瞬間，小鼠痙攣性擺尾、雙下肢及軀體回縮撲動后雙下肢癱瘓為造模成功的標(biāo)志。分別縫合肌肉和皮膚切口。術(shù)后對實驗小鼠進行膀胱按摩，3次/d，以助其排尿直到膀胱恢復(fù)功能。

1.3實驗分組36只小鼠造模后隨機分為對照組(Vehicle組,Veh組)和TSA治療組(TSA組)，每組18只。兩組小鼠均在術(shù)后3 h通過尾靜脈注射給藥，TSA組給予1 mg/kg TSA(2 g/L)，Veh組注射等量的生理鹽水，1次/d，連續(xù)注射3 d。

1.4小鼠后肢功能評估兩組各取8只小鼠，在SCI后第1、3、7、14、21和28天，使用詳細的Basso Mouse Scale (BMS評分)標(biāo)準(zhǔn)，在曠場中對小鼠后肢功能進行評估[5]。評分0～9分，0表示后肢完全麻痹，9表示后肢完全正常。由2名觀察者分別進行評分，取均值。

1.5PI染色和ROS染色SCI后第3天，2組各取5只小鼠，于處死前1 h腹腔注射10 g/L的碘化丙啶(0.4 mg/kg)，麻醉后心臟取血備用，處死后取損傷部位脊髓組織，冰凍切片，熒光顯微鏡下觀察壞死細胞數(shù)并拍照。2組另取5只小鼠，腹腔注射1 g/L的Het，1 h后麻醉，心臟取血備用，處死小鼠，常規(guī)處理后，脊髓組織切片，熒光顯微鏡拍照觀察，記錄活性氧(ROS)的積累。

1.6小鼠血清中炎癥因子TNF-α和IL-10表達的檢測將1.5中小鼠心臟所取血液標(biāo)本(n=6)靜置分層，離心吸取上清，按照ELISA試劑盒說明書步驟操作，檢測小鼠血清中炎癥因子TNF-α和IL-10的表達。

1.7神經(jīng)營養(yǎng)因子的檢測取1.4中SCI第28天的小鼠3只，麻醉后處死，取損傷節(jié)段脊髓組織，用RNA提取試劑盒提取組織RNA，使用反轉(zhuǎn)錄和實時定量PCR試劑盒，參考說明書的步驟，以GAPDH作為內(nèi)參，檢測腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain derived neurotrophic factor,BDNF)和神經(jīng)營養(yǎng)因子3(neurotrophin-3，NT3)mRNA的表達，按2-ΔΔCt法計算定量。引物序列和片段長度見表1。實驗重復(fù)3次。

表1　小鼠BDNF、NT3引物序列

1.8免疫熒光染色取1.4中SCI后第28天組的剩余5只小鼠，麻醉處死，取損傷部位脊髓組織制作冰凍切片。參照文獻[6]方法對切片進行免疫熒光染色，檢測MBP(11 000，標(biāo)記脊髓白質(zhì)中的正常髓鞘)和神經(jīng)元標(biāo)記基因NeuN(1200)。熒光顯微鏡下觀察拍照，分別記錄MBP染色陽性區(qū)域面積占總面積的百分比和進行神經(jīng)元計數(shù)。

1.9統(tǒng)計學(xué)處理應(yīng)用SPSS 21.0進行分析。兩組SCI后不同時間點BMS評分的比較采用重復(fù)測量數(shù)據(jù)的方差分析，兩組間同一時間點其他指標(biāo)的比較采用兩獨立樣本t檢驗，檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2　結(jié)果

2.1兩組小鼠運動功能的比較兩組小鼠術(shù)后不同時間點運動功能BMS評分的比較見表2。BMS評分結(jié)果顯示，從第7天開始TSA治療組BMS評分高于Veh組。

表2　兩組小鼠術(shù)后BMS評分比較

F組間=40.320，F(xiàn)天數(shù)=97.120，F(xiàn)交互=5.350，P<0.01；*：與Veh組相比，P<0.05

2.2兩組小鼠損傷部位細胞壞死情況和ROS水平的比較結(jié)果見圖1，表3。可知TSA能減輕SCI部位的細胞壞死情況，降低損傷部位ROS的表達，減輕氧化損傷。

1：細胞壞死情況(PI染色)；2：ROS的產(chǎn)生情況(HEt染色)；3、4：分別為脊髓組織MBP的含量及NeuN的表達(免疫熒光染色)圖1　兩組小鼠損傷部位不同指標(biāo)的比較

表3　兩組小鼠損傷部位壞死細胞數(shù)和ROS水平的比較

2.3兩組小鼠血清中炎癥因子水平的比較結(jié)果見表4。TSA組小鼠血清中IL-10的含量較Veh組升高，而TNF-α的含量降低。

表4　兩組小鼠損傷后血清中IL-10和TNF-α的表達水平

2.4兩組小鼠損傷部位神經(jīng)營養(yǎng)因子的表達比較

結(jié)果見表5。由表5可知，TSA組的BDNF和NT3 mRNA的表達量高于Veh組。

2.5兩組小鼠損傷部位MBP染色陽性區(qū)域面積占總面積百分比及神經(jīng)元計數(shù)比較結(jié)果見圖1，表5。由表5可知，TSA組MBP染色陽性區(qū)域(白質(zhì))面積占總面積百分比高于Veh組，且神經(jīng)元表達數(shù)量明顯增多。

表5　兩組小鼠神經(jīng)營養(yǎng)因子的表達及MBP染色和神經(jīng)元計數(shù)結(jié)果

3　討論

TSA是鏈霉菌代謝產(chǎn)物，最初被當(dāng)作抗真菌藥物使用，之后被發(fā)現(xiàn)可誘導(dǎo)細胞分化[7]。目前，在表觀遺傳學(xué)中，TSA作為一種穩(wěn)定而高特異性的HDAC抑制劑而備受關(guān)注。研究[8]發(fā)現(xiàn)HDAC抑制劑具有廣泛的神經(jīng)保護作用，并且神經(jīng)保護功能與其對HDAC的抑制有關(guān)[9]。許多神經(jīng)系統(tǒng)疾病與蛋白質(zhì)乙?；胶拖嚓P(guān)轉(zhuǎn)錄功能障礙的不平衡有關(guān)[10]。HDAC抑制劑能夠增加組蛋白乙?；?，調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄和上調(diào)神經(jīng)營養(yǎng)因子的表達，因此有望用于干預(yù)治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病[11-12]。有研究[13]證實HDAC抑制劑丙戊酸能夠在SCI后改善小鼠的運動情況和促進神經(jīng)元的軸突生長，因此，本實驗以此為背景進行了相關(guān)研究。

SCI按照病理生理過程分為原發(fā)性損傷和繼發(fā)性損傷，原發(fā)性損傷是不可逆損傷，繼發(fā)性損傷主要包括氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)、興奮性毒性、鈣超載、微循環(huán)障礙及電解質(zhì)失衡等，SCI的治療主要是減輕繼發(fā)性損傷造成的傷害[14]。有文獻[15]報道，TSA在體外能減輕氧化損傷產(chǎn)生的ROS，減輕氧化損傷。同時，作為HDAC抑制劑，TSA可能上調(diào)神經(jīng)營養(yǎng)因子，降低炎癥反應(yīng)，改善損傷區(qū)域的微環(huán)境，減輕損傷區(qū)域的細胞壞死和白質(zhì)損傷。研究[16]還證實TSA具有促進干細胞分化的能力，所以可能會促進損傷區(qū)域神經(jīng)元的表達。

本研究采用TSA治療SCI證實了以上推斷。BMS評分作為小鼠SCI后評價后肢運動功能的標(biāo)準(zhǔn)，TSA組的BMS評分高于Veh組，表明TSA有利于小鼠后肢運動功能的恢復(fù)。通過TSA治療，小鼠損傷部位ROS含量減少，同時，ELISA結(jié)果表明血清中抑炎因子IL-10含量升高而炎癥因子TNF-α含量減少。qRT-PCR結(jié)果顯示TSA組神經(jīng)營養(yǎng)因子BDNF和NT3 mRNA的表達量均高于Veh組，損傷部位壞死細胞數(shù)量和白質(zhì)損傷情況也有明顯改善，并且神經(jīng)元的數(shù)量亦較Veh組增多。由此可得出TSA對SCI小鼠有神經(jīng)保護作用。

我們推測TSA對神經(jīng)保護的具體機制可能是由于其能激活Nrf2/ARE通路。Nrf2/ARE通路是經(jīng)典的氧化應(yīng)激通路，能減輕損傷后由于氧化應(yīng)激造成的繼發(fā)性損傷。但是在SCI小鼠模型中，TSA是否是由于激活Nrf2/ARE通路而發(fā)揮神經(jīng)保護的作用還不清楚，仍需在以后的研究中進一步探討。

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