石　雁，葛路路，王　靜，吳秋歌

鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科 鄭州 450052

目前，肺癌是全世界病死率最高的惡性腫瘤，5 a生存率約為 18%[1]。其中， 非小細(xì)胞肺癌(non small cell lung cancer,NSCLC)約占肺癌的80%，約70%的患者確診時(shí)已為晚期[2]。肺癌不良的預(yù)后與其易浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移的生物學(xué)特性密切相關(guān),且侵襲轉(zhuǎn)移不僅是病情惡化的標(biāo)志，還是治療失敗的重要原因[3-4]。叉頭框轉(zhuǎn)錄因子C1(forkhead box transcription factor C1，F(xiàn)OXC1)是叉頭框轉(zhuǎn)錄因子家族重要的成員之一，不僅參與了胚胎、眼睛、肢體、腎臟等重要器官的發(fā)育，而且在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中也起到了關(guān)鍵作用[5]。研究[6-7]發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXC1可促進(jìn)乳腺癌、胃癌、肝癌、惡性黑色素瘤等腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移及侵襲能力。本研究通過免疫組化法檢測(cè)了NSCLC組織及相應(yīng)癌旁正常組織中FOXC1的表達(dá)，分析了其表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系。

1　對(duì)象與方法

1.1研究對(duì)象選擇2012年1月至2013年12月鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院術(shù)后病理確診為NSCLC且術(shù)前未接受過放化療及其他治療的70例患者，收集其石蠟包埋的癌組織及距癌灶2 cm、病理證實(shí)為正常肺組織的癌旁組織。其中男52例，女18例；年齡39～77歲；鱗癌30例，腺癌40例；高分化11例，中低分化59例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移31例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移39例；TNM分期(UICC2017年修訂)Ⅰ～Ⅱ期46例，Ⅲ期24例。所有患者術(shù)后1個(gè)月內(nèi)開始接受正規(guī)化療，21 d為1個(gè)化療周期，共4個(gè)周期；均未接受放療、抗血管生成及靶向藥物等治療。化療方案分別為吉西他濱+奧沙利鉑、多西他賽+奈達(dá)鉑、培美曲塞+奈達(dá)鉑、吉西他濱+奈達(dá)鉑、多西他賽+順鉑。

1.2NSCLC及癌旁正常組織中FOXC1的檢測(cè)采用免疫組化SP法檢測(cè)。FOXC1羊抗人抗體購自英國(guó)Abcam公司，SP-9001免疫組化試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，DAB顯色試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司。組織標(biāo)本均經(jīng)甲醛固定，石蠟包埋，連續(xù)3～4 μm切片；切片經(jīng)二甲苯及梯度乙醇脫蠟水化，0.01 mol/L檸檬酸鈉緩沖液(pH=6.0)100 ℃修復(fù)抗原，加H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，PBS沖洗，滴加封閉液；滴加一抗(PBS稀釋，稀釋度1200)4 ℃過夜，室溫復(fù)溫，PBS沖洗，滴加二抗37 ℃孵育30 min；PBS沖洗，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，鹽酸乙醇脫分化，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察。以PBS代替一抗作陰性對(duì)照，以已知陽性的肺組織切片作陽性對(duì)照。由兩位高年資病理科醫(yī)師雙盲閱片。陽性細(xì)胞表現(xiàn)為細(xì)胞核或胞質(zhì)黃色或棕褐色著色。于200倍鏡下選取10個(gè)視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，以陽性細(xì)胞百分比和染色強(qiáng)度進(jìn)行評(píng)分[8]。陽性細(xì)胞百分比<5%、5%～、26%～、51%～、>75%分別評(píng)為0、1、2、3、4分；無染色、淡黃色、棕黃色、棕褐色著色分別評(píng)為0、1、2、3分；兩項(xiàng)評(píng)分相乘，≤3分為低表達(dá)，>3分為高表達(dá)。

1.3隨訪對(duì)所有患者從術(shù)后至2017年4月進(jìn)行隨訪觀察。電話隨訪患者的生存情況?；颊呙?1 d于該院行胸部CT、頸部淋巴結(jié)、心臟及腹部彩超檢查，每3個(gè)月行頭顱磁共振、全身骨顯像檢查，胸部CT原發(fā)腫瘤病灶長(zhǎng)徑與短徑之和較前增加25%及以上或其他檢查提示其他部位出現(xiàn)新的腫瘤病灶或因NSCLC死亡視為疾病進(jìn)展。隨訪時(shí)間為2～40個(gè)月，平均13個(gè)月，隨訪資料完整。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 21.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，癌組織與癌旁正常組織間FOXC1表達(dá)的比較采用配對(duì)χ2檢驗(yàn)，不同病理特征的NSCLC組織中FOXC1蛋白表達(dá)的比較采用χ2檢驗(yàn)。采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線并進(jìn)行Log-rank檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2　結(jié)果

2.1NSCLC組織中FOXC1蛋白的表達(dá)見圖1、表1。NSCLC組織中FOXC1高表達(dá)率為80.0%(56/70)，高于癌旁正常組織25.7%(18/70)。不同病理特征的NSCLC組織中FOXC1蛋白表達(dá)情況見表2。

A：肺腺癌組織；B：肺腺癌對(duì)應(yīng)的癌旁組織；C：肺鱗癌組織；D：肺鱗癌對(duì)應(yīng)的癌旁組織圖1　FOXC1在NSCLC癌組織及癌旁正常組織中的表達(dá)情況(SP,×200)

表1　NSCLC與癌旁正常組織中FOXC1的表達(dá)　例

χ2=31.114，P<0.001

表2　不同臨床病理特征NSCLC組織中FOXC1表達(dá)的比較

2.2FOXC1高表達(dá)與低表達(dá)的NSCLC患者術(shù)后生存曲線的比較FOXC1高表達(dá)組中3例失訪，1例死于冠心病，1例死于腦出血(非肺癌腦轉(zhuǎn)移瘤破裂)，3例未出現(xiàn)病情進(jìn)展，余48例患者皆出現(xiàn)病情進(jìn)展，中位疾病無進(jìn)展生存期(progression free survival，PFS)為10.5個(gè)月；FOXC1低表達(dá)組中1例失訪，1例死于腦梗死，2例未出現(xiàn)病情進(jìn)展，余10例患者皆出現(xiàn)病情進(jìn)展，中位PFS為15.5個(gè)月；兩組生存曲線(圖2)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.047，P=0.044)。

圖2　生存曲線

3　討論

FOX是一類廣泛存在的轉(zhuǎn)錄因子，包括19個(gè)亞家族[9]，參與胚胎發(fā)育、細(xì)胞周期調(diào)控、組織特異性基因表達(dá)、免疫調(diào)節(jié)、細(xì)胞增殖、分化、轉(zhuǎn)移和凋亡等多個(gè)生物學(xué)過程,其基因突變或表達(dá)異常與發(fā)育畸形、腫瘤發(fā)生相關(guān)[10]。FOXC1是FOXC基因亞族成員之一，位于人類染色體6p25，基因全長(zhǎng)約3.5 kb，含一個(gè)1.6 kb的外顯子，編碼包含553個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，在人體肺、心臟、食管、肝、胰腺、膀胱和前列腺等多個(gè)組織器官中表達(dá)[11]。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXC1在腫瘤的發(fā)生與進(jìn)展中扮演著重要的角色。Hayashi等[12]發(fā)現(xiàn)FOXC1可通過調(diào)控Notch信號(hào)通路及與血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子相互作用導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。Ray等[13]研究證實(shí)，F(xiàn)OXC1高表達(dá)的已發(fā)生腦轉(zhuǎn)移的基底樣細(xì)胞乳腺癌患者，顱內(nèi)無進(jìn)展生存期縮短，且如果抑制FOXC1基因的表達(dá)，乳腺癌細(xì)胞的侵襲能力亦減弱。Xia等[14]研究發(fā)現(xiàn)，在癌組織中FOXC1高表達(dá)的肝癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)及發(fā)生肺轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)更高。

本研究結(jié)果顯示，F(xiàn)OXC1在NSCLC組織中的表達(dá)明顯高于癌旁正常組織，F(xiàn)OXC1高表達(dá)與患者的年齡、性別、病理類型無關(guān)，這與FOXC1在其他系統(tǒng)腫瘤的研究結(jié)果相一致。低分化、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期Ⅲ期的NSCLC組織中FOXC1的表達(dá)高于高分化、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期Ⅰ～Ⅱ期者，且PFS長(zhǎng)于后者，這可能與FOXC1促進(jìn)肺癌細(xì)胞的遷移、浸潤(rùn)能力有關(guān)，但其分子機(jī)制尚不明確。有報(bào)道[15]證實(shí)FOXC1可通過激活MST1R/P13K/AKT通路促進(jìn)惡性黑色素瘤細(xì)胞的增殖、分化、遷徙、浸潤(rùn)。FOXC1可作用于NF-κB信號(hào)通路，調(diào)控乳腺癌細(xì)胞的生物學(xué)行為[16]。近年來許多研究[17-18]發(fā)現(xiàn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化可能是腫瘤細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)移侵襲的重要機(jī)制。在上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程中，上皮細(xì)胞逐漸喪失細(xì)胞極性，丟失細(xì)胞間的黏附連接和緊密連接，最終變成具有間質(zhì)細(xì)胞形態(tài)和特征的細(xì)胞，從而獲得浸潤(rùn)和游走遷移的能力[15]。高表達(dá)的FOXC1可誘導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞及乳腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移及侵襲[19-20]。或許，F(xiàn)OXC1也是通過促進(jìn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化而增強(qiáng)了NSCLC細(xì)胞的轉(zhuǎn)移侵襲能力，但有關(guān)機(jī)制仍待進(jìn)一步研究。

綜上，F(xiàn)OXC1在NSCLC組織中表達(dá)明顯高于癌旁正常組織，且與腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期相關(guān)；FOXC1高表達(dá)組患者的PFS明顯短于低表達(dá)組；因此，F(xiàn)OXC1表達(dá)高低可作為評(píng)估NSCLC患者預(yù)后的一個(gè)重要參考因素，明確FOXC1在NSCLC發(fā)生、發(fā)展過程中的作用機(jī)制可為臨床治療NSCLC提供新的靶點(diǎn)與思路。本研究的缺陷是納入患者例數(shù)較少，且低表達(dá)組樣本量只有14例，故研究結(jié)果需更大的樣本量進(jìn)一步驗(yàn)證。

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