劉健慧,　張曉丹,　周　愿,　單亦初,　方　菲,　張麗華*,　張玉奎(. 中國(guó)科學(xué)院分離分析化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所, 遼寧 大連 6023; 2. 中國(guó)科學(xué)院大學(xué), 北京 00049)

近年來(lái),蛋白質(zhì)組定量方法的不斷發(fā)展推動(dòng)了生物學(xué)與精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域的深入理解。在實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確定量的前提下,多時(shí)空變化、多變量、大樣本量的蛋白質(zhì)組定量分析[1-4]可以更精準(zhǔn)地揭示生物過(guò)程的發(fā)生發(fā)展機(jī)制,尋找重要的疾病標(biāo)志物。因此,高通量的樣品預(yù)處理及定量分析已經(jīng)成為近年來(lái)蛋白質(zhì)組學(xué)方法發(fā)展的趨勢(shì)。

為了提高蛋白質(zhì)組定量準(zhǔn)確度,本課題組前期開(kāi)發(fā)了基于質(zhì)量虧損的準(zhǔn)等重二甲基化標(biāo)記(pIDL[5])策略,利用相差5.84 mDa的低相對(duì)分子質(zhì)量的成對(duì)碎片離子可以實(shí)現(xiàn)基于二級(jí)譜的蛋白質(zhì)組學(xué)相對(duì)定量。該方法定量結(jié)果與理論值相對(duì)偏差低于2%,動(dòng)態(tài)范圍達(dá)到4個(gè)數(shù)量級(jí),定量結(jié)果優(yōu)于現(xiàn)有基于MS1和MS/MS的相對(duì)定量方法,具有很高的定量準(zhǔn)確度,并已在基于鳥(niǎo)槍法的全蛋白質(zhì)組定量分析[5,6]、完整蛋白質(zhì)定量分析[7]等領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。為了增加該方法的分析通量,可以結(jié)合選擇性二甲基化交叉標(biāo)記策略[8,9]實(shí)現(xiàn)多樣品的等重標(biāo)記及同時(shí)定量分析。但選擇性二甲基化標(biāo)記策略需要兩步反應(yīng),其間需要進(jìn)行溶劑交換操作。目前常見(jiàn)的標(biāo)記方法為自由溶液反應(yīng)結(jié)合固相萃取(SPE)柱溶劑交換,或在SPE柱上固相標(biāo)記。自由溶液反應(yīng)結(jié)合SPE柱溶劑交換方法[9]操作較復(fù)雜,需要固相萃取及凍干重溶等多步繁瑣的樣品預(yù)處理,樣品損失較大,且影響不同樣品之間的定量準(zhǔn)確度;與之相比,SPE柱上固相標(biāo)記策略[8]兩步標(biāo)記反應(yīng)均在柱上進(jìn)行,標(biāo)記肽段無(wú)需反復(fù)洗脫,且溶劑置換過(guò)程簡(jiǎn)便,更利于實(shí)驗(yàn)操作。但目前的裝置難以控制反應(yīng)時(shí)間且難以同時(shí)進(jìn)行多樣本標(biāo)記,限制了其大規(guī)模的應(yīng)用。

StageTip[10-12]、商品化ZipTip等集成化蛋白質(zhì)組樣品預(yù)處理裝置憑借高效的脫鹽、富集、分級(jí)能力及操作簡(jiǎn)便性,在大批量的樣品預(yù)處理過(guò)程中得到了廣泛的應(yīng)用。其高效的溶劑交換能力及多樣品同時(shí)處理能力也大大有利于選擇性二甲基化標(biāo)記策略。但目前,由于該裝置難以控制標(biāo)記反應(yīng)時(shí)間,仍未應(yīng)用于蛋白質(zhì)組選擇性二甲基化標(biāo)記策略中。

基于此,本文將C18填料裝填入移液槍頭中,制成了StageTip標(biāo)記裝置,通過(guò)控制離心力的大小保證標(biāo)記反應(yīng)時(shí)間及溶劑交換,發(fā)展了一種基于pIDL標(biāo)記策略的高通量肽段選擇性交叉標(biāo)記裝置(pIDL-StageTip),并優(yōu)化了標(biāo)記試劑的反應(yīng)條件,用標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)及人源全蛋白質(zhì)組酶解產(chǎn)物評(píng)價(jià)了其標(biāo)記效率及選擇性、定量準(zhǔn)確度及精密度。

1　實(shí)驗(yàn)部分

1.1　儀器、試劑與材料

乙腈(ACN)與甲醇購(gòu)自Merck公司(德國(guó)),冰乙酸(CH3COOH)購(gòu)自天津市大茂化學(xué)試劑廠,磷酸一氫鈉與磷酸二氫鈉購(gòu)自天津市科密歐化學(xué)試劑開(kāi)發(fā)中心,牛血清白蛋白(BSA)、甲醛及其同位素試劑(CH2O、13CH2O、13CD2O、CD2O)、氰基硼氫化鈉(NaBH3CN)、氰基硼氘化鈉(NaBD3CN)、重水(D2O)、α-氰基-4-羥基肉桂酸(CHCA)、三氟乙酸(TFA)購(gòu)自Sigma-Aldrich公司(美國(guó))。所有實(shí)驗(yàn)用水均經(jīng)過(guò)Milli-Q system (Millipore公司,美國(guó))純化。

圓盤(pán)形SPE萃取膜購(gòu)自3M公司(美國(guó)), 200 μL吸嘴、離心管購(gòu)自Axygen公司(美國(guó)), C18硅膠填料(粒徑5 μm,孔徑15 nm)購(gòu)自天津博納艾杰爾科技有限公司,C18分離材料(粒徑1.9 μm)購(gòu)自Dr. Maisch公司(德國(guó))。離心機(jī)購(gòu)自Sigma公司(美國(guó))。采用ultrafleXtreme MALDI TOF/TOF質(zhì)譜儀(布魯克公司,德國(guó))與EASY-nLC 1000高效液相色譜-Q-Exactive質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)(賽默飛世爾科技公司,美國(guó))評(píng)價(jià)效果。

圖 1　pIDL-StageTip制作的示意圖Fig. 1　Schematic representation of pseudo-isobaric dimethyl labeling-StageTips (pIDL-StageTips) production

1.2　選擇性二甲基化標(biāo)記裝置的構(gòu)建

構(gòu)建步驟如圖1所示,將圓盤(pán)形SPE萃取膜裁剪成小塊,填入200 μL吸嘴中壓實(shí)。用鉆頭或鈍針等粗桿在離心管蓋上鉆孔?？刂瓶状笮?使吸嘴的高度低于離心機(jī)腔體高度,且吸嘴的下尖端高于離心管底0.5 cm以上。將吸嘴固定于帶孔的離心管上。將6 mg C18填料溶于150 μL甲醇中,離心填入填料并高轉(zhuǎn)速壓實(shí),即可制得pIDL-StageTip裝置。

1.3　牛血清白蛋白(BSA)及細(xì)胞株YTS酶解產(chǎn)物的標(biāo)記與分析

對(duì)肽段進(jìn)行選擇性二甲基化標(biāo)記,流程如圖2所示。

圖 2　肽段選擇性二甲基化標(biāo)記流程圖Fig. 2　Flow chart for labeling steps of pIDL-StageTips

1.3.1pIDL-StageTip的活化、平衡和上樣

將200 μL 50%(v/v)ACN水溶液加入裝置中離心,重復(fù)多次,活化pIDL-StageTip。再用水相反復(fù)平衡,將BSA酶解產(chǎn)物加入裝置中,離心上樣,重復(fù)上樣3次。

1.3.2酸性條件下二甲基化選擇性標(biāo)記肽段N端

在160 μL 1.5%(v/v) CH3COOH酸性溶液中加入20 μL相應(yīng)的4%(v/v)甲醛及其同位素試劑和20 μL 0.6 mol/L氰基硼氘化鈉,或在180 μL 1.5%(v/v) CH3COOH酸性溶液中加入10 μL相應(yīng)的4%(v/v)甲醛及其同位素試劑和10 μL 0.6 mol/L 氰基硼氫化鈉，配制成標(biāo)記反應(yīng)液。將反應(yīng)液加入pIDL-StageTip中,利用1 500 g的離心力保證反應(yīng)液逐漸流過(guò)C18填料,離心使標(biāo)記試劑與肽段N端氨基反應(yīng)。

1.3.3反應(yīng)試劑沖洗及溶劑交換

加入水相沖洗標(biāo)記試劑,再加入50 mmol/L pH 8.0磷酸鹽緩沖液,置換pIDL-StageTip至堿性條件。

1.3.4堿性條件下二甲基化標(biāo)記肽段C端

在160 μL的50 mmol/L pH 8.0磷酸鹽緩沖液中加入20 μL相應(yīng)的4%(v/v)甲醛及其同位素試劑和20 μL 0.6 mol/L氰基硼氫/氘化鈉,配制成標(biāo)記反應(yīng)液。將反應(yīng)液加入pIDL-StageTip中,同酸性條件下操作,利用1 500 g的離心力反應(yīng)10 min,使標(biāo)記試劑與肽段C端賴(lài)氨酸上氨基反應(yīng)。

1.3.5反應(yīng)試劑的沖洗及洗脫

加入水相沖洗標(biāo)記試劑,再加入80%(v/v) ACN水溶液反復(fù)洗脫標(biāo)記后的肽段,收集洗脫液,待MALDI-TOF檢測(cè)。

1.3.6MALDI-TOF質(zhì)譜分析

將7 mg/mL CHCA基質(zhì)溶解于含0.1%(v/v) TFA的ACN/H2O(6∶4, v/v)溶液中。取2 μL標(biāo)記后的肽段洗脫液點(diǎn)靶,干燥后再取2 μL CHCA基質(zhì)點(diǎn)靶。干燥后進(jìn)行MALDI-TOF分析。

1.3.7LC-MS質(zhì)譜分析

高效液相色譜分離體系的流動(dòng)相A為98%H2O+2%ACN+0.1%FA(均為體積分?jǐn)?shù),下同), B為98%ACN+2%H2O+0.1%FA。在C18毛細(xì)管分離柱(150 mm×100 μm)上以600 nL/min的流速梯度分離肽段:2%B(0 min)～6%B(0.1 min)～25%B (80 min)～40%B (110 min)～80%B (115 min)～80%B (125 min)。

Q-Exactive質(zhì)譜儀采集模式為正離子模式,一級(jí)譜掃描范圍為m/z300～1 800,分辨率為70 000,自動(dòng)增益控制(AGC)為3×106,最大離子注入時(shí)間為60 ms;二級(jí)譜分辨率為35 000,自動(dòng)增益控制(AGC)為2×105,最大離子注入時(shí)間為110 ms,取TopN=12(前12強(qiáng)),隔離窗口m/z2.0,從m/z50.0開(kāi)始采集,碰撞能量(NCE)為28。

2　結(jié)果與討論

2.1　裝置的設(shè)計(jì)

選擇性二甲基化交叉標(biāo)記反應(yīng)是根據(jù)肽段的N末端氨基和C末端賴(lài)氨酸側(cè)鏈氨基在pH酸性條件下反應(yīng)速度不同的性質(zhì),依次在酸性、堿性條件下對(duì)肽段N末端和C末端進(jìn)行不同的二甲基化標(biāo)記的策略。該策略可以實(shí)現(xiàn)不同樣品的等重標(biāo)記及二級(jí)譜碎片離子定量,結(jié)合本課題組[5]開(kāi)發(fā)的pIDL策略,可以有效地提高蛋白質(zhì)組定量準(zhǔn)確度和分析通量。為了使該策略在大量樣品的定量分析中具有更高的可操作性和簡(jiǎn)便性,本文發(fā)展了基于pIDL標(biāo)記策略的高通量肽段末端選擇性交叉標(biāo)記裝置。

如圖1所示,本裝置結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單,采用的吸嘴、離心管為實(shí)驗(yàn)室常用耗材,簡(jiǎn)單易得且成本低廉;只需要離心力即可完成裝填、樣品標(biāo)記及溶劑置換,操作簡(jiǎn)單,可同時(shí)標(biāo)記大批量樣品,省時(shí)省力,滿足大量樣品分析的需求。由于吸嘴尖端裝填C18填料,尖端壓力有所增加,利于通過(guò)較低的離心力使標(biāo)記試劑緩慢流過(guò)C18填料,避免壓力過(guò)低時(shí)流速不可控。最終確定1 500 g的離心力下,200 μL標(biāo)記試劑經(jīng)10 min通過(guò)pIDL-StageTip。因此,該裝置保證了標(biāo)記反應(yīng)時(shí)間的可控性、大量樣品標(biāo)記的簡(jiǎn)便性,是選擇性二甲基化交叉標(biāo)記反應(yīng)的理想裝置。

圖 3　NaBD3CN體系中不同反應(yīng)時(shí)間對(duì)肽段RPCFSALT-PDETYVPK標(biāo)記效率及選擇性的影響Fig. 3　Effect of different reaction times with NaBD3CN on labeling efficiency and selectivity of peptide RPCFSALTPDETYVPK

二甲基化標(biāo)記使用甲醛及其同位素試劑與伯胺反應(yīng)形成希夫堿,氰基硼氫化鈉或氰基硼氘化鈉再將其還原成甲基。酸性條件下由于溶液中含有大量的活潑氫,會(huì)與氰基硼氘化鈉中的氘原子發(fā)生明顯的回交,導(dǎo)致標(biāo)記質(zhì)量誤差。為避免這一現(xiàn)象,酸性條件下使用氰基硼氘化鈉做還原劑時(shí),選擇重水作為溶液。但發(fā)現(xiàn)重水體系影響二甲基化反應(yīng)速率,因此下面分別優(yōu)化酸性條件下使用NaBD3CN和NaBH3CN作還原劑的體系,保證對(duì)肽段標(biāo)記的效率及選擇性。

2.2　酸性條件下NaBD3CN體系標(biāo)記選擇性的優(yōu)化

我們采用BSA酶解產(chǎn)物中末端為賴(lài)氨酸的肽段考察標(biāo)記效率及選擇性。為了更有效地考察酸性條件下的標(biāo)記選擇性,這里只在酸性條件下對(duì)NaBD3CN還原的肽段N末端進(jìn)行標(biāo)記,選擇標(biāo)記試劑為13CH2O與NaBD3CN,標(biāo)記時(shí)間分別為10、20、30 min,考察可以實(shí)現(xiàn)N端完全標(biāo)記且不會(huì)標(biāo)記C末端賴(lài)氨酸的最佳反應(yīng)時(shí)間。

如圖3所示,肽段RPCFSALTPDETYVPK自10 min起即標(biāo)記完全,原始肽段質(zhì)荷比1 881處肽段峰消失,標(biāo)記后N末端增加32 Da,肽段質(zhì)荷比1 913處出現(xiàn)肽段峰。由肽段峰面積計(jì)算,標(biāo)記效率為100%。說(shuō)明該裝置對(duì)肽段N端標(biāo)記效率高,增加標(biāo)記時(shí)間對(duì)標(biāo)記效率并沒(méi)有明顯的影響。同時(shí),為了避免酸性條件下對(duì)肽段C末端的賴(lài)氨酸同時(shí)標(biāo)記,使標(biāo)記選擇性降低,考察了標(biāo)記時(shí)間對(duì)選擇性的影響。如果C末端的賴(lài)氨酸進(jìn)行了標(biāo)記,肽段質(zhì)荷比為1 945。如圖3所示,標(biāo)記10 min時(shí)未出現(xiàn)賴(lài)氨酸上非選擇性標(biāo)記峰,標(biāo)記選擇性100%。但20 min后,隨著反應(yīng)時(shí)間的增加,賴(lài)氨酸上發(fā)生標(biāo)記的現(xiàn)象更加明顯,說(shuō)明反應(yīng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)使標(biāo)記選擇性有所降低,故選擇10 min作為酸性條件下NaBD3CN體系的標(biāo)記時(shí)間較合理。

圖 4　NaBD3CN體系中不同反應(yīng)時(shí)間對(duì)肽段GLVLIAFSQYLQQCPFDEHVK標(biāo)記效率及選擇性的影響Fig. 4　Effect of different reaction time with NaBD3CN on labeling efficiency and selectivity of peptide GLVLIAFSQYLQQCPFDEHVK

為了考察不同肽段的標(biāo)記最優(yōu)條件是否存在明顯差別,考察了肽段GLVLIAFSQYLQQCPFDEHVK的標(biāo)記效果。如圖4所示,與肽段RPCFSALTPDETYVPK標(biāo)記情況相似,原始肽段峰(m/z2 493)10 min后即消失,出現(xiàn)增加32 Da的N端標(biāo)記后肽段峰(m/z2 525)。標(biāo)記10 min時(shí)未見(jiàn)賴(lài)氨酸上非選擇性標(biāo)記峰出現(xiàn),標(biāo)記選擇性仍可達(dá)到100%。但20 min后,隨著反應(yīng)時(shí)間的增長(zhǎng),在質(zhì)荷比2 557處出現(xiàn)強(qiáng)度越來(lái)越強(qiáng)的非選擇性賴(lài)氨酸二甲基化標(biāo)記肽段峰。說(shuō)明該反應(yīng)條件對(duì)不同肽段的標(biāo)記無(wú)明顯差異性。為了同時(shí)確保標(biāo)記效率及選擇性,最終確定酸性條件下NaBD3CN體系的標(biāo)記條件為:160 μL 1.5%(v/v) CH3COOH重水溶液中加入20 μL甲醛及其同位素試劑和20 μL NaBD3CN,配制成標(biāo)記反應(yīng)液,pIDL-StageTip裝置固相標(biāo)記10 min。

2.3　酸性條件下NaBH3CN體系標(biāo)記選擇性的優(yōu)化

將酸性條件下NaBD3CN體系優(yōu)化的反應(yīng)條件應(yīng)用于NaBH3CN體系中,發(fā)現(xiàn)C末端的賴(lài)氨酸標(biāo)記現(xiàn)象明顯。以肽段RPCFSALTPDETYVPK為例(見(jiàn)圖5),利用13CH2O與NaBH3CN進(jìn)行標(biāo)記,N末端增加30 Da,肽段N端標(biāo)記處(m/z1 911)峰強(qiáng)度最強(qiáng),原始肽段處(m/z1 881)峰消失,但也出現(xiàn)了賴(lài)氨酸上非選擇性標(biāo)記峰(m/z1 941)。相較于酸性條件下的NaBD3CN體系,標(biāo)記選擇性較差,故需進(jìn)一步優(yōu)化該體系的反應(yīng)條件。

圖 5　相同酸性條件下NaBD3CN與NaBH3CN標(biāo)記選擇性的差異Fig. 5　Differences of labeling selectivity between NaBD3CN and NaBH3CN under the same acidic condition

考慮到控制與NaBD3CN體系相同的標(biāo)記時(shí)間有助于多種標(biāo)記試劑的同時(shí)標(biāo)記操作,故嘗試通過(guò)降低標(biāo)記試劑濃度以提高標(biāo)記選擇性。選擇總體積200 μL的反應(yīng)液中含1、5或10 μL 4%(v/v) CH2O和0.6 mol/L NaBH3CN的標(biāo)記試劑進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。同樣選擇肽段RPCFSALTPDETYVPK為考察對(duì)象,如圖6所示,加入1 μL標(biāo)記試劑后,原始肽段(m/z1 881)仍有很多未標(biāo)記；加入5 μL標(biāo)記試劑后標(biāo)記效率明顯增高；加入10 μL標(biāo)記試劑后原始肽段峰消失,標(biāo)記效率達(dá)100%,實(shí)現(xiàn)了肽段的完全標(biāo)記。3個(gè)標(biāo)記濃度產(chǎn)生的賴(lài)氨酸非選擇性標(biāo)記(m/z1 937)均不明顯,加入10 μL標(biāo)記試劑后,標(biāo)記選擇性達(dá)95%。因此,確定酸性條件下NaBH3CN體系的標(biāo)記條件為:180 μL 1.5%(v/v) CH3COOH水溶液中加入10 μL 4%(v/v)甲醛及其同位素試劑和10 μL 0.6 mol/L NaBH3CN,配制成標(biāo)記反應(yīng)液,pIDL-StageTip裝置固相標(biāo)記10 min。

圖 6　NaBH3CN體系不同標(biāo)記試劑濃度對(duì)肽段RPCFSALT-PDETYVPK標(biāo)記效率及選擇性的影響Fig. 6　Effect of different reagent concentrations with NaBH3CN on labeling efficiency and selectivity of peptide RPCFSALTPDETYVPK

圖 7　pIDL-StageTip裝置對(duì)肽段RPCFSALTPDETYVPK的標(biāo)記效果Fig. 7　Labeling performance of peptide RPCFSALT-PDETYVPK using pIDL-StageTip

2.4　裝置標(biāo)記效果評(píng)價(jià)

使用優(yōu)化后的條件,依次進(jìn)行酸性條件、堿性條件下的標(biāo)記即可完成肽段兩端的兩步標(biāo)記。選擇13CD2O和NaBD3CN在酸性條件下標(biāo)記肽段N端(36N),選擇CD2O和NaBH3CN在堿性條件下標(biāo)記肽段C端(32KH),考察整個(gè)裝置兩步標(biāo)記后的標(biāo)記效果。36N-32KH標(biāo)記后肽段共增加68 Da。如圖7所示,原始肽段RPCFSALTPDETYVPK上樣后,樣品溶液中無(wú)肽段峰,說(shuō)明上樣完全,無(wú)樣品損失。標(biāo)記后,m/z1 881處峰消失,m/z1 949處出現(xiàn)肽段峰,說(shuō)明標(biāo)記效率高,整套裝置可完成肽段兩端的兩步標(biāo)記。

2.5　對(duì)復(fù)雜體系的標(biāo)記及定量效果

蛋白質(zhì)組研究對(duì)象常為由眾多蛋白質(zhì)組成的復(fù)雜混合體系,為了滿足蛋白質(zhì)組的研究需求,評(píng)價(jià)裝置的普適性,進(jìn)一步利用人NK/T細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞株YTS酶解產(chǎn)物考察本裝置在復(fù)雜蛋白質(zhì)組體系下的標(biāo)記及定量效果。

對(duì)于酸性條件下的NaBH3CN體系,選擇13CH2O和NaBH3CN在酸性條件下標(biāo)記肽段N端(30NL), CD2O和NaBD3CN在堿性條件下標(biāo)記肽段C端(34KH),該種標(biāo)記簡(jiǎn)寫(xiě)為30NL-34KH。對(duì)于酸性條件下NaBD3CN的體系,選擇CH2O和NaBD3CN在酸性條件下標(biāo)記肽段N端(30NH),13CD2O和NaBH3CN在堿性條件下標(biāo)記肽段C端(34KL),該種標(biāo)記簡(jiǎn)寫(xiě)為30NH-34KL。接著對(duì)樣品進(jìn)行LC-MS分析,鑒定時(shí)將肽段N端、C端的修飾及相應(yīng)的非選擇性修飾都設(shè)置為可變修飾。通過(guò)計(jì)算鑒定到的各種修飾肽段的譜圖數(shù),確定其標(biāo)記效率及選擇性。結(jié)果表明,30NL-34KH的標(biāo)記效率為99.96%±0.06%,標(biāo)記選擇性為100%±0.00%。30NH-34KL的標(biāo)記效率為99.92%±0.02%,標(biāo)記選擇性為100%±0.01%。說(shuō)明該裝置對(duì)復(fù)雜蛋白質(zhì)組樣品標(biāo)記仍具有很高的標(biāo)記效率及選擇性,對(duì)于大規(guī)模蛋白質(zhì)樣品標(biāo)記具有廣泛的應(yīng)用前景。

圖 8　質(zhì)量比1∶1和 1∶10混合的人源復(fù)雜酶解產(chǎn)物定量比值箱線圖Fig. 8　Box plots for complex human digests at the mixing mass ratios of 1∶1 and 1∶10

將上述兩種標(biāo)記產(chǎn)物分別按照重標(biāo)與輕標(biāo)1∶1和1∶10(w/w)混合,考察基于該裝置定量方法的準(zhǔn)確度及精密度。蛋白質(zhì)的定量比值的箱線圖如圖8所示,每種混合比例分別進(jìn)行3次質(zhì)譜重復(fù)測(cè)試,取定量到2次及2次以上的蛋白質(zhì)進(jìn)行分析。1∶1及1∶10混合的樣品定量比值的中值分別為0.94及0.08,相應(yīng)的相對(duì)誤差為6.0%及20%。定量比值的分布很窄,取其以2為底的對(duì)數(shù)后SD值分別為0.19及0.19。對(duì)每個(gè)樣品質(zhì)譜重復(fù)3次,3次技術(shù)重復(fù)定量比值的RSD值的中值分別為5.92%及9.43%。上述結(jié)果證明,利用該裝置標(biāo)記樣品不會(huì)引入由標(biāo)記效率、洗脫效率等方面造成的誤差,具有很高的定量準(zhǔn)確度及精密度,有利于蛋白質(zhì)組學(xué)的準(zhǔn)確定量。

3　結(jié)論

本文發(fā)展了一種基于pIDL標(biāo)記策略的高通量肽段末端選擇性交叉標(biāo)記裝置,該裝置可以保證固相標(biāo)記反應(yīng)時(shí)間的可控性、大量樣品兩步標(biāo)記的簡(jiǎn)便性。實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了酸性條件下NaBD3CN與NaBH3CN體系的標(biāo)記反應(yīng)條件,實(shí)現(xiàn)了對(duì)標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)及人源蛋白質(zhì)組復(fù)雜體系酶解產(chǎn)物高標(biāo)記效率、高選擇性的二甲基化標(biāo)記,有利于蛋白質(zhì)組的高準(zhǔn)確度、高精密度定量分析。整套標(biāo)記可以在2 h內(nèi)完成。該特點(diǎn)將利于細(xì)胞、組織、血液、尿液等蛋白質(zhì)組樣品的多變量分析,實(shí)現(xiàn)高可操作性、高準(zhǔn)確度、高通量的蛋白質(zhì)組定量標(biāo)記。

參考文獻(xiàn):

[1]Aebersold R, Mann M. Nature, 2016, 537(7620): 347

[2]Larance M, Lamond A I. Nat Rev Mol Cell Biol, 2015, 16(5): 269

[3]Surinova S, Choi M, Tao S, et al. EMBO Mol Med, 2015, 7(9): 1166

[4]Humphrey S J, Azimifar S B, Mann M. Nat Biotechnol, 2015, 33(9): 990

[5]Zhou Y, Shan Y, Wu Q, et al. Anal Chem, 2013, 85(22): 10658

[6]Bamberger C, Pankow S, Park S K, et al. J Proteome Res, 2014, 13(3): 1494

[7]Fang H, Xiao K, Li Y, et al. Anal Chem, 2016, 88(14): 7198

[8]Qin H, Wang F, Zhang Y, et al. Chem Commun, 2012, 48(50): 6265

[9]Koehler C J, Arntzen M O, de Souza G A, et al. Anal Chem, 2013, 85(4): 2478

[10]Rappsilber J, Ishihama Y, Mann M. Anal Chem, 2003, 75(3): 663

[11]Rappsilber J, Mann M, Ishihama Y. Nat Protoc, 2007, 2(8): 1896

[12]Geyer Philipp E, Kulak Nils A, Pichler G, et al. Cell Syst, 2016, 2(3): 185