蔡奧捷 薛淑文 孔祥東

單基因遺傳?。╩onogenic disease）指由單個或單對等位基因突變導(dǎo)致的疾病，一般遵循孟德爾遺傳規(guī)律。目前，人類已知的單基因病已經(jīng)超過10 000種，盡管單個病種的發(fā)病率很低，通常被稱為罕見病，但是因種類多，在人群中仍有著大約1/100的總體發(fā)病率［1］，因此罕見病其實并不罕見。很長一段時間里，受技術(shù)所限，單基因病既不能防，也不能治。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，越來越多的單基因病可以預(yù)防，有的也可以治療，甚至基因治療。而基因診斷或稱分子診斷成為單基因遺傳病防治的主要前提手段之一。

分子診斷是當(dāng)代醫(yī)學(xué)發(fā)展的重要前沿領(lǐng)域之一，其核心技術(shù)是基因診斷。最早的分子診斷技術(shù)是Southern［2］于1975年發(fā)明的DNA印跡技術(shù)。1976年，美籍華裔科學(xué)家簡悅威成功應(yīng)用液相DNA分子雜交技術(shù)實現(xiàn)了鐮形細(xì)胞貧血癥的基因診斷［3］，是人類遺傳病診斷開始進入分子診斷時代的重要里程碑。隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展，適用于單基因遺傳病的臨床分子診斷技術(shù)得到迅速發(fā)展。本文回顧了傳統(tǒng)的單基因遺傳病基因診斷方法和以高通量測序為代表的分子診斷方法的研究進展，以期為臨床遺傳病診斷工作提供一些有益的參考。

1 單基因遺傳病分子診斷的應(yīng)用

目前分子診斷在單基因遺傳病臨床工作中的主要應(yīng)用包括6個方面：①臨床確診診斷，通過分子診斷鑒定或鑒別單基因病已成為臨床常規(guī)工作，最常見的是小兒內(nèi)科、神經(jīng)內(nèi)科、內(nèi)分泌科、腎病科等，分子診斷在一定程度上已經(jīng)可以取代常規(guī)的診斷，例如脊肌萎縮癥（spinal muscular atro?phy，SMA）的基因診斷，杜氏肌營養(yǎng)不良癥（Duch?enne muscular dystrophy，DMD）的基因診斷都已經(jīng)成為了一線診斷。②癥狀前遺傳學(xué)診斷，某些遺傳代謝病或遲發(fā)性遺傳病如果早發(fā)現(xiàn)、早治療，對于避免致病、致殘十分重要。例如肝豆?fàn)詈俗冃裕╤epatolenticular degeneration，HLD）家庭，患者如果早期發(fā)現(xiàn)并及時進行驅(qū)銅治療則可以避免發(fā)病，而通過分子診斷可以實現(xiàn)早期診斷，有助治療。③新生兒遺傳代謝病篩查，大多數(shù)新生兒疾病為單基因遺傳病，但這些嚴(yán)重遺傳病的表型大多相似，難以通過常規(guī)方法鑒定或鑒別，通過新生兒遺傳代謝病或先天性免疫缺陷癥的分子診斷，可以及時診斷遺傳病，讓醫(yī)生和家屬少走彎路，并且可對下次妊娠提供科學(xué)咨詢。④產(chǎn)前診斷，通過孕早、中期的胎兒絨毛、胎兒羊水的DNA的分子診斷，可以明確胎兒是否為遺傳病患者。⑤胚胎植入前遺傳學(xué)診斷，單基因遺傳病家系在孕婦進行胚胎植入前，對胚胎進行分子診斷來選擇健康的胚胎進行植入，可避免孕中期產(chǎn)前診斷時如確診為患胎時所帶來的治療性流產(chǎn)的痛苦選擇。⑥孕前或群體單基因遺傳病篩查，隱性遺傳病具有生育突發(fā)性、隱蔽性的風(fēng)險，孕前進行夫婦雙方的隱性遺傳病攜帶者篩查，可使隱性遺傳病攜帶者夫婦避免生育隱性遺傳病患兒。

2 常規(guī)單基因遺傳病分子診斷技術(shù)

2.1 Southern印跡技術(shù)（Southern blot）

Southern于1975年發(fā)明了DNA印跡技術(shù)。Southern blot是最為經(jīng)典的DNA分子檢測方法，曾廣泛運用于各種基因突變的檢測，包括缺失、插入、易位等，因步驟繁瑣、電離輻射等缺點逐步退出了主流的檢測領(lǐng)域，但其對面肩肱肌營養(yǎng)不良的基因診斷尚不能被替代［4］，除此之外，近年來很少見到有其他單基因遺傳病應(yīng)用Southern印跡技術(shù)進行診斷的報道。

2.2 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）

PCR技術(shù)由美國PE Cetus公司的Kary Mullis在1985年建立［5］，已經(jīng)成為核酸分子擴增檢測最常用的方法。在單基因遺傳病分子診斷中，有些基因突變?nèi)绱笃稳笔Э芍苯硬捎肞CR技術(shù)進行檢測，例如DMD基因大片段缺失的男性患者可直接經(jīng)PCR擴增后采用瓊脂糖電泳檢測技術(shù)進行DMD的分子診斷［6］。目前PCR技術(shù)主要作為常規(guī)基因診斷的前期必要步驟，如多重連接探針擴增技術(shù)（multiplex ligation?dependent probe am?plification，MLPA）、Sanger測序、芯片雜交等的基礎(chǔ)步驟，因此PCR是許多分子診斷技術(shù)的基礎(chǔ)方法，目前是分子診斷實驗室的主流技術(shù)之一。

2.3 多重連接探針擴增技術(shù)（MLPA）

MLPA技術(shù)于 2002年由Schouten等［7］首先報道，是一種能夠在同一反應(yīng)管內(nèi)檢測多達(dá)50個核苷酸序列的拷貝數(shù)變化的方法。其具有特異性高、精確度高、重復(fù)性好、操作簡便、高通量等優(yōu)點。MLPA技術(shù)可檢測出若干人類基因拷貝數(shù)的變異，也可檢出已知點突變，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于存在基因缺失/重復(fù)突變、點突變的人類遺傳疾病的分子診斷，如DMD/BMD、SMA、迪格奧爾格綜合征（Di George's syndrome）等［8?10］。但 MLPA 對 DNA濃度和純度要求高，只能檢測基因或染色體數(shù)目的異?；蛞阎c突變，不能篩查未知點突變和平衡易位等，另外MLPA技術(shù)的開展必須要求毛細(xì)管電泳設(shè)備。

2.4 聚合酶鏈反應(yīng)?限制性片段長度多態(tài)性技術(shù)（polymerase chain reaction?restriction fragment length polymorphism，PCR?RFLP）

PCR?RFLP技術(shù)主要是針對PCR產(chǎn)物，選擇特異的限制性內(nèi)切酶進行酶切，然后采用瓊脂糖電泳或聚丙烯凝膠電泳技術(shù)分離酶切片段，目前臨床上主要用于具有突變熱點的基因檢測，如SMA致病基因SMN基因的突變熱點Exon7缺失的檢測，F(xiàn)GFR3基因突變熱點cll38A＞G位點的突變檢測等［11?12］。

2.5 三引物 PCR（triplet repeat primed PCR，TP?PCR）

TP?PCR是采用一對引物和一條隨機結(jié)合的中間引物共3條引物進行PCR擴增的方法。此方法常用于動態(tài)突變遺傳病三核苷酸拷貝數(shù)變異的檢測，TP?PCR產(chǎn)物經(jīng)毛細(xì)管電泳檢測形成范圍超過一定堿基數(shù)（例如50 CTG×3）的連續(xù)毛刺狀峰，提示為患者。TP?PCR反應(yīng)需要設(shè)計合理的中間引物，要注意保證引物的濃度比例以及采用高特異的DNA聚合酶。目前臨床上使用較多的是脆性X染色體綜合征致病基因FMR1基因動態(tài)突變及強直性肌營養(yǎng)不良致病基因DM1基因的動態(tài)突變的檢測［13?14］。

2.6 巢式PCR擴增技術(shù)

LR?PCR是指擴增長度大于5 kb片段的PCR。LR?PCR反應(yīng)需要選用高保真的DNA聚合酶，這類酶除了具有高保真性，同時具有優(yōu)良的延伸性和高效的擴增效率。巢式PCR是以前次PCR產(chǎn)物為模板，設(shè)計引物擴增多個或單個小的PCR片斷。對于存在高度同源序列的基因（如PKD1、GBA、SMN1、CYP21A2基因）的序列突變分析，為了避免同源序列（假基因）的干擾，通常利用基于LR?PCR的巢式PCR擴增技術(shù)。首先，比對目標(biāo)基因與同源序列，尋找差異性位點，設(shè)計長片段特異性引物，確保LR?PCR擴增的特異性；其次，以LR?PCR產(chǎn)物為模板，以內(nèi)部巢氏PCR引物，采用常規(guī)PCR擴增目標(biāo)基因特定目標(biāo)區(qū)域。

2.7 倒位PCR技術(shù)（inversion?PCR，I?PCR）

I?PCR是針對血友病A（hemophilia A，HA）的一種檢測技術(shù)，HA是一種X連鎖隱性遺傳病，由F8基因突變導(dǎo)致。F8基因的Inv22和Inv1分別占重型 HA 的 40%～50%和 2%～3%［15］，對 Inv22和Inv1的檢測手段包括Southern blot、長片段PCR（long distance PCR，LD?PCR）和 I?PCR。目前對intron 22重組檢測的常用方法主要為LD?PCR和I?PCR 2種。LD?PCR 片段大于 10 kb，不能確定intron 22重組的亞型，并且擴增片段GC含量較高，對DNA質(zhì)量和試劑要求較高，成功率較低。I?PCR包括酶切、環(huán)化和引物擴增等3個步驟。I?PCR有產(chǎn)物片段大小特定、片段比較小、GC含量較低等優(yōu)點，因此能快速檢測Inv22?I、Dup22和Del22的患者、攜帶者和正常人。

2.8 DNA芯片技術(shù)

DNA芯片原理是在固定支持物上合成大量寡核苷酸作為DNA探針與待測的核酸片段雜交，對雜交后的信息進行分析，從而得到靶片段的基因序列、表達(dá)情況等信息。該技術(shù)檢測信息高通量，自動化程度高，一次可檢測眾多突變位點，可用于疾病臨床早期診斷和批量篩選、基因表達(dá)譜測定、多態(tài)性分析等，但由于芯片技術(shù)只能檢測已知突變位點，隨著高通量測序技術(shù)的快速進展，DNA芯片在單基因遺傳病基因診斷中的應(yīng)用受到了一定限制，在國內(nèi)DNA芯片的單基因病診斷應(yīng)用主要為耳聾DNA芯片的檢測。

3 以高通量測序為中心的單基因病分子診斷策略

3.1 Panel靶向測序

以Panel為基礎(chǔ)的靶向高通量測序可分為單個基因靶向捕獲高通量測序和多個基因靶向捕獲高通量測序。單個基因靶向Panel高通量測序的設(shè)計理論基礎(chǔ)是針對片段較長的基因，如DMD基因、結(jié)節(jié)性硬化（tuberous sclerosis complex，TSC）TSC1/2基因等的檢測采用特異基因Panel檢測效率遠(yuǎn)優(yōu)于Sanger測序，另外一種多基因靶向捕獲Panel高通量測序是針對于遺傳異質(zhì)性較強的疾病，如癲癇、痙攣性截癱、遺傳性肌病、非綜合征型遺傳性耳聾等疾病，對于給定樣本中的多個致病基因同時進行測序分析，具有快速高效的特點，但也存在一定局限性，如隨著新的致病基因的不斷發(fā)現(xiàn)，需要對多個基因靶向捕獲高通量測序panel進行不斷的更新，但更新速度一般落后于新致病基因被發(fā)現(xiàn)的速度，使得panel存在一定的滯后性。

3.2 全外顯子組測序（whole exome sequencing，WES）

WES就是利用雜交捕獲技術(shù)獲取、富集基因組中所有具有蛋白編碼功能的外顯子區(qū)域DNA序列，并對后者進行高通量測序的分析方法。人類的全基因組中有多達(dá)180 000個外顯子，占整個基因組的1%左右［16］，通過高通量測序技術(shù)進行外顯子組測序，是發(fā)現(xiàn)或鑒定引起疾病的遺傳變異的有效途徑。

2009年，Ng等［16］在世界上首次證實外顯子組測序在確定罕見致病基因方面具有可行性和應(yīng)用價值，并于2010年首次成功地利用WES技術(shù)鑒定了米勒綜合征（Miller syndrome）的致病基因DHODH［17］。全外顯子組測序技術(shù)所需樣本數(shù)量少、通量高、耗費低，大大推進了人類單基因遺傳病的分子診斷。

外顯子組測序能夠更快地確定致病基因及突變位點［18］，有助于加速篩選發(fā)現(xiàn)單基因疾病、癌癥等復(fù)雜疾病的致病基因和易感基因等。但是外顯子組測序只能捕獲集中于外顯子區(qū)域的測序，不能獲得完整的基因組信息且不適用于DNA結(jié)構(gòu)變異和高度同源區(qū)變異體的檢測。

3.3 全基因組測序（whole genome sequencing，WGS）

WGS是對已知標(biāo)準(zhǔn)基因組序列的個體進行全基因組的重測序。WES（外顯子組測序）對于外顯子以外的區(qū)域不能有效地進行基因檢測，通過 WGS 可進行全基因組檢測［18?20］。因為人類基因組過于龐大，一次單端全基因組測序很難達(dá)到所需要的測序深度，需要重復(fù)測序或雙端測序。因此，WGS成本昂貴且由于不能達(dá)到足夠的測序深度，結(jié)果準(zhǔn)確性會降低，目前難以大規(guī)模應(yīng)用于臨床。

3.4 高通量測序用于單基因遺傳病的局限性

雖然高通量測序有高通量和相對低成本的特點，但對于單基因病基因診斷仍有其局限性，首先是高通量測序的結(jié)果必須經(jīng)過Sanger測序驗證，通常高通量測序的結(jié)果不能直接用于診斷；其次高通量測序不能解決一些特殊的單基因病基因突變的檢測，包括基因的倒位突變，如血友病A基因有長片段倒位存在，如SMA、腎上腺皮質(zhì)發(fā)育不良、成人型多囊腎等存在假基因的疾病的基因診斷，通過高通量測序往往不能得到滿意結(jié)果；再次，由于受種族差異、數(shù)據(jù)庫及基因突變功能驗證等的影響，大量的高通量測序結(jié)果不能得到很好的解讀，也制約了高通量測序在單基因遺傳病分子診斷中的應(yīng)用。

4 以高通量測序為基礎(chǔ)的無創(chuàng)產(chǎn)前分子診斷（non?invasive prenatal diagnosis，NIPD）

4.1 胎兒游離核酸無創(chuàng)單基因病產(chǎn)前診斷

利用無創(chuàng)產(chǎn)前檢測診斷胎兒單基因病的基本原理是在母體血漿總游離DNA（cell?free DNA，cfDNA）中通過檢測出胎兒是否攜帶來自父母的致病基因或致病基因突變。對于常染色體顯性遺傳病，通過檢測孕婦本人的血漿游離DNA是否攜帶致病位點（父源突變、新發(fā)突變）來判斷胎兒是否發(fā)病，目前應(yīng)用最多的是檢測軟骨發(fā)育不全（achondroplasia）［21］。對于常染色體隱性遺傳病，若父母同時攜帶不同的雜合突變（先證者為復(fù)合雜合突變），如果在孕婦外周血中檢測到父源突變，那么胎兒有50%的發(fā)病風(fēng)險，應(yīng)進一步行侵入性產(chǎn)前診斷明確胎兒是否患?。蝗缥礄z出父源突變，那么胎兒最多為攜帶者，孕婦無需接受侵入性產(chǎn)前診斷，避免了50%的孕產(chǎn)婦進行有創(chuàng)性產(chǎn)前診斷，從而減少了不良妊娠結(jié)局的發(fā)生［22］。若父母攜帶相同致病雜合突變，則需要通過大規(guī)模平行測序或數(shù)字PCR技術(shù)等精確定量胎兒游離DNA（cell?free fetal DNA，cffDNA）濃度，以此來分辨出突變來自父源或母源［23］。目前利用無創(chuàng)產(chǎn)前檢測可能診斷的單基因病包括軟骨發(fā)育不全、先天性腎上腺皮質(zhì)增生（congenital adrenalhyperpla?sia，CAH）、DMD、楓糖尿?。╩aple syrup urine dis?ease）、β 地中海貧血（β?mediterranean anemia）和SMA 等［21，24?28］。目前最新的進展是通過無創(chuàng)產(chǎn)前DNA檢測解決新發(fā)突變（de novomutation），未來可以通過NIPD進行胎兒的群體篩查，包括遺傳性（inheredited）的突變和新發(fā)突變都可以通過該方法進行產(chǎn)前篩查。

4.2 循環(huán)胎兒細(xì)胞無創(chuàng)單基因病產(chǎn)前診斷

在孕早期的母血中存在微量的胎兒有核紅細(xì)胞（nucleated red blood cell，NRBC），因其單核、含有完整胎兒遺傳信息且細(xì)胞周期短，更適合全基因組分析，被認(rèn)為是實施NIPD較理想的靶點。但母血中的胎兒細(xì)胞非常少，限制了其應(yīng)用的發(fā)展。目前臨床上研究多針對改進細(xì)胞的分離方法，有研究成功利用基于紅細(xì)胞微流控技術(shù)的富集和負(fù)向富集的兩級富集法分離出循環(huán)胎兒細(xì)胞并完成性別鑒定［29］。循環(huán)胎兒細(xì)胞在無創(chuàng)產(chǎn)前檢測領(lǐng)域具有巨大的潛能，相信隨著技術(shù)進一步的發(fā)展，利用循環(huán)胎兒細(xì)胞進行單基因病的NIPD或?qū)⒊蔀樾碌难芯繜狳c。

4.3 子宮頸滋養(yǎng)層細(xì)胞無創(chuàng)單基因病產(chǎn)前診斷

孕婦宮頸粘液中也存在胎兒脫落的絨毛細(xì)胞，且數(shù)量不受胎齡、孕婦體重以及孕婦年齡的影響［30］，該發(fā)現(xiàn)為無創(chuàng)單基因病診斷提供了新的思路。有研究成功利用從宮頸脫落細(xì)胞中分離的胎兒細(xì)胞診斷地中海貧血和/或HbS突變［31］。該技術(shù)有著良好的應(yīng)用前景，但標(biāo)本母體細(xì)胞污染的問題可造成較高的假陽性率，是目前面臨的主要挑戰(zhàn)。

5 小結(jié)與展望

分子診斷已經(jīng)深入到單基因遺傳病診斷、產(chǎn)前診斷、新生兒篩查中。以PCR、Southern雜交為主的一些經(jīng)典分子診斷技術(shù)將會保留。但越來越先進和精確的分子診斷技術(shù)將會不斷建立和發(fā)展，特別是隨著高通量測序的快速發(fā)展，以高通量測序，包括第三代測序為基礎(chǔ)的單基因遺傳病的分子診斷方法將得到更廣泛的應(yīng)用。除此之外，越來越先進的分子診斷技術(shù)的建立和發(fā)展也對相關(guān)研究人員和臨床醫(yī)師的使用、解讀和咨詢提出了更高的要求。

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