董燕，李月英，張心馳，楊小明，厲琳杰，馬文斌

（江蘇大學(xué)1.醫(yī)學(xué)院，2.食品與生物工程學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江212013）

非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）占所有肺癌80%～85%［1］。目前，基于鉑類藥物的聯(lián)合化療方案是NSCLC標(biāo)準(zhǔn)的藥物治療方案之一，但其毒副作用大且易產(chǎn)生耐藥性，是治療失敗的重要原因［2］。研究表明，中藥因其毒副作用小，效價(jià)高，在臨床腫瘤輔助治療中發(fā)揮重要作用［3］。

核轉(zhuǎn)錄因子E2相關(guān)因子2（nuclear factor-erythroid 2 related factor 2，Nrf2）是一種抗氧化應(yīng)激的核轉(zhuǎn)錄因子［4］，其激活后自Keap1蛋白解離進(jìn)入胞核與抗氧化反應(yīng)元件（ARE）結(jié)合，啟動(dòng)下游靶基因多藥耐藥相關(guān)蛋白1（multidrug resistance associated protein 1，Mrp1）等表達(dá)，參與細(xì)胞耐藥性的調(diào)控［5－6］。Nrf2-ARE信號(hào)通路在癌癥中呈高表達(dá)，促進(jìn)癌癥的發(fā)生發(fā)展，是誘發(fā)多種癌細(xì)胞耐藥產(chǎn)生的重要因素［7］。在肺癌和乳腺癌中，下調(diào)Nrf2可顯著增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性［8］。因此，亟待尋找一種抑制Nrf2／Keap1信號(hào)通路的新型物質(zhì)，來輔助治療化療耐藥的肺癌。

銀杏作為中國傳統(tǒng)藥物，已有上千年的治療歷史［9］。銀杏酚C17 1是銀杏外種皮提取物烷基酚類化合物中的銀杏酚單體之一，具有細(xì)胞毒性，但低劑量時(shí)細(xì)胞毒性較弱［10］。有研究揭示，與銀杏酚其他單體比較，銀杏酚C17 1抗腫瘤活性最高，可抑制肝癌HepG2細(xì)胞增殖、遷移和侵襲［11］。本課題組前期研究結(jié)果表明［12］，銀杏酚C17 1與順鉑聯(lián)用可促進(jìn)肝癌細(xì)胞的凋亡，但其能否作為順鉑的輔助藥物增強(qiáng)化療敏感性尚不清楚。因此，本研究將銀杏酚C17 1與順鉑聯(lián)合作用，觀察A549／DDP耐藥細(xì)胞中Nrf2／Keap1信號(hào)通路及下游蛋白Mrp1表達(dá)的情況，探討銀杏酚C17 1與順鉑聯(lián)用對(duì)A549／DDP耐藥細(xì)胞的作用機(jī)制。

1　材料與方法

1.1　材料

人肺腺癌A549、A549／DDP細(xì)胞株購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院。純度98%銀杏酚C17 1（江蘇大學(xué)食品學(xué)院）；RPMI 1640（Wisent公司）；胎牛血清（Gibco公司）；順鉑、MTT試劑（Sigma公司）；Transwell小室（Corning公司）；流式細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒Annexin V-FITC／PI（美國BD公司）；二甲基亞砜（Sigma公司）；Mrp1、Keap1、Bcl2、Bax、β-肌動(dòng)蛋白及組蛋白H3抗體（Cell Signaling Technology公司）；Nrf2蛋白抗體（Abcam公司）；HRP標(biāo)記的兔二抗、鼠二抗（碧云天生物技術(shù)公司）；PVDF膜、ECL-plus發(fā)光劑（美國Millipore公司）。

1.2　方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) A549、A549／DDP細(xì)胞株培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中，并置于37℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中孵育；在A549／DDP細(xì)胞培養(yǎng)基中加入1 mg／mL順鉑維持 A549／DDP細(xì)胞的耐藥性。細(xì)胞生長(zhǎng)密度達(dá)90%時(shí)用胰酶消化傳代；取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性 收集 A549、A549／DDP細(xì)胞用RPMI 1640培養(yǎng)液稀釋成1×105／mL，接種于96孔板，每孔100μL，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育12 h。根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪M(jìn)行分組，在檢測(cè)順鉑對(duì)細(xì)胞活性的影響時(shí)，分為對(duì)照組（順鉑0 mg／L）和實(shí)驗(yàn)組（順鉑 1，2，4，8，16 mg／L），分別作用于A549／DDP細(xì)胞24 h；在檢測(cè)銀杏酚與順鉑聯(lián)用對(duì)耐藥細(xì)胞活性的影響時(shí)，分為對(duì)照組［順鉑（0 mg／L）＋銀杏酚（0 mg／L）］和實(shí)驗(yàn)組［不同濃度順鉑（1、2、4、8、16 mg／L）分別與不同濃度銀杏酚 C17 1（10、20、40mg／L）］，共同作用于A549／DDP細(xì)胞24 h；每孔加入10μLMTT溶液（5mg／mL），避光培養(yǎng)4 h；棄培養(yǎng)液，每孔加入100μL二甲基亞砜，徹底混合。使用酶標(biāo)儀（美國Bio-Rad公司）在490 nm波長(zhǎng)處測(cè)量光密度值（D）。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。細(xì)胞相對(duì)存活率＝（實(shí)驗(yàn)組D均值－空白對(duì)照組D均值）／（實(shí)驗(yàn)對(duì)照組D均值－空白對(duì)照組D均值）。

1.2.3Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè) A549／DDP細(xì)胞遷移和侵襲能力

1.2.3.1細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期 A549／DDP細(xì)胞，胰酶消化，用無血清RPMI 1640培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為2×105／mL。用無血清RPMI 1640培養(yǎng)基配置藥物，在下室（24孔板底部）加入500μL含10%血清的RPMI 1640培養(yǎng)液，上室加入300μL懸浮細(xì)胞以及相應(yīng)的藥物（0 mg／mL順鉑，4 mg／mL順鉑，4 mg／mL順鉑分別與 10、20、40 mg／L銀杏酚 C17 1聯(lián)用），于 37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h；4%低聚甲醛固定細(xì)胞30 min；吉姆薩染液染色20 min；蒸餾水清洗小室，用棉花將上室內(nèi)的染液輕輕擦干，待晾干后于高倍鏡下（×200）觀察細(xì)胞，隨機(jī)選取10個(gè)視野計(jì)數(shù)（遷移細(xì)胞數(shù)）。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，計(jì)算細(xì)胞遷移率＝實(shí)驗(yàn)組遷移細(xì)胞數(shù)／對(duì)照組遷移細(xì)胞數(shù)。

1.2.3.2細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn) 用4℃預(yù)冷的無血清RPMI 1640培養(yǎng)基稀釋基質(zhì)膠至終濃度為1 mg／mL；取60μL加入小室上部，37℃溫育4～5 h使其干成膠狀；后續(xù)步驟同遷移實(shí)驗(yàn)。

1.2.4免疫印跡法檢測(cè)Nrf2／Keap1信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá) 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期A549／DDP細(xì)胞接種于6孔板，每孔約1×106個(gè)，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)過夜后，分別加入含 0 mg／mL，4 mg／mL順鉑，4 mg／mL順鉑分別與10、20、40 mg／L銀杏酚 C17 1聯(lián)用的培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h；加入預(yù)熱的細(xì)胞裂解液（70μL）裂解細(xì)胞，提取總蛋白；100℃煮沸5min；超聲儀破碎10 s，離心30 s；提取的蛋白儲(chǔ)存于－20℃?zhèn)溆谩?/p>

配置10%或12%聚丙烯酰胺凝膠，70 V電泳2 h；轉(zhuǎn)膜（PVDF膜）2 h；用含 5%牛奶的 TBST（80 g／L NaCl，2 g／L KCl，30 g／L Tris，0.1%Tween-20；pH＝7.4）封閉 1 h；加入一抗 Nrf2、Keap1、Mrp1、Bcl2、Bax抗體（1 1 000）及內(nèi)參β-肌動(dòng)蛋白和組蛋白H3抗體（1 1 000）4℃孵育過夜；TBST洗膜3次，每次10 min；除內(nèi)參 β-肌動(dòng)蛋白為鼠二抗（1 1 000），其他蛋白均為兔二抗（1 1 000），孵育1 h；TBST洗膜3次，每次15min；ECL發(fā)光劑曝光；Lane 1D凝膠分析軟件進(jìn)行灰度掃描，得出灰度值。蛋白相對(duì)表達(dá)量＝目的蛋白灰度值／β-肌動(dòng)蛋白灰度值，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)A549／DDP細(xì)胞，均勻接種于24孔板，每孔約3×104個(gè)，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。過夜貼壁后加藥（0 mg／mL順鉑，4 mg／mL順鉑，4mg／mL順鉑分別與 10、20、40 mg／L銀杏酚 C17 1聯(lián)用）培養(yǎng) 24 h；用0.25%無EDTA的胰酶消化細(xì)胞，蒸餾水洗3次，離心；取100μL過篩后的細(xì)胞（3×104個(gè)／mL）懸浮于流式管中，于冰上避光條件下依次加入10μL Annexin V-FITC和5μL PI，輕輕混勻；10 min后加入緩沖液400μL，設(shè)置一組單染的陽性對(duì)照，2 h內(nèi)利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.3　統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

運(yùn)用SPSS 22.0軟件分析數(shù)據(jù)，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s）表示，多組比較行單因素方差分析，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較采用Dunnett-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用Origin法計(jì)算肺腺癌細(xì)胞增殖的半數(shù)抑制濃度（50%inhibitory concentration，IC50）。

2　結(jié)果

2.1　順鉑對(duì)敏感A549細(xì)胞和耐藥細(xì)胞A549／DDP細(xì)胞活性的影響

MTT檢測(cè)結(jié)果如圖1所示，單獨(dú)順鉑作用，敏感A549細(xì)胞和耐藥A549／DDP細(xì)胞活性均不同程度地被抑制，但抑制A549／DDP細(xì)胞活性明顯需要更高濃度的順鉑；經(jīng)計(jì)算得出 A549和 A549／DDP細(xì)胞的 IC50所需的順鉑濃度分別為（7.0±0.09）mg／L和（40.0±0.13）mg／L，A549／DDP細(xì)胞對(duì)順鉑的耐藥性是A549細(xì)胞的5.8倍，表明A549／DDP是順鉑耐藥細(xì)胞株。根據(jù)MTT的結(jié)果，本研究選取4 mg／L順鉑進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1　不同濃度的順鉑對(duì)A549和A549／DDP細(xì)胞活性的影響

2.2　銀杏酚C17 1對(duì)A549／DDP耐藥細(xì)胞遷移的影響

與對(duì)照組比較，順鉑組耐藥細(xì)胞遷移率沒有顯著的變化（P＞0.05）；但與對(duì)照組及順鉑組相比，10，20，40 mg／L銀杏酚C17 1與順鉑聯(lián)用明顯抑制耐藥細(xì)胞的遷移能力（P＜0.05），且呈銀杏酚C17 1劑量依賴性。見圖2。結(jié)果表明，銀杏酚C17 1能增強(qiáng)順鉑對(duì)A549／DDP耐藥細(xì)胞遷移的抑制能力。

2.3　銀杏酚C17 1對(duì)A549／DDP耐藥細(xì)胞侵襲的影響

如圖3所示，與對(duì)照組相比，順鉑組細(xì)胞侵襲力稍有降低，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與對(duì)照組及順鉑組比較，銀杏酚與順鉑聯(lián)用時(shí)，隨著銀杏酚C17 1濃度（10，20，40 mg／L）的升高，細(xì)胞侵襲數(shù)量呈明顯下降趨勢(shì)（P＜0.05）。由此說明，銀杏酚C17 1能夠增強(qiáng)順鉑對(duì)A549／DDP耐藥細(xì)胞侵襲的抑制能力。

2.4　銀杏酚C17 1對(duì)A549／DDP細(xì)胞耐藥的逆轉(zhuǎn)作用

MTT法檢測(cè)結(jié)果如圖4所示，與對(duì)照組相比，銀杏酚 C17 1（10，20，40mg／L）與順鉑1mg／L聯(lián)用時(shí)，細(xì)胞存活率沒有明顯變化（P＞0.05）；同時(shí)，銀杏酚 C17 1（10，20 mg／L）與順鉑 2 mg／L聯(lián)合作用時(shí)，細(xì)胞活性較對(duì)照組也沒有明顯差異（P＞0.05）。其余各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞活性與對(duì)照組相比差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或 P＜0.01）。結(jié)果表明，銀杏酚C17 1劑量上調(diào)增強(qiáng)順鉑的細(xì)胞毒性，逆轉(zhuǎn)耐藥細(xì)胞對(duì)順鉑的耐藥性。

圖2　不同劑量銀杏酚C17 1與順鉑聯(lián)用對(duì)A549／DDP耐藥細(xì)胞遷移的影響（×200）

2.5　銀杏酚C17 1對(duì)A549／DDP耐藥細(xì)胞Nrf2／Keap1信號(hào)通路的影響

如圖5所示，與對(duì)照組和順鉑組相比，順鉑與不同濃度銀杏酚 C17 1（10，20，40 mg／L）聯(lián)合應(yīng)用組總Nrf2與核內(nèi)Nrf2表達(dá)明顯降低（P＜0.05或P＜0.01），其結(jié)合蛋白 Keap1表達(dá)明顯增加（P＜0.05或P＜0.01）。

圖3　不同劑量銀杏酚C17 1與順鉑聯(lián)用對(duì)A549／DDP耐藥細(xì)胞侵襲的影響（×200）

圖4　不同劑量銀杏酚C17 1與順鉑聯(lián)用對(duì)A549／DDP耐藥細(xì)胞活性的影響

圖5　不同劑量銀杏酚C17 1與順鉑聯(lián)用對(duì)A549／DDP耐藥細(xì)胞Nrf2／Keap1信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

同時(shí)下游Mrp1蛋白表達(dá)也明顯降低（P＜0.05）。由此表明，銀杏酚 C17 1可能通過抑制Nrf2／Keap1信號(hào)通路逆轉(zhuǎn) A549／DDP細(xì)胞的耐藥性。

2.6　銀杏酚C17 1對(duì)A549／DDP耐藥細(xì)胞凋亡蛋白表達(dá)的影響

如圖6所示，與對(duì)照組及順鉑組相比，隨著銀杏酚C17 1濃度的增加，促凋亡蛋白Bax的表達(dá)逐漸增強(qiáng)（P＜0.05），而抗凋亡蛋白Bcl2表達(dá)逐漸被抑制（P＜0.05）。Bcl2／Bax比值呈現(xiàn)明顯下降趨勢(shì)（P＜0.05），故可初步推斷銀杏酚C17 1與順鉑聯(lián)用能夠促進(jìn)耐藥細(xì)胞A549／DDP的凋亡。

圖6　不同劑量銀杏酚C17 1與順鉑聯(lián)用對(duì)A549／DDP耐藥細(xì)胞凋亡蛋白的影響

2.7　銀杏酚C17 1對(duì)A549／DDP耐藥細(xì)胞凋亡的影響

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，對(duì)照組自發(fā)凋亡率與順鉑組比較無明顯差異（P＞0.05），而銀杏酚C17 1（10，20，40 mg／L）與順鉑聯(lián)用后，與對(duì)照組及順鉑組相比，早期凋亡率顯著升高（P＜0.05），且呈銀杏酚濃度依賴性。見圖7。由此進(jìn)一步確定銀杏酚C17 1與順鉑聯(lián)用能促進(jìn)A549／DDP細(xì)胞凋亡。

3　討論

肺癌的病死率逐年增加，大多數(shù)患者的死亡受到不同程度耐藥的影響［13］。近來研究發(fā)現(xiàn)，基于中藥成分的抗癌藥物具有良好的安全性、穩(wěn)定性和效價(jià)高等特點(diǎn)，如銀杏提取物（Ginkgo biloba）［14］。遷移和侵襲能力是腫瘤惡性的生物學(xué)標(biāo)志［15］。本研究Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，銀杏酚C17 1與順鉑聯(lián)用，抑制肺癌耐藥細(xì)胞的遷移和侵襲能力且呈濃度依賴性；此外，銀杏酚C17 1作用后，順鉑對(duì)A549／DDP細(xì)胞的IC50顯著下降，提高了耐藥細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性。上述結(jié)果初步確定銀杏酚C17 1可增強(qiáng)肺癌耐藥細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性。

圖7　不同劑量銀杏酚C17 1與順鉑聯(lián)用對(duì)A549／DDP耐藥細(xì)胞凋亡的影響

多藥耐藥的產(chǎn)生機(jī)制繁雜，其中Mrp1和肺耐藥蛋白（Lrp）表達(dá)改變是耐藥的重要機(jī)制之一［16］。Nrf2／Keap1信號(hào)通路參與非小細(xì)胞肺癌Mrp1的表達(dá)調(diào)控，當(dāng)Keap1表達(dá)下降或被其他蛋白如P62競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合后，致Nrf2入核與ARE元件上的Mrp1基因啟動(dòng)子結(jié)合，促進(jìn)耐藥蛋白Mrp1的表達(dá)［6］。Keap1為Nrf2的負(fù)調(diào)控蛋白，在一些腫瘤如肺癌細(xì)胞中，Keap1的突變致Nrf2活性增強(qiáng)，并與標(biāo)準(zhǔn)化療耐藥及肺癌患者高死亡率相關(guān)［17］。本研究顯示，與對(duì)照組相比，單獨(dú)順鉑組肺癌耐藥細(xì)胞株中總Nrf2沒有呈高表達(dá)，但核Nrf2高表達(dá)，說明細(xì)胞內(nèi)Nrf2的分布發(fā)生了變化。胞質(zhì)Nrf2入核后，促進(jìn)下游耐藥蛋白Mrp1的高表達(dá)，進(jìn)而抑制藥物進(jìn)入細(xì)胞發(fā)揮細(xì)胞毒性作用；Keap1作為Nrf2抑制劑，其低表達(dá)不僅減少Nrf2的降解，同時(shí)增強(qiáng)Nrf2入核進(jìn)而激活Nrf2。但銀杏酚C17 1與順鉑聯(lián)合作用后，與順鉑組相比，細(xì)胞內(nèi)Keap1高表達(dá)抑制Nrf2入核，進(jìn)而核內(nèi)Nrf2減少，抑制下游耐藥蛋白Mrp1的表達(dá)，減弱其發(fā)揮藥物外排的作用。由此表明，銀杏酚C17 1可能通過抑制Nrf2／Keap1信號(hào)通路逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞對(duì)順鉑的耐藥性。

凋亡是耐藥性細(xì)胞死亡的重要機(jī)制之一，與腫瘤細(xì)胞凋亡相關(guān)的調(diào)控基因有Bcl2、Caspase和P53等家族。Bcl2家族成員Bcl2、Bax、單BH3結(jié)構(gòu)域蛋白等組成一個(gè)蛋白質(zhì)—蛋白質(zhì)相互作用的網(wǎng)絡(luò)，通過線粒體外膜的滲透來調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡［18］。Bcl2是抗凋亡基因，而Bax是促凋亡基因，Bcl2／Bax比值是細(xì)胞凋亡發(fā)生的關(guān)鍵，比值升高抑制腫瘤細(xì)胞凋亡，反之降低則促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡［19］。本研究結(jié)果表明，銀杏酚C17 1與順鉑聯(lián)用可促進(jìn)肺癌耐藥細(xì)胞的凋亡，流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)銀杏酚C17 1增強(qiáng)肺癌耐藥細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性，并使凋亡增加。

總之，本研究結(jié)果表明順鉑與銀杏酚C17 1體外同時(shí)作用能對(duì)A549／DDP耐藥細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲、耐藥蛋白及抗凋亡蛋白產(chǎn)生明顯的抑制效果，輔助增敏作用顯著。

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