(上饒師范學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院,江西 上饒 334001)
蛇足石杉(Huperziaserrata(Thunb.ex Murray)Trev.)為蕨類植物門石松亞門石松目石杉科石杉屬草本植物[1]。蛇足石杉一般生長于位于300~270 0 m海拔的林蔭濕地下、灌叢下、路旁或溝谷石上[2]。在我國蛇足石杉主要分布于江西、浙江、福建、兩廣等地區(qū)[3]。蛇足石杉也稱為千層塔、蛇足草、金不換、山芝、千金榨等,是我國一種傳統(tǒng)的藥用蕨類植物[4]。蛇足石杉可以干燥全草入藥,味苦、辛、微甘,性平,歸肺、大腸、肝、腎經(jīng),具有清熱解毒、生肌止血、散瘀消腫等功效,民間用于治療跌打損傷、瘀血腫痛、內(nèi)傷出血、腫癰疔毒、毒蟲叮咬、燒傷燙傷等癥[5]。蛇足石杉的主要藥用成分為石杉堿甲[6],對乙酰膽堿酯酶有強(qiáng)效、低毒、可逆的抑制作用還能減少可溶的β淀粉體和減緩淀粉樣蛋白空斑的形成,可有效提高和改善老年記憶,可用于治療重癥肌無力、中老年癡呆等,且作用時間長,安全指數(shù)大,穩(wěn)定性好,不良反應(yīng)小等[7]。目前,石杉堿甲在生物制藥領(lǐng)域備受關(guān)注,被美國FDA譽為第二代膽堿酯酶抑制劑之一[8]。石杉堿甲的生產(chǎn)大多以野生蛇足石杉為原材料,據(jù)統(tǒng)計,每提取 1 kg的石杉堿甲,需消耗掉將近104kg的野生蛇足石杉[9],對野生蛇足石杉的消費巨大。野生蛇足石杉資源的短缺使得藥材價格暴漲[10]。但在自然條件下,蛇足石杉植株十分矮小,生長極其緩慢,每年生長速度約2.0~3.0 cm,難以滿足巨大的藥材市場需求。因此,保護(hù)野生蛇足石杉資源已是當(dāng)務(wù)之急、重中之重。
有關(guān)蛇足石杉的研究目前報道極多,主要集中在生理生化指標(biāo)、化學(xué)成分分析、內(nèi)生真菌分離和鑒定、提取工藝、藥理作用、新品種選育、遺傳多樣性、種群結(jié)構(gòu)和地理分布、組織培養(yǎng)以及基因克隆、原核表達(dá)及其功能分析等。本文將從這些方面入手對蛇足石杉的研究進(jìn)行概述,旨在為人類利用蛇足石杉提供一個初步認(rèn)識,也為蛇足石杉的后續(xù)研究提供一個初步的框架。
在生理生化指標(biāo)方面,高溫脅迫對蛇足石杉生理特性的影響[11]以及高溫脅迫對蛇足石杉質(zhì)膜透性和葉綠體結(jié)構(gòu)的影響[12]多見報道。這些研究表明,溫度的增加會促進(jìn)蛇足石杉可溶性糖和游離可溶性脯氨酸含量顯著提高,單可溶性蛋白質(zhì)量以及POD和SOD活性顯著下降;當(dāng)溫度為35 ℃和40 ℃時,蛇足石杉的MDA、電導(dǎo)率顯著增加;透射電鏡觀察顯示,35 ℃脅迫4 d,蛇足石杉葉綠體開始變形,40 ℃脅迫 4 d,蛇足石杉葉綠體結(jié)構(gòu)被破壞,被膜開始斷裂,類囊體的排列開始出現(xiàn)紊亂,基質(zhì)的片層也出現(xiàn)斷裂,形狀變得不規(guī)則;因此,可以推測蛇足石杉最適合的生長溫度約為25 ~30 ℃,35 ℃脅迫會抑制蛇足石杉生長,超過40 ℃的高溫脅迫 4 d 會導(dǎo)致植株快速死亡;黎有有等[13]比較了蛇足石杉葉片在不同光照處理[弱光處理(兩 層 遮 蔭 網(wǎng),RI 為10%)、中光處理(一層遮蔭網(wǎng),RI 為5%)、強(qiáng)光處理(大棚內(nèi)光照條件,RI 為 100%)]下的氣孔特征,結(jié)果發(fā)現(xiàn),環(huán)境光強(qiáng)的增加均會導(dǎo)致蛇足石杉葉片氣孔長度、寬度、單個氣孔面積、氣孔密度及氣孔總面積等葉片生理指標(biāo)的顯著增加。
胡莉琴等[14]建立了蛇足石杉內(nèi)生真菌膠胞炭疽發(fā)酵液中石杉堿甲和石杉堿乙含量高效液相色譜(HPLC)測定法。李關(guān)艷和蘇有勇[15]建立了石杉堿甲液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用法(LC~MS)測定法,并指出不同產(chǎn)地的蛇足石杉葉和莖中的石杉堿甲含量具有顯著差異,含量最高是云南玻璃溫室種植的蛇足石杉,其次是江西蛇足石杉,第三是湖南蛇足石杉,福建蛇足石杉石杉堿甲含量較低。張方方等[16]建立了石杉堿甲UFLC測定法,同時指出蛇足石杉莖的石杉堿甲含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于葉和根,而葉的石杉堿甲含量又高于根。王德立等[17]采集了江西修水縣、貴州岑鞏縣、廣西那坡縣和重慶石柱縣等 4 個樣地中不同生長階段的野生蛇足石杉進(jìn)行HPLC 法測定,結(jié)果發(fā)現(xiàn),蛇足石杉幼苗和蛇足石杉幼株有利于石杉堿甲含量的積累,其含量顯著高于蛇足石杉成株,另外,這4個不同樣地之間的石杉堿甲含量也存在差異,主要是因為生境因子嚴(yán)重所致,比如降雨較多對石杉堿甲的積累不利。何春萍等[18]采取4種方法(超聲法、索氏法、酸浸法和煎煮法)提取貴州蛇足石杉的石杉總生物堿,結(jié)果發(fā)現(xiàn),超聲法對于石杉堿甲提取最為有利,其次是索氏法,較差的方法為酸浸法和煎煮法,同時利用超聲提取法,葉的石杉堿甲含量最高,其次是莖,最低是根,這個結(jié)果表明蛇足石杉的地上部分不同,其石杉堿甲含量也不同。
2015年,韓文霞等[19]通過薄層色譜(TLC)和HPLC法篩選并鑒定為一株產(chǎn)石杉堿甲的青霉菌屬真菌;2016年,韓文霞等[20]同樣采用TLC及HPLC法篩選并鑒定內(nèi)生真菌NSG~1為1株尖鐮孢(鐮刀菌)屬真菌尖鐮孢NSG;2017年,韓文霞等[21]再次從野生蛇足石杉中篩選并鑒定產(chǎn)石杉堿甲內(nèi)生真菌NSH~5為輪枝鐮孢菌。于飛雪等[22]從內(nèi)生真菌M336 發(fā)酵提取物鑒定出chaetoviridines F、chaetoviridines E、5'~epichaetoviridinA、5'~epichaetoviridin A、xanthoquinodins Al、xanthoquinodins A2、xanthoquinodins B1 和毛殼菌素8 個化合物,其中指出5'~epichaetoviridin A有抑菌作用,而其他7種化合物則具有一定的細(xì)胞毒活性。彭思露等[23]研究了蛇足石杉內(nèi)生真菌Shiraiasp.Slf14 中III 型聚酮合酶的表達(dá)、純化,并對其進(jìn)行了生物信息學(xué)分析,成功構(gòu)建了表達(dá)載體 p ET~22b(+)~PKSIII。陳艷梅等[24]以蛇足石杉為材料,從其莖部分離純化得到1株內(nèi)生真菌,提取這株真菌的總DNA,用PCR擴(kuò)增ITS片段,將測序結(jié)果在GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對,最終鑒定為葡萄座腔菌屬。賴政等[25]發(fā)現(xiàn)蛇足石杉內(nèi)生真菌菌株 SF88 和LF52在馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基(PDB)、沙氏液體培養(yǎng)基(SDB)和查氏液體培養(yǎng)基(CDB)上發(fā)酵后其菌體總生物堿對乙酰膽堿酯酶(ACh E)活性的抑制率均達(dá)到40%~70%,經(jīng)測序分析,可以認(rèn)定SF88 和LF52為Phaeosphaeriaceae科中一未知種,這為開發(fā)生物堿類乙酰膽堿酯酶抑制劑(ACh EI)藥物提供了新的潛在菌種資源。
楊婷等[26]和余宇燕等[27]分別建立了基于Box~Behnken提取石杉堿甲的最佳工藝和石杉堿甲免疫學(xué)快速檢測的最佳工藝。而周宇等[28]認(rèn)為蛇足石杉中總黃酮提取的最佳工藝條件為60%乙醇→90 min萃取→90 ℃加熱→1:20(固液體積比),在此條件下,總黃酮提取率可達(dá)到0.447%。
蛇足石杉藥理活性研究最為系統(tǒng)的成分是石杉堿甲(Hup~A),其主要藥理活性為抗ACh E作用。Hup~A 藥理的研究表明,Hup~A可以影響腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)、興奮性氨基酸及其 NMDA 受體,還可改善記憶認(rèn)識損害,具有一定的藥動學(xué)規(guī)律等[29-30]。另外,研究也表明,蛇足石杉中還存在另一個強(qiáng)效膽堿酯酶抑制劑,即6β~羥基石杉堿甲,其對ACh E的抑制作用強(qiáng)于Hup~A達(dá) 4 倍之多,但其毒性遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于 Hup~A。還有研究表明,馬尾杉堿 M 、異福定堿、2α,11α~dihydroxyfawcettidine 和 lycoposerramine H3C也具有較好的ACh E抑制作用[31-32]。Tan 等[33-34]研究表明,huperzine P、fawcettimine、phlegmariunine B 和 huperzine R 也具有一定的ACh E 抑制活性,但其活性沒有 Hup~A 顯著。
閆志剛等[35]通過系統(tǒng)選育,從廣西 20 多個縣市收集的 25 份蛇足石杉種質(zhì)中篩選出一個蛇足石杉新品種——容杉2 號,這個品種含石杉堿甲高(質(zhì)量比0.0714%),且平均單株產(chǎn)量高(3.89 g),這為我國蛇足石杉的品種選育指明了方向,也在一定程度上解決了野生蛇足石杉石杉堿甲含量不高的難題。
林如輝等[36]引種了福建大田、三明市郊、南靖 3 個野生蛇足石杉種質(zhì)資源,并對其進(jìn)行馴化,最后采用HPLC法測定其石杉堿甲含量,結(jié)果表明,福建大田、三明市郊、南靖 3 個野生蛇足石杉種質(zhì)資源共有 15 個差異蛋白質(zhì)點,福建大田、三明市郊、南靖 3 個野生蛇足石杉種質(zhì)資源的差異蛋白質(zhì)點豐度差異顯著。黃驥等[37]對武陵山區(qū)蛇足石杉4個居群進(jìn)行遺傳多樣性AFLP分子標(biāo)記分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn),武陵山區(qū)蛇足石杉遺傳多樣性較為豐富,其遺傳變異主要來源于居群內(nèi),同時指出,蛇足石杉屬于異交種,其居群間的遺傳距離與地理距離之間無正相關(guān)。
齊耀東和王德立[38]分析了江西、貴州、廣西、重慶及海南等5地蛇足石杉天然居群的種群結(jié)構(gòu)、變化趨勢及生長速率等,結(jié)果發(fā)現(xiàn)5地蛇足石杉天然居群結(jié)構(gòu)較為相似,基本是以幼苗和幼株作為居群主要構(gòu)成,居群內(nèi)成株偏少;5地蛇足石杉天然居群的生長速率不具有顯著差異,年生長量約為2.0~ 3.0 cm;海南居群芽胞可產(chǎn)生芽胞的幼苗和成株占居群的比例顯著高于其它居群,說明海南蛇足石杉種群的結(jié)構(gòu)更新主要是以芽胞繁殖為主,而江西、貴州、廣西、重慶的蛇足石杉居群則是以孢子繁殖為主。潘麗梅[39]采用分段勻滑技術(shù)編制了廣西大明山自然保護(hù)區(qū)蛇足石杉種群的靜態(tài)生命表,并在此基礎(chǔ)上對其進(jìn)行種群生存分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn),廣西大明山自然保護(hù)區(qū)蛇足石杉種群存活曲線趨于Deevey~Ⅱ型,且廣西大明山自然保護(hù)區(qū)蛇足石杉種群生長過程中在第Ⅳ齡級具有一個死亡高峰。王德立等[40]通過查閱世界范圍的植物志以及中國各大標(biāo)本館和中國植物志中有關(guān)蛇足石杉的文獻(xiàn)資料,獲取了世界范圍內(nèi)蛇足石杉的地理分布數(shù)據(jù),明確了中國蛇足石杉主要分布于長江以南各省,東北地區(qū)僅有少量分布。周毅等[41]對湘西地區(qū)蛇足石杉資源進(jìn)行了采樣分析,指出蛇足石杉資源掠奪性采收以及其種群較低的自然更新頻度是其種群動態(tài)平衡很難維持的主要原因,也是造成湘西地區(qū)蛇足石杉資源蘊藏量顯著下降、種質(zhì)資源大幅消失的主要因素,呼吁國家相關(guān)采取相關(guān)措施保護(hù)湘西地區(qū)蛇足石杉種質(zhì)資源。楊偉波等[42]分析了蛇足石杉種群在湘西油茶樹群落中的分布格局,結(jié)果發(fā)現(xiàn),蛇足石杉種群在湘西油茶樹群落中的分布格局類型大多是呈集群式分布,且符合n= 1的奈曼分布。
有關(guān)蛇足石杉的組織培養(yǎng)報道較多。王鋒和武蕓[43]對恩施市長嶺崗的蛇足石杉進(jìn)行組培快繁體系的研究,結(jié)果表明,100 mg/L AAS+0.5 mg /L 孔雀石綠組合有利于抑制蛇足石杉外植體的內(nèi)生菌,外植體的存活率可達(dá)20%;添加0.05μg/ L IBA、1.4μmol/ L KT、0.1 g/L谷氨酰胺、0.05%(質(zhì)量濃度,下同)山農(nóng)一號和0.3 mg/L TDZ的MS培養(yǎng)基有利于蛇足石杉的初代培養(yǎng);添加1.0 mg/L TDZ和1.0 mg/L 2,4~D的MS培養(yǎng)基則可促進(jìn)蛇足石杉繼代培養(yǎng)中的愈傷組織誘導(dǎo);添加1.5 mg/L IBA和2.0 mg/L 谷氨酰胺的1/3MS培養(yǎng)基有利于蛇足石杉的生根。葉麗婻等[44]發(fā)現(xiàn),H2O2誘變后,蛇足石杉葉狀體的石杉堿甲含量顯著提高,并在此基礎(chǔ)上篩選出蛇足石杉高產(chǎn)株系SH42。陳曼等[45]的研究表明,天冬氨酸有利于蛇足石杉葉狀體干重生物量和石杉堿甲含量的顯著提高;色氨酸有利于蛇足石杉葉狀體相對增殖率的顯著提高,但不利于蛇足石杉葉狀體的石杉堿甲積累;賴氨酸則不利于蛇足石杉葉狀體相對增殖量和干重生物量的增加,也不利于蛇足石杉葉狀體石杉堿甲含量的積累,究其原因,可能是天冬氨酸可以促進(jìn)蛇足石杉葉狀體SOD酶活性的提高和葉狀體石杉堿甲的積累量,但SOD酶活性的長期高水平保持則對葉狀體石杉堿甲的積累不利。劉江海等[46]研究了蛇足石杉側(cè)芽的發(fā)生及其培養(yǎng),指出蛇足石杉在離體培養(yǎng)中不一定像自然生長一樣在葉腋內(nèi)產(chǎn)生孢子囊而不產(chǎn)生側(cè)芽,而是可形成多個側(cè)芽,待側(cè)芽剝離后,蛇足石杉側(cè)芽則可極易形成不定根,這為蛇足石杉的組織培養(yǎng)提供了一條新思路。馬英姿等[47]的蛇足石杉組培試驗表明,0.5 mg/L孔雀石綠+100 mg/L AAS的聯(lián)合可取得較好的滅菌效果,指出外植體可與內(nèi)生菌共存,也獲得了蛇足石杉側(cè)芽,側(cè)芽從主莖分離后轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基上,生根率較頂芽顯著提高,可達(dá)90%,但誘導(dǎo)的新根也呈二叉分枝狀。吉枝單等[48]以廬山野生蛇足石杉成年株新生枝莖為外植體,運用植物離體培養(yǎng)技術(shù)獲得了產(chǎn)生石杉堿甲的葉狀體,建立的葉狀體具有累積與原植物相同的有效成分石杉堿甲的能力。李曉君等[49]研究了不同濃度蔗糖及植物激素對蛇足石杉莖尖誘導(dǎo)叢生芽和 GGB(綠色小體)的影響,結(jié)果表明,添加2%蔗糖和4% 蔗糖的MS培養(yǎng)基有利于蛇足石杉莖尖誘導(dǎo)叢生芽和 GGB,且添加2% 蔗糖的MS培養(yǎng)基也有利于 GGB 可分化出叢生芽,添加10μmol/L IBA的改良MS培養(yǎng)基可促進(jìn)蛇足石杉叢生芽再生健壯根系從而促進(jìn)再生植株的移栽成活率。
杜次等[50]對老年癡呆藥——石杉堿甲生物合成的第一個酶賴氨酸脫羧酶進(jìn)行基因克隆、原核表達(dá)及其功能分析,通過TLC檢測發(fā)現(xiàn)重組融合蛋白 Trx~LDC1 和 Trx~LDC2 均能催化賴氨酸脫羧生成尸胺。羅紅梅等[51]對蛇足石杉1~脫氧~D~木酮糖~5~ 磷酸還原異構(gòu)酶(HsDXR1)基因進(jìn)行克隆與表達(dá)分析,并對HsDXR1 基因在蛇足石杉莖中的表達(dá)量進(jìn)行實時熒光定量 PCR檢測,發(fā)現(xiàn)該基因優(yōu)先在莖中表達(dá),其次是根,在葉中HsDXR1 基因表達(dá)量最低。但殷秀梅等[52]對蛇足石杉鯊烯合酶HsSQS1 基因進(jìn)行克隆和序列分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn),HsSQS1 基因在蛇足石杉根中的表達(dá)豐度顯著高于莖和葉。這說明,蛇足石杉不同基因在不同部位的表達(dá)量也不一樣。
在生理生化指標(biāo)方面,僅僅研究了高溫脅迫和不同光照對蛇足石杉生理特性和光合特性的影響。蛇足石杉屬于高山藥用蕨類植物,今后應(yīng)加強(qiáng)低害和凍害以及不同光質(zhì)(如紅光、藍(lán)光等可調(diào)制光)對蛇足石杉生理特性和光合特性的影響方面的研究,為蛇足石杉仿野生種植提供理論依據(jù);在化學(xué)成分分析方面,大多研究報道了不同方法、不同產(chǎn)地和不同植株部分對石杉堿甲提取的影響。但方法還有待于改進(jìn),取材產(chǎn)地還需進(jìn)一步擴(kuò)大。另外,還需要比較一下大棚種植和野外種植蛇足石杉石杉堿甲含量的差異;在內(nèi)生真菌分離和鑒定方面,大多數(shù)研究分離和鑒定出了產(chǎn)石杉堿甲的內(nèi)生真菌,但并未對這些真菌的轉(zhuǎn)錄組、代謝組以及蛋白質(zhì)組進(jìn)行組學(xué)分析。在提取工藝方面,已經(jīng)建立了提取石杉堿甲的最佳工藝,但未對蛇足石杉其他藥用成分的提取工藝作進(jìn)一步的研究和探討;在藥理作用方面,主要研究了石杉堿甲等成分的抗ACh E作用,但在腦缺血再灌注中的應(yīng)用等方面的研究少見報道;在新品種選育方面,篩選的蛇足石杉新品種不多,還需對蛇足石杉種質(zhì)庫進(jìn)行比較和成分分析,篩選出多個抗逆性強(qiáng)、繁殖速度快、含石杉堿甲高的新品種,以造福人類,滿足人類需求;在遺傳多樣性方面,目前的研究僅限于差異蛋白質(zhì)點和AFLP分子標(biāo)記分析,取材范圍也較為狹窄,今后將擴(kuò)大取材范圍,建立蛇足石杉種質(zhì)資源庫,并在此基礎(chǔ)上采取更多的DNA分子標(biāo)記方法對蛇足石杉遺傳多樣性進(jìn)行分析;在種群結(jié)構(gòu)和地理分布方面,部分學(xué)者研究了江西、貴州、廣西、重慶、湖南及海南等地的蛇足石杉種群結(jié)構(gòu)、變化趨勢及生長速率等,但對浙江、福建、江蘇、河南、四川、云南和安徽等地的蛇足石杉種群結(jié)構(gòu)尚無相關(guān)研究,今后將對這些省份的蛇足石杉種群結(jié)構(gòu)開展研究,以采取措施來有效保護(hù)我國蛇足石杉種群;在組織培養(yǎng)方面,雖然相關(guān)報道較多,但重復(fù)性不好,且快繁體系尚未完全建立和優(yōu)化,今后,將進(jìn)一步篩選出快繁培養(yǎng)基,并探討一套有效實用的移栽馴化體系;在基因克隆、原核表達(dá)及其功能分析方面,目前只對賴氨酸脫羧酶、1~脫氧~D~木酮糖~5~ 磷酸還原異構(gòu)酶(Hs DXR1)以及蛇足石杉鯊烯合酶 Hs SQS1 基因進(jìn)行了基因克隆、原核表達(dá)及其功能分析,但在蛇足石杉體內(nèi)涉及到石杉堿甲生物合成的酶較多,還需對更多的酶進(jìn)行基因克隆、原核表達(dá)及其功能分析,旨在為蛇足石杉細(xì)胞培養(yǎng)提取石杉堿甲提供分子依據(jù)。
總之,藥用蕨類植物蛇足石杉在化學(xué)成分分析、內(nèi)生真菌分離和鑒定、提取工藝、藥理作用、遺傳多樣性、種群結(jié)構(gòu)和地理分布多有研究,但在生理生化指標(biāo)、組織培養(yǎng)以及基因克隆、原核表達(dá)及其功能分析等方面少見報道,今后將建立和完善蛇足石杉的快繁體系,加強(qiáng)對蛇足石杉種質(zhì)資源離體保存的研究,并在此基礎(chǔ)上檢測其生理生化指標(biāo)和進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組學(xué)、代謝組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)分析,可為蛇足石杉的藥理療效提供分子模式和作用機(jī)理。蛇足石杉的生物堿石杉堿甲具有低毒、高效、可逆和高選擇性等優(yōu)點,是乙酰膽堿酯酶抑制劑最佳選擇,且對于治療重癥肌無力、中老年癡呆及提高記憶力具有良好的療效[53],并對抑制有機(jī)磷酸中毒有一定的作用[54]。正因為蛇足石杉的用途廣泛、藥效顯著,是治療阿爾茨海默病癥的特效藥,隨著世界人口老齡化的加速,蛇足石杉的市場需求量也不斷增加,為了獲取高額回報,藥農(nóng)無節(jié)制地采挖,長期掠奪式的采挖導(dǎo)致野生蛇足石杉銳減,加上在自然狀態(tài)下蛇足石杉生長緩慢,其孢子需要15年才能萌發(fā),致使蛇足石杉資源快速減少。再加上人工栽培蛇足石杉難度大,而化學(xué)合成石杉堿甲成本較高,導(dǎo)致目前石杉堿甲市場銷售價格極其昂貴。因此,加強(qiáng)對蛇足石杉種質(zhì)資源的深入研究,繁育出能滿足石杉堿甲類藥物生產(chǎn)所需求的原材料,是社會的迫切需求,既可解決藥用蕨類植物蛇足石杉原料缺失瓶頸,也可在一定程度上有望解決中藥材來源匱乏和緩解野生資源遭受嚴(yán)重破壞的壓力,繼而可有效地保護(hù)好蛇足石杉這種珍貴有限的藥用植物野生資源,這對發(fā)展我國中醫(yī)藥事業(yè)具有重要意義。