，，　，　

細(xì)粒棘球蚴病 (cystic echinococcosis， CE)是一種在全世界廣泛分布并在部分區(qū)域呈現(xiàn)嚴(yán)重流行的蠕蟲類人獸共患病[1]。我國是棘球蚴病發(fā)病最高的國家之一[2]。治療CE通常依賴于手術(shù)和/或化療，取決于多種的因素如囊腫的大小和位置、合并微生物感染、潛在危險(xiǎn)并發(fā)癥如囊腫破裂等[3-6]。作為手術(shù)治療的補(bǔ)充，唯一可用的藥物治療CE的苯并咪唑氨基甲酸酯衍生物,即甲苯咪唑(MBZ)和阿苯達(dá)唑(ABZ)[7]。然而，有超過20%的CE病例對(duì)于這樣的治療效果不佳[8]。因此，迫切需要新型的、更有效的治療方案。

干擾素(interferon, IFN)-α，屬一類干擾素，最初主要被用于各種病毒性疾病的抗病毒治療[9]。隨后，IFN-α 被證實(shí)具有多種生物學(xué)功能，包括：抗病毒、抗腫瘤 及免疫調(diào)節(jié)等[9-10]。對(duì)于另一種棘球蚴病-泡球蚴病(AE)，有研究表明IFN-α具有積極的保護(hù)作用。Godot V 等研究證實(shí)IFN-α能夠顯著減小AE病人的病變囊泡[11]。 進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，IFN-α 治療AE的過程中能夠逆轉(zhuǎn)Th2型到Th1型免疫應(yīng)答，而這有利于機(jī)體免疫對(duì)于包囊產(chǎn)生有效的保護(hù)性的免疫應(yīng)答。在AE的研究中還發(fā)現(xiàn)，IFN-α能夠減輕肝臟纖維化與損傷水平。然而，目前缺乏IFN-α對(duì)于CE治療效果的研究。本研究旨在小鼠體內(nèi)評(píng)價(jià)單獨(dú)IFN-α及聯(lián)合ABZ-IFN-α對(duì)于CE的治療效果。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均通過內(nèi)蒙古包鋼醫(yī)院倫理委員會(huì)的審核批準(zhǔn)。40只雌性Balb/c 小鼠(8周齡，18～20 g) 購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)在一定室溫控制(22±1 ℃)、光照 (12 h光照/黑暗 循環(huán)) 環(huán)境中。

1.1.2藥物及試劑ABZ購自葛蘭素史克公司, Pegasys○Rinterferon alfa-2a 購自羅氏制藥有限公司。青霉素、鏈霉素、RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)基、胎牛血清 (FBS)均購自Invitrogen公司。Con-A 購自Sigma-Aldrich公司。小鼠IL-4, IL-10和 IFN-γ細(xì)胞因子ELISA檢測試劑盒購自e-Bioscience公司。山羊抗小鼠IgE、IgG抗體及其亞型二抗購自Novagen 公司。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3原頭蚴包囊從臨床手術(shù)中分離獲得后，迅速無菌地轉(zhuǎn)移到實(shí)驗(yàn)室。通過注射器將囊液從包囊中吸出, 9 000×g 4 ℃離心20 min，棄上清，將沉淀原頭蚴用含有雙抗的PBS(pH 7.2，包含1 000 μg/mL青霉素和1 000 U/mL鏈霉素)洗兩遍。原頭蚴活性利用美蘭排除實(shí)驗(yàn)進(jìn)行鑒定[12]。 只有當(dāng)原頭蚴活性達(dá)到90%以上才會(huì)被用于接下來小鼠繼發(fā)感染。繼發(fā)感染使用的原頭蚴終濃度是1 500個(gè)/200 μL PBS。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)通過腹腔注射繼發(fā)感染40只雌性Balb/c 小鼠，每只小鼠感染重懸在200 μL PBS的1 500個(gè)新鮮的原頭蚴。感染5個(gè)月后，小鼠被隨機(jī)分配到4組(10只/組)：a) ABZ治療組，小鼠每日灌胃ABZ (5 mg/kg)；b) IFN-α治療組，小鼠每3 d肌肉注射IFN-α-2a 10 000 IU/50 μL；c) ABZ+IFN-α組，小鼠同時(shí)進(jìn)行ABZ與IFN-α的治療，劑量方法同a)和b)；d)未經(jīng)治療對(duì)照組。各組藥物治療維持2個(gè)月。隨后，隨后處死小鼠，檢測相關(guān)指標(biāo)評(píng)價(jià)治療效果。

1.2.2檢測寄生蟲感染及分析治療有效率解剖小鼠腹腔，檢測每只小鼠的包囊數(shù)量、大小及重量。治療有效率(基于感染小鼠包囊重量)通過下列公式計(jì)算[13]:

其中 Xc是未經(jīng)治療對(duì)照組平均包囊重量，Xt 是治療組平均包囊重量。

1.2.3透射電子顯微鏡觀察(Transmission electron microscopy，TEM)各組包囊樣本經(jīng)處理后用TEM進(jìn)行檢測[14]。包囊被切割為1 mm3大小并利用預(yù)冷的含2.5% 戊二醛的0.1 M PBS固定5 h。樣本經(jīng)0.1 M PBS洗兩遍后，采用1%四氧化鋨固定。樣本隨后經(jīng)不同乙醇濃度梯度脫水后在等體積的氧化丙烯/環(huán)氧樹脂中包埋過夜。隨后，再次在新鮮的100%環(huán)氧樹脂包埋24 h及在65 ℃包埋18h。采用超微切片機(jī)(Leica EM FC7)制備50-70 nm厚度的切片。隨后放置到200-目的銅網(wǎng)，切片經(jīng)飽和乙酸雙氧鈾及檸檬酸鉛分別浸泡著色10 min和5 min。切片經(jīng)蒸餾水清洗后自然干燥，利用TEM(H7650, 日立)檢測。

1.2.4酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)首先， 將每只小鼠分離的脾細(xì)胞采用RPMI 1640培養(yǎng)基(含10%熱滅活FBS)重懸，終濃度調(diào)整到5×106個(gè)脾細(xì)胞/mL，加入2.5 μg/mL Con-A (Sigma) 刺激劑37 ℃ 5% CO2孵育72 h后，收集培養(yǎng)上清用于檢測IL-4, IL-10和 IFN-γ濃度。血清與細(xì)胞培養(yǎng)上清細(xì)胞因子的檢測的具體步驟參見EILSA細(xì)胞因子檢測試劑盒說明書。

ELISA檢測血清抗體水平：用96孔微量板，每孔加入含有0.1 μg/μL 包囊粗抗原的0.1 M磷酸鹽緩沖液 (pH 9.6)100 μL 4 ℃孵育過夜。血清以1∶100稀釋到PBST 緩沖液 (pH 7.2, PBS 中含有0.05%吐溫-20)中， 37 ℃孵育1 h。隨后加入二抗，即以1∶1000稀釋的HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG、IgG亞型和IgE。酶標(biāo)儀(Bio-Rad)單波長490nm處檢測吸光密度OD值。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所有數(shù)據(jù)均通過Prism 5.0 (GraphPad 軟件)進(jìn)行分析。結(jié)果表示為均數(shù)± 標(biāo)準(zhǔn)誤。包囊重量、大小、細(xì)胞因子濃度與抗體水平均分別通過單因素方差檢驗(yàn)進(jìn)行分析。當(dāng)P<0.05時(shí)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2　結(jié)　果

2.1ABZ+IFN-α 治療顯著抑制包囊小鼠在實(shí)驗(yàn)過程無發(fā)現(xiàn)死亡，表明沒有嚴(yán)重的藥物副作用。小鼠處死時(shí)，4組小鼠平均小鼠體重沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。ABZ+IFN-α 治療組的包囊數(shù)量與對(duì)照組(P<0.01)或ABZ組(P<0.05)相比顯著下降，ABZ治療組的包囊數(shù)量與對(duì)照組相比顯著下降(P<0.01)。然而，IFN-α 治療組包囊數(shù)量與對(duì)照組相比無顯著差異(P>0.05)，見表1。

表1對(duì)照組與不同治療組的包囊數(shù)量
Tab.1The number of hydatid cysts in control and treated infected mice

分組Group每只小鼠的包囊數(shù)量EachnumberofcystinmiceMean±SEMABZ32214121322．100±0．314IFN?α47345162423．800±0．592ABZ+IFN?α11102112000．900±0．233ab對(duì)照組Untreatedcontrol54062335743．900±0．640

注：ABZ+IFN-α治療組的包囊數(shù)量與未處理組(aP<0.01)或ABZ治療組(bP<0.05)相比顯著下降。

注：The number of cysts in treated group showed significant reduction from group untreated control (aP<0.01) or group ABZ (bP<0.05).

結(jié)果表明ABZ+IFN-α治療組無論包囊重量還是大小，與對(duì)照組(P<0.01)或ABZ治療組(P<0.05)相比均顯著下降，ABZ+IFN-α治療組的包囊抑制率達(dá)到89.7%，這些結(jié)果表明ABZ聯(lián)合IFN-α治療效果更顯著，見表2。

表2不同處理組的包囊重量與大小
Tab.2Weights and size of hydatid cysts in control and treated infected mice

分組Group囊重(g)Weightofhydatidcyst包囊直徑(mm)Sizeofhydatidcyst包囊抑制率(%)CystinhibitionrateABZ0．21±0．17a2．1±0．9a78．4IFN?α0．89±0．286．7±1．50．08ABZ+IFN?α0．10±0．05ab1．2±0．4ab89．7Untreatedcontrol0．97±0．457．3±3．2?

注：ABZ+IFN-α治療組的包囊重量與大小與對(duì)照組(aP<0.01)或ABZ治療組(bP<0.05)相比顯著下降。

2.2ABZ+IFN-α治療組的包囊超微結(jié)構(gòu)的改變與破壞TEM用于觀察不同處理組包囊超微結(jié)構(gòu)的變化。結(jié)果表明，對(duì)照組的包囊呈現(xiàn)典型的細(xì)粒棘球蚴包囊結(jié)構(gòu)，而ABZ+IFN-α治療組出現(xiàn)了包囊超微結(jié)構(gòu)的改變與破壞。見圖1A和1B。在生發(fā)層，ABZ+IFN-α治療的小鼠包囊中正常的未分化細(xì)胞、纖維組織、典型細(xì)胞核及核仁結(jié)構(gòu)明顯消失，取而代之的是細(xì)胞核碎裂與大量的脂滴，見圖1C和1D，表明生發(fā)層產(chǎn)生子囊的能力被破壞。與對(duì)照組相比，ABZ+IFN-α治療組的小鼠包囊典型的皮層與微毛微管結(jié)構(gòu)消失，見圖1E和1F。正常外層的非細(xì)胞的、富含糖成分的角質(zhì)層被排列不規(guī)整、富含空泡結(jié)構(gòu)的代替，見圖1G和1H。

ABZ+IFN-α治療組的變化：A、C、E和G；未治療對(duì)照組的變化：B、D、F和H。A和B顯示的是總體的包囊超微結(jié)構(gòu)。C和D展示的是包囊生發(fā)層。E和F重點(diǎn)觀察的是微管與外皮結(jié)構(gòu)。F來自D的紅色區(qū)域。G與H是包囊外層的層積層。在對(duì)照組，包囊具有角質(zhì)層 (LL)、生發(fā)層(GL)、皮層(Te)、微管(Mt)、未分化細(xì)胞(UC)、纖維組織(F)、細(xì)胞核(Nu)與核仁(Nl)。ABZ+IFN-α治療組的超微結(jié)構(gòu)變化表明脂滴(Ld)和空泡(V)。ABZ+IFN-α treated group (A, C, E and G) and Untreated group (B, D, F and H). A and B showed the general ultrastructure of cysts. C and D showed germinal layer of cysts. E and F emphasized on changes of teguments and microtriches. F derived from red rectangle area of D. G and H represented laminated layer of cysts. In untreated group, the hydatid cyst appears almost normal laminated layer (LL), germinal layer (GL), tegument (Te), microtriches (Mt), undifferentiated cells (UC), fibrous tissue (F), cell nucleus (Nu) and nucleolus (Nl) are clearly visible. In ABZ+IFN-α treated group, ultrastructural alternations shows as lipid droplets (Ld) and vaculoles (V), nuclear fragmentation, degeneration and disappearance of microtriches (Mt), undifferentiated cells (UC), tegument (Te), and cellular elements. Each figure was labeled by a scale bar.圖1　ABZ+IFN-α治療組的包囊超微結(jié)構(gòu)變化Fig.1　Ultrastructural modification of cyst wall and cyst components in ABZ+IFN-α treated group

2.3ABZ+IFN-α治療顯著降低了血清IL-10：為了檢測治療后細(xì)胞因子的生成情況，檢查發(fā)現(xiàn)ABZ+IFN-α治療組的血清IL-10濃度與對(duì)照組相比顯著降低(2.29±0.25 ng/mL) vs. (3.44±0.14 ng/mL),P<0.01)(圖2A)。IFN-γ(圖 2B,P=0.08)與IL-4(圖2C,P=0.11)在各組之間沒有顯著差別。

不同治療組的小鼠血清分別使用ELISA試劑盒檢測IFN-γ (A)、 IL-4 (B)和 IL-10 (C)濃度。a P<0.01。Sera of mice from diverse groups were collected respectively for detection of IFN-γ (A), IL-4 (B) and IL-10 (C) concentration using ELISA kit. a P<0.01.圖2　ABZ+IFN-α治療組血清IL-10顯著下降Fig.2　Significant decrease of IL-10 in serum with ABZ+IFN-α treatment

2.4ABZ+IFN-α治療顯著降低了脾細(xì)胞分泌的IL-10：經(jīng)檢測，脾細(xì)胞分泌細(xì)胞因子情況并發(fā)現(xiàn)ABZ+IFN-α治療組的IL-10分泌與對(duì)照組相比顯著下降(0.91±0.10 ng/mL) vs. (1.99±0.17 ng/mL)，P<0.01)(圖3A)。但是IFN-γ(圖 3B,P=0.31)與IL-4(圖3C,P=0.18)水平在各組之間沒有顯著差別。

不同治療組的小鼠脾細(xì)胞上清分別使用ELISA試劑盒檢測IFN-γ (A)、 IL-4 (B)和 IL-10 (C)濃度。a P<0.01。Cytokines production by spleen cells from diverse groups were collected respectively for detection of IFN-γ (A), IL-4 (B) and IL-10 (C) secretion using ELISA kit. a P<0.01.圖3　ABZ+IFN-α治療組的脾細(xì)胞分泌的IL-10顯著降低Fig.3　Significant decrease of IL-10 in production in vitro with ABZ+IFN-α treatment

2.5ABZ+IFN-α治療組的血清特異性抗體變化為了更好的了解該治療對(duì)于特異性抗體水平的影響，本研究對(duì)不同處理組血清抗體進(jìn)行了ELISA檢測。結(jié)果表明，與單純感染對(duì)照組相比，ABZ+IFN-α治療組的IgG抗體持續(xù)下降，在治療結(jié)束時(shí)(第60 d)顯著下降(P<0.000 1，圖4A)。同樣，在治療結(jié)束時(shí)，IgG抗體的亞型包括IgG1(P<0.000 1，圖4B)、IgG2(P=0.029 9，圖4C)與IgG4(P<0.000 1，圖4D)均隨著治療顯著降低。與此同時(shí)，聯(lián)合治療組IgE水平亦顯著降低(P<0.000 1，圖4E)。

圖4　不同治療組血清IgG、IgG1、 IgG2、 IgG4、 IgE和IgM的檢測Fig.4　Detection of OD value profiles of sera IgG, IgG1, IgG2, IgG4, IgE and IgM in diverse treated groups

3　討　論

在本研究中，評(píng)價(jià)了ABZ聯(lián)合IFN-α對(duì)于CE的治療效果。研究結(jié)果表明ABZ聯(lián)合IFN-α在小鼠繼發(fā)感染CE中具有更好的治療效果。進(jìn)一步證實(shí)該治療效果可能與包囊超微結(jié)構(gòu)的改變、降低的IL-10水平以及下調(diào)體液免疫有關(guān)。

IFN-α具有多種生物學(xué)功能包括抗病毒感染、抗腫瘤及免疫調(diào)節(jié)作用，但在蠕蟲感染中的作用研究十分有限。但是值得一提的是在AE研究中，IFN-α減輕了人和小鼠的包囊病變[11, 15]。研究者進(jìn)一步指出該作用與Th2型細(xì)胞因子向Th1型細(xì)胞因子逆轉(zhuǎn)有關(guān)，包括下調(diào)IL-10、IL-6與IL-13，以及上調(diào)IFN-γ 水平[11]。 但是本研究顯示僅僅 IFN-α并不能產(chǎn)生緩解CE的能力，也不能逆轉(zhuǎn)Th細(xì)胞因子類型，說明僅僅IFN-α不能夠打破慢性CE的Th2型免疫應(yīng)答。該結(jié)果與之前在AE治療的報(bào)道不同。然而IFN-α聯(lián)合ABZ能夠顯著改善CE降低包囊負(fù)擔(dān)，與ABZ組或?qū)φ战M相比治療效果顯著見表1、2。進(jìn)一步研究表明，該聯(lián)合治療能夠顯著下調(diào)IL-10。IL-10是典型的Th2型細(xì)胞因子，在 CE中抑制Th1保護(hù)性應(yīng)答并幫助寄生蟲逃避宿主免疫應(yīng)答[16]。所以，該聯(lián)合治療取得更好的治療效果可能與抑制了IL-10，降低了Th2型免疫應(yīng)答有關(guān)。

體液免疫應(yīng)答在CE發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，在感染的早期，通過激活補(bǔ)體、調(diào)理作用、ADCC作用等發(fā)揮重要的保護(hù)性免疫應(yīng)答，而在感染的慢性期抗體尤其是IgG4類型具有保護(hù)蟲體逃逸的作用[17-18]。在本研究聯(lián)合治療中的IgG、IgG1、IgG2、IgG4和IgE都顯著下降，這表明在感染慢性期異常升高的體液免疫應(yīng)答在該聯(lián)合治療中顯著下調(diào)，其中IgG4也顯著降低。但是，盡管IgG水平在聯(lián)合治療后顯著下降，我們發(fā)現(xiàn)其水平仍高于陰性水平。這可能與感染的免疫記憶有關(guān)，但需要進(jìn)一步的研究?？傊撀?lián)合治療的治療效果可能亦與下調(diào)對(duì)寄生蟲有利的體液免疫有關(guān)。

在本研究中，ABZ+IFN-α或單獨(dú)的IFN-α治療都沒有顯著增加感染慢性期IFN-γ水平。這或許是與IFN-γ往往在感染早期(7-8 d)發(fā)揮重要的保護(hù)作用，而隨后在感染的慢性期就會(huì)下降有關(guān)[19]。感染早期治療對(duì)于IFN-γ的影響將會(huì)進(jìn)一步研究。此外，有研究報(bào)道IFN-α通過增強(qiáng)樹突狀細(xì)胞(DC)細(xì)胞遞呈抗原發(fā)揮抗腫瘤作用[20-21]，但是DC細(xì)胞是否在該聯(lián)合治療中發(fā)揮作用仍需探究。

總之，本研究證實(shí)ABZ聯(lián)合IFN-α對(duì)于CE具有更好的治療效果，為CE治療提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

[1] Brunetti E, Kern P, Vuitton DA.Writing Panel for the W-I. Expert consensus for the diagnosis and treatment of cystic and alveolar echinococcosis in humans[J]. Acta tropica, 2010, 114(1): 1-16.DOI: 10.1016/j.actatropica.2009.11.001

[2] Qi YF,Wu WP. Progress on the epidemiology of echinococcosis[J]. Chin J Parasitol Paras Dis, 2013, 31(02): 143-148. (in Chinese)

齊顏鳳, 伍衛(wèi)平. 棘球蚴病流行病學(xué)研究進(jìn)展[J]. 中國寄生蟲學(xué)與寄生蟲病雜志, 2013, 31(02): 143-148.

[3] Kern P. Medical treatment of echinococcosis under the guidance of Good Clinical Practice (GCP/ICH) [J]. Parasitol Int, 2006, 55 Suppl: S273-82.DOI:10.1016/j.parint.2005.11.040

[4] Ceballos L, Elissondo C, Moreno L, et al. Albendazole treatment in cystic echinococcosis: pharmacokinetics and clinical efficacy of two different aqueous formulations[J]. Parasitol Res, 2008, 103(2): 355-362.DOI: 10.1128/AAC.05105-11

[5] Menezes da Silva A. Hydatid cyst of the liver-criteria for the selection of appropriate treatment[J]. Acta Tropica, 2003, 85(2): 237-242.DOI: 10.1016/S0001-706X(02)00271-1

[6] Wen H,Tu EGAL AJ,Shao YM,et al. Research achievements and challenges for echinococcosis control[J]. Chin J Parasitol Paras Dis, 2015, 33(06): 466-471. (in Chinese)

溫浩, 吐爾干艾力·阿吉, 邵英梅, 等. 棘球蚴病防治成就及面臨的挑戰(zhàn)[J]. 中國寄生蟲學(xué)與寄生蟲病雜志, 2015, 33(06): 466-471.

[7] Falagas ME, Bliziotis IA. Albendazole for the treatment of human echinococcosis: a review of comparative clinical trials [J]. Am J Medl Sci, 2007, 334(3): 171-179.DOI: 10.1097/MAJ.0b013e31814252f8

[8] Moro P, Schantz PM. Echinococcosis: a review[J]. Int J Infect Dis, 2009, 13(2):125-133.DOI: 10.1016/j.ijid.2008.03.037

[9] Uze G, Tavernier J. High efficiency targeting of IFN-alpha activity: possible applications in fighting tumours and infections[J]. Cytokine Growth Factor Rev, 2015, 26(2): 179-182.DOI: 10.1016/j.cytogfr.2014.10.006

[10] Gibbert K, Schlaak JF, Yang D, et al. IFN-α subtypes: distinct biological activities in anti-viral therapy[J]. Br J Pharmacol, 2013, 168(5):1048. DOI: 10.1111/bph.12010

[11] Godot V, Harraga S, Podoprigora G, et al. IFN alpha-2a protects mice against a helminth infection of the liver and modulates immune responses[J]. Gastroenterology, 2003, 124(5):1441-1450. DOI: 10.1016/S0016-5085(03)00273-7

[12] Elissondo M, Dopchiz M, Ceballos L, et al.Invitroeffects of flubendazole onEchinococcusgranulosusprotoscoleces [J]. Parasitol Res, 2006, 98(4): 317-323.DOI: 10.1007/s00436-005-0026-6

[13] Pensel PE, Ullio Gamboa G, Fabbri J, et al. Cystic echinococcosis therapy: Albendazole-loaded lipid nanocapsules enhance the oral bioavailability and efficacy in experimentally infected mice[J]. Acta Trop, 2015, 152: 185-194.DOI: 10.1016/j.actatropica.2015.09.016

[14] Ahmadnia S, Moazeni M, Mohammadi-Samani S, et al.Invivoevaluation of the efficacy of albendazole sulfoxide and albendazole sulfoxide loaded solid lipid nanoparticles against hydatid cyst [J]. Exp Parasitol, 2013, 135(2): 314-319.DOI: 10.1016/j.exppara.2013.07.017

[15] Harraga S, Godot V, Bressonhadni S, et al. Clinical efficacy of and switch from T helper 2 to T helper 1 cytokine profile after interferon α2a monotherapy for human echinococcosis[J]. Clin Infec Dis, 1999, 29(1):205-206. DOI: 10.1086/520157

[16] Manel A, Chafia TB. Involvement of Treg and alternatively activated macrophages in evasion strategies during hydatidosis[J].Front in Immunol,2013,4(4):41-7.DOI: 10.3389/conf.fimmu.2013.02.00425

[17] Rigano R, Profumo E, Di Felice G, et al.Invitroproduction of cytokines by peripheral blood mononuclear cells from hydatid patients [J]. Clin Exp Immunol, 1995, 99(3): 433-439.

[18] Zhang W, Hao W, Li J, et al. Immunology and immunodiagnosis of cystic echinococcosis: an update[J]. Clin Dev Immunol, 2012(1):101895.DOI: 10.1155/2012/101895

[19] Gessner A, Moskophidis D, Lehmann-Grube F. Enumeration of single IFN-gamma-producing cells in mice during viral and bacterial infection [J]. J Immunol, 1989, 142(4): 1293-1298.

[20] Rizza P, Capone I, Moretti F, et al. IFN-α as a vaccine adjuvant: recent insights into the mechanisms and perspectives for its clinical use.[J]. Expert Rev Vaccines, 2011, 10(4):487-498.DOI: 10.1586/erv.11.9

[21] Aricò E, Belardelli F. Interferon-α as antiviral and antitumor vaccine adjuvants: mechanisms of action and response signature[J]. J Interferon Cytokine Res, 2012, 32(6):235-247. DOI: 10.1089/jir.2011.0077