魏后軍，范志宇，王　芳，宋艷華，胡　波，仇汝龍，陳萌萌，徐為中，薛家賓

(江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所·農(nóng)業(yè)部動物疫病診斷與免疫重點開放實驗室· 國家獸用生物制品工程技術(shù)研究中心，南京 210014)

兔病毒性出血癥(RHD)，俗稱“兔瘟”，是由兔出血癥病毒(RHDV)引起的一種高度致死性、急性敗血性傳染病，該病發(fā)病率、病死率極高，給養(yǎng)兔業(yè)造成極大經(jīng)濟(jì)損失[1]。目前，我國主要通過疫苗接種來預(yù)防和控制兔瘟。體液免疫應(yīng)答在兔瘟的感染及免疫中起到重要的作用。通過檢測特異性抗體的應(yīng)答能診斷RHDV的感染。檢測免疫后或恢復(fù)期動物體內(nèi)特異性抗體滴度可預(yù)測家兔抵抗RHDV感染的能力。因此，建立能快速、準(zhǔn)確檢測RHDV抗體水平的方法顯得尤為重要。目前，檢測兔出血癥病毒抗體主要使用血凝抑制試驗(HI)[2]、間接ELISA和競爭ELISA[3]，有研究者報道血清血凝抑制效價為3log2以上的家兔，能抵抗RHDV強(qiáng)毒攻擊[4]。但這些方法步驟繁瑣，需要專業(yè)的設(shè)備和技術(shù)人員，不適合基層推廣。膠體金試紙條在畜禽疾病監(jiān)測方面得到廣泛的研究和應(yīng)用[5-8]，具有快速、簡便、準(zhǔn)確的特點，非常適合臨床應(yīng)用。

衣殼蛋白VP60是RHDV的主要結(jié)構(gòu)蛋白，重組桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)能夠高效表達(dá)VP60，并且能夠在體外自聚成形態(tài)學(xué)以及抗原性上與天然 RHDV病毒粒子幾乎無差異的病毒樣顆粒[9-10]。本實驗室已經(jīng)建立了以重組VP60蛋白作為包被抗原檢測RHDV抗體的ELISA方法，具有較高的特異性、敏感性等，同時避免了直接包被病毒存在的散毒風(fēng)險[11]；目前還未見以病毒樣顆粒作為金標(biāo)抗原研制試紙條的報道。一個金黃色葡萄球菌蛋白A(SPA)分子可以和多個IgG結(jié)合，與兔IgG有較強(qiáng)的結(jié)合能力[12-13]。因此，本研究用純化的VP60蛋白作為金標(biāo)抗原，具有較好的特異性，并具有良好的生物安全性；在NC膜上C線、T線分別包被抗RHDV VP60單克隆抗體A3C、金黃色葡萄球菌蛋白A(SPA)；以檢測HI效價為3log2的樣品，T線、C線出現(xiàn)相同顏色深度條帶為標(biāo)準(zhǔn)，優(yōu)化反應(yīng)條件，研制出可以根據(jù)T線、C線顯色情況反映兔出血癥病毒抗體水平的膠體金試紙條。該試紙條用血清作為樣本即可進(jìn)行抗體檢測，為兔病毒性出血癥流行病學(xué)調(diào)查和疫苗免疫效果評價提供了一種快速、便捷的方法。

1　材料與方法

1.1　毒株及細(xì)胞

抗RHDV VP60 單克隆抗體A3C[5]和桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的重組VP60蛋白[9]由本實驗室制備[14-15]。

1.2　血清

兔出血癥病毒強(qiáng)陽性(HI效價大于等于4log2)、陽性(HI效價為3log2)、弱陽性(HI效價為1log2或2log2)血清和兔多殺性巴氏桿菌(Pm)、兔支氣管敗血波氏桿菌(Bb)、兔A型產(chǎn)氣莢膜梭菌(CpA)的陽性血清均由本實驗制備；陰性血清來自邳州市東方養(yǎng)殖有限公司的SPF兔。

1.3　主要試劑

金黃色葡萄球菌蛋白A(SPA)購自北京博爾西科技有限公司；不含IgG的牛血清白蛋白(BSA)購自上海翊圣生物科技有限公司；PEG 20000購自Biosharp公司；氯金酸、檸檬酸三鈉購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。兔出血癥基因工程疫苗[9]由本實驗室制備，商品化兔出血癥組織滅活疫苗購自南京天邦生物科技有限公司。

1.4　試紙條材料

硝酸纖維素膜購自Millipore公司，樣品墊、金標(biāo)墊、吸水紙、支撐板、塑料卡購自上海捷寧生物科技有限公司。

1.5　膠體金的制備

采用檸檬酸三鈉法制備直徑20 nm的膠體金顆粒[8]，用透射電鏡觀察，2～8 ℃保存、備用。

1.6　膠體金試紙條的制備

1.6.1膠體金標(biāo)記VP60最適pH值的選擇取9支試管，每支試管加入1 mL膠體金溶液，分別加入0.1 mol·L-1K2CO3溶液1、2、3、4、5、6、7、8、9 μL調(diào)節(jié)pH值，各試管滴加50 μL 1 mg·mL-1的VP60，混勻后作用30 min，加入10%NaCl 100 μL，混勻室溫放置30 min后，記錄溶液保持紅色的最低0.1 mol·L-1K2CO3添加量，并用精密pH試紙檢測該溶液的pH值，即為膠體金標(biāo)記VP60最適pH值。

1.6.2膠體金標(biāo)記VP60最適蛋白量的選擇取9支試管，每支試管加入1 mL調(diào)節(jié)到最適pH值的膠體金溶液，分別加入1 mg·mL-1的VP60 5、10、15、20、25、30、35、40、45 μL，混勻后作用30 min，加入10%NaCl 100 μL，混勻室溫放置30 min后，溶液保持紅色的最低VP60的添加量，在此基礎(chǔ)上增加20%即為最適標(biāo)記蛋白量。

1.6.3膠體金標(biāo)記蛋白向調(diào)至最佳pH的膠體金溶液中，緩慢加入最適蛋白量的VP60，室溫攪拌30 min；加入10% PEG20000 至終濃度1%作為穩(wěn)定劑；將上述膠體金溶液經(jīng)離心法純化[8]，加入重懸液(含0.1%PEG20000的0.002 mol·L-1硼酸緩沖液)重懸至原體積的1/10，置2～8 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.6.4試紙條的組裝依次把吸水墊、金標(biāo)墊和樣品墊粘貼到NC膜上，各墊之間有1 mm重疊，用切條機(jī)切成4 mm寬的試紙條，裝入塑料卡，置于鋁箔袋中，加干燥劑密封。

1.7　試紙條條件優(yōu)化

1.7.1金標(biāo)VP60溶液稀釋度的選擇將金標(biāo)溶液用重懸液按一定比例稀釋，噴在金標(biāo)墊上，溫箱烘干；NC膜C線、T線分別包被過量的A3C、SPA；組裝成試紙條。用試紙條分別檢測100倍稀釋的強(qiáng)陽性、陽性、弱陽性血清，選擇的稀釋度滿足條件：檢測強(qiáng)陽性血清時，T線顏色比C線深；陽性血清時，T線、C線顏色相同；檢測弱陽性血清時，T線顏色比C線淺。

1.7.2T線、C線的濃度的選擇以T線SPA，C線 A3C不同蛋白濃度做點陣，與包被最佳稀釋度金標(biāo)溶液的金標(biāo)墊等組裝成試紙條。用試紙條分別檢測100倍稀釋的強(qiáng)陽性、陽性、弱陽性血清，T線、C線濃度的選擇滿足條件：檢測強(qiáng)陽性血清時，T線顏色比C線深；陽性血清時，T線、C線顏色相同；檢測弱陽性血清時，T線顏色比C線淺。

1.8　敏感性

強(qiáng)陽性血清(HI效價為8log2)用生理鹽水依次倍比稀釋1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128、1∶256、1∶512，即HI效價分別為7log2、6log2、5log2、4log2、3log2、2log2、1log2、0log2、-1log2，將生理鹽水稀釋100倍的以上樣品和不稀釋的強(qiáng)陽性血清，吸取100 μL滴加到試紙條加樣孔中，10 min判斷結(jié)果。

1.9　特異性

將兔多殺性巴氏桿菌(Pm)、兔支氣管敗血波氏桿菌(Bb)、兔A型產(chǎn)氣莢膜梭菌(CpA)的陽性血清用生理鹽水100倍稀釋，吸取100 μL滴加到試紙條加樣孔中，10 min判斷結(jié)果。

1.10　重復(fù)性

從3批次試紙條中各抽取40條，檢測強(qiáng)陽性、陽性、弱陽性、陰性血清樣品，觀察試紙條檢測結(jié)果。

1.11　穩(wěn)定性

試紙條2～8 ℃保存，每隔一個月抽取試紙條檢測強(qiáng)陽性、陽性、弱陽性、陰性血清樣品，觀察試紙條檢測結(jié)果。

1.12　符合率

取已測HI效價的強(qiáng)陽性血清、陽性血清、弱陽性血清各80份，陰性血清20份，用試紙條檢測并計算與血凝抑制方法的符合率。

1.13　試紙條的初步應(yīng)用

兔出血癥基因工程疫苗、兔出血癥組織滅活疫苗、PBS各1 mL分別皮下注射5只實驗兔；在免疫后0、3、7、14、21 d采血，用試紙條檢測血清，比較兩種疫苗的抗體產(chǎn)生期。

2　結(jié)　果

2.1　膠體金的制備

采用檸檬酸三鈉法制備膠體金顆粒，通過透射電鏡掃描觀察，膠體金分布均勻、大小均一；隨機(jī)取50個膠體金顆粒，測量其直徑，粒徑為(20.6±2.0)nm。

2.2　膠體金標(biāo)記VP60最適pH值

膠體金標(biāo)記VP60最適pH值選擇試驗結(jié)果顯示，每毫升膠體金溶液中最少添加6 μL 0.1 mol·L-1K2CO3，溶液仍保持紅色，此時溶液pH值為7.5，即為標(biāo)記VP60最適pH值。

2.3　膠體金標(biāo)記VP60最適蛋白量

膠體金標(biāo)記VP60最適蛋白量的選擇試驗結(jié)果顯示，每毫升膠體金溶液中最少添加15 μL 1 mg·mL-1的VP60能使溶液保持紅色，在此基礎(chǔ)上增加20%，即18 μL 1 mg·mL-1的VP60為最適蛋白量。

2.4　試紙條條件優(yōu)化

金標(biāo)VP60溶液用重懸液按1∶4稀釋；T線SPA質(zhì)量濃度為0.6 mg·mL-1，C線A3C質(zhì)量濃度為2.0 mg·mL-1。優(yōu)化條件后制備的試紙條檢測強(qiáng)陽性血清(HI效價大于等于4log2)時，T線顏色比C線深；陽性血清(HI效價為3log2)時，T線、C線顏色相同；檢測弱陽性血清(HI效價為1log2或2log2)時，T線顏色比C線淺(圖1)。

圖1　經(jīng)優(yōu)化試紙條的檢測結(jié)果Fig.1　The detection result of optimized strips

2.5　敏感性

試紙條敏感性試驗結(jié)果顯示，試紙條可以直接檢測強(qiáng)陽性血清，最低可以檢測到經(jīng)生理鹽水100倍稀釋的1log2樣品，說明試紙條檢測范圍為：原液至1∶12 800；試紙條在檢測100倍稀釋的樣品時，敏感性與血凝抑制方法相同。

2.6　結(jié)果判定

待檢血清用生理鹽水100倍稀釋后，吸取100 μL

滴加到加樣孔中，10 min判斷結(jié)果。T線顏色比C線深判定為強(qiáng)陽性；T線、C線顏色相同判定為陽性；T線顏色比C線淺判定為弱陽性；T線不顯色、C線顯色判定為陰性；C線不顯色則試紙條無效。

2.7　特異性

試紙條特異性試驗顯示，兔多殺性巴氏桿菌(Pm)、兔支氣管敗血波氏桿菌(Bb)、兔A型產(chǎn)氣莢膜梭菌(CpA)的陽性血清及陰性(SPF)血清結(jié)果均為陰性，而RHDV陽性血清檢測結(jié)果為陽性，說明該試紙條特異性良好。

2.8　重復(fù)性、穩(wěn)定性

3批次試紙條檢測強(qiáng)陽性、陽性、弱陽性、陰性血清結(jié)果一致。試紙條2～8 ℃保存6個月，檢測強(qiáng)陽性、陽性、弱陽性、陰性血清結(jié)果不變。

2.9　符合率

膠體金試紙條檢測強(qiáng)陽性、陽性、弱陽性、陰性血清的結(jié)果與血凝抑制試驗的符合率分別為93.75%、88.75%、91.25%、95.00%，260份樣品中，兩種檢測方法結(jié)果相同的共75+71+73+19=238份，總的符合率為91.54%(表1)。

表1膠體金試紙條與血凝抑制試驗比較

Table1ComparisonofcolloidalgoldteststripwithHItest

血清Serum數(shù)目Number試紙條檢測結(jié)果Stripdetectionresults強(qiáng)陽性Strongposition陽性Position弱陽性Weakposition陰性Negative符合率/%Coincidence強(qiáng)陽性Strongpositive807550093.75陽性positive806713088.75弱陽性Weakpositive800373491.25陰性Negative200011995.00

2.10　試紙條的初步應(yīng)用

試紙條檢測免疫兔血清中的抗體水平，基因工程苗免疫后0、3 d 5只均陰性，7 d 2只弱陽性、3只陰性，14 d 1只弱陽性、3只陽性、1只強(qiáng)陽性，21 d 4只強(qiáng)陽性、1只陽性；組織滅活苗免疫后0、3、7 d 5只均陰性，14 d 4只弱陽性、1只陰性，21 d 4只弱陽性、1只陽性；PBS免疫后至21 d均未檢測到抗體。

3　討　論

3.1兔病毒性出血癥感染率、死亡率高，給養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。目前主要通過接種疫苗來控制與預(yù)防該病。因此，能快速、準(zhǔn)確檢測疫苗免疫后抗體水平的方法顯得尤為重要。檢測方法主要有血凝抑制試驗和ELISA方法[2,11]，但這些方法耗時長，操作繁瑣。本試驗研制的膠體金試紙條，加樣后10 min得到結(jié)果，根據(jù)顯色情況就能判定血清中抗體水平。兔出血癥病毒抗體為陽性或強(qiáng)陽性的兔，能抵抗RHDV強(qiáng)毒攻擊，弱陽性兔部分抵抗RHDV強(qiáng)毒攻擊，陰性兔不能抵抗RHDV強(qiáng)毒攻擊[4]，因此，試紙條檢測結(jié)果為陽性或強(qiáng)陽性時，說明兔不需加強(qiáng)免疫；試紙條檢測結(jié)果為弱陽性或陰性時，需加強(qiáng)免疫。

3.2為防止試紙條檢測不稀釋的強(qiáng)陽性血清時，金標(biāo)VP60被血清中過量的特異性抗體結(jié)合，導(dǎo)致沒有多余未標(biāo)記的金標(biāo)VP60和C線上的蛋白反應(yīng)，出現(xiàn)C線條帶極淡或沒有的現(xiàn)象，制備試紙條時，C線包被的單抗與VP60的結(jié)合應(yīng)不被多抗阻斷，即VP60與多抗結(jié)合后仍能結(jié)合單抗。因此在選擇單抗時，我們用阻斷ELISA方法[3]，以VP60包被ELISA板，用兔抗VP60多抗阻斷單抗與VP60反應(yīng)，同時間接ELISA方法[11]檢測單抗效價。結(jié)果顯示，實驗室制備的4株單抗均未被阻斷，可用于包被C線，但A3C效價較高，因此選擇A3C作為質(zhì)控線包被蛋白。

3.3在臨床使用試紙條時，檢測全血會比檢測血清更加便捷。普通樣品墊不能攔截紅細(xì)胞，會導(dǎo)致NC膜紅色背景，影響結(jié)果判斷。本研究使用濾血墊作為樣品墊，可以有效地攔截紅細(xì)胞。全血中約含50%的血清[16]，因此檢測全血樣品時，需用生理鹽水50倍稀釋后再檢測。

4　結(jié)　論

成功建立檢測兔出血癥病毒抗體的膠體金試紙條，可通過試紙條顯色結(jié)果判定血清中抗體水平，可用于兔病毒性出血癥的流行病學(xué)調(diào)查和抗體水平監(jiān)測。

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