劉師兵　于　洋　謝　奇　趙國艷　徐　冶

(吉林醫(yī)藥學(xué)院科研實(shí)驗(yàn)室，吉林　吉林　132013)

順鉑(CDDP)與DNA形成關(guān)聯(lián)能夠破壞DNA結(jié)構(gòu)并導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞內(nèi)源性凋亡〔1〕。研究表明，CDDP能夠直接靶向作用于線粒體，線粒體凋亡途徑是CDDP誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的主要作用機(jī)制之一〔2〕。線粒體活性氧(ROS)產(chǎn)生過多等功能異常情況的出現(xiàn)，與腫瘤的進(jìn)展密切相關(guān)，研究認(rèn)為，線粒體的分裂和融合與凋亡的關(guān)系極大〔3〕。雖然CDDP能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡，但是腫瘤細(xì)胞可以通過多種機(jī)制抵抗CDDP的殺傷作用〔4〕。Bcl-2抑制劑(ABT-737)屬于小分子抑制劑，能夠降低某些化療藥物的促凋亡閾值。本實(shí)驗(yàn)旨在探討ABT-737通過線粒體凋亡途徑增加對HepG2細(xì)胞CDDP的敏感性。

1　材料和方法

1.1細(xì)胞、藥物、試劑和儀器HepG2細(xì)胞由吉林大學(xué)病理學(xué)教研室惠贈(zèng)；CDDP(美國Sigma-Aldrich公司)；ABT-737(美國Selleck Chemicals)；1640培養(yǎng)基(美國Life Technologies公司)；胎牛血清(美國Life Technologies公司)；胰蛋白酶(美國Thermo公司)；四甲基偶氮唑鹽(MTT，美國Sigma-Aldrich公司)；免疫熒光染料Hoechst33342(美國Sigma-Aldrich公司)；線粒體膜電位檢測試劑盒(JC-1)、2′7′-二氯熒光黃雙乙酸鹽(DCFH-DA)，(中國碧云天公司)；CO2恒溫培養(yǎng)箱(日本SANYO公司)；離心機(jī)(德國Bioguge公司)；酶標(biāo)儀(美國Bio-rad公司)；激光掃描共聚焦顯微鏡(日本Olympus)；MUSETM細(xì)胞分析儀(美國EMD Millipore公司)。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)與分組使用含有10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，放入恒溫37℃、CO2濃度為5%的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)HepG2細(xì)胞，0.25%胰蛋白酶消化傳代，每2 d傳代1次。根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康模瑢⒓?xì)胞分為空白對照組、CDDP組、ABT-737組和聯(lián)合用藥組(CDDP+ABT-737組)。

1.2.2細(xì)胞活性檢測(MTT比色法)取對數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞接種于96孔板中，接種濃度約為1×104個(gè)細(xì)胞/孔，細(xì)胞用含有10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基混勻，每孔終體積為100 μl，常規(guī)培養(yǎng)24 h。用1640培養(yǎng)基處理藥品，各孔加入0、1、2、4、8、16 μmol/L的CDDP，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，每孔加入20 μl 5 mg/ml MTT，37℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中孵育4 h后棄去培養(yǎng)液，每孔加入150 μl二甲基亞砜(DMSO)，震蕩10 min，酶標(biāo)儀設(shè)置波長為570 nm，測吸光度值。另取相同方法接種HepG2細(xì)胞的96孔板，各孔加入0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、16.0、32.0 μmol/L的ABT-737，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后加MTT(方法同CDDP MTT法)測得ABT-737的最大安全劑量。

1.2.3流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡取對數(shù)生長的HepG2細(xì)胞接種于6孔板中，接種濃度約為2×105個(gè)細(xì)胞/孔，常規(guī)培養(yǎng)24 h，根據(jù)不同藥物處理組給藥(給藥濃度與分組同1.2.1)，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，胰蛋白酶消化并收集細(xì)胞，800 r/min離心5 min后棄去上清，加入1640培養(yǎng)液混懸細(xì)胞，使細(xì)胞濃度約為1×106個(gè)細(xì)胞/ml，將細(xì)胞原液與MUSETMAnnexin-V 凋亡細(xì)胞檢測試劑1∶1混勻，避光孵育20 min后用MUSETM細(xì)胞分析儀檢測。

1.2.4免疫熒光實(shí)驗(yàn)

1.2.4.1Hoechst染色觀察細(xì)胞核形態(tài)變化取對數(shù)生長的HepG2細(xì)胞接種于24孔板中，接種濃度約為4×104個(gè)細(xì)胞/孔，常規(guī)培養(yǎng)24 h，根據(jù)不同藥物處理組給藥(給藥濃度與分組同1.2.1)，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，棄去培養(yǎng)基，0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3次后，用4%多聚甲醛固定25 min，棄去固定液，用0.1%Trition X-100 沖洗，加入Hoechst33342染色液染色5 min，棄去染色液，PBS沖洗3次，甘油封片，ABT-737組加入8 μmol/L ABT-737，CDDP組加入4 μg/ml的CDDP，聯(lián)合用藥組加入8 μmol/L ABT-737和4 μg/ml的CDDP，加藥后培養(yǎng)24 h，使用Hoechst33342對細(xì)胞核的細(xì)胞核進(jìn)行染色。應(yīng)用激光掃描共聚焦顯微鏡進(jìn)行觀察、拍照并記錄結(jié)果。

1.2.4.2DCFH-DA染色觀察細(xì)胞內(nèi)RBE ROS水平取對數(shù)生長的HepG2細(xì)胞接種于24孔板中，接種濃度約為4×104個(gè)細(xì)胞/孔，常規(guī)培養(yǎng)24 h，根據(jù)不同藥物處理組給藥(給藥濃度與分組同1.2.1)，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。棄去孔板內(nèi)液體，0.1 mol/L PBS 沖洗3次，加入DCFH-DA染液，37℃孵育30 min，0.1 mol/L PBS沖洗3次，甘油封片，應(yīng)用激光掃描共聚焦顯微鏡進(jìn)行觀察、拍照并記錄結(jié)果。

1.2.4.3JC-1染色觀察線粒體膜電位變化取對數(shù)生長的HepG2細(xì)胞接種于24孔板中，接種濃度約為4×104個(gè)細(xì)胞/孔，37℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)24 h，根據(jù)不同藥物處理組給藥，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，棄去培養(yǎng)基，PBS洗滌5 min，加入1 ml JC-1染色工作液，充分混勻，細(xì)胞培養(yǎng)箱中37℃孵育20 min。按照每1 ml JC-1染色緩沖液加入4 ml蒸餾水的比例，配制適量的JC-1染色緩沖液，并放置于冰浴。37℃孵育結(jié)束后，吸除上清，用JC-1染色緩沖液洗滌2次。加入2 ml細(xì)胞培養(yǎng)液，應(yīng)用激光共聚焦顯微鏡觀察各組HepG2細(xì)胞線粒體膜電位變化。JC-1對HepG2細(xì)胞進(jìn)行染色，正常線粒體呈紅色熒光，膜電勢下降時(shí)呈綠色熒光。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS18.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2　結(jié)　果

與0 μg/ml比較:1)P<0.05；與CDDP組比較:2)P<0.05圖1　CDDP組與聯(lián)合用藥組HepG2細(xì)胞存活率比較(n=3)

2.1MTT法檢測HepG2細(xì)胞生存率見圖1。單加CDDP 24 h后，HepG2細(xì)胞的存活率隨CDDP劑量的加大而減弱，IC50為6.19 μg/ml；同樣的方法測得ABT-737的最高安全劑量為8 μmol/L。將此用藥劑量應(yīng)用于聯(lián)合用藥組，加入ABT-737后，CDDP的IC50降至4.29 μg/ml。

2.2Hoechst染色觀察HepG2細(xì)胞凋亡CDDP組與聯(lián)合用藥組HepG2細(xì)胞的細(xì)胞核均出現(xiàn)明顯的固縮和碎裂，CDDP組細(xì)胞核形態(tài)改變的程度和數(shù)量均明顯少于聯(lián)合用藥組。對照組和ABT-737組細(xì)胞核無明顯形態(tài)學(xué)改變。見圖2。

2.3DCFH-DA染色檢測HepG2細(xì)胞ROS水平對照組與ABT-737組綠色熒光強(qiáng)度無明顯變化，CDDP組熒光強(qiáng)度略高，聯(lián)合用藥組綠色熒光強(qiáng)度最強(qiáng)，顯示綠色熒光的細(xì)胞數(shù)量最多。見圖3。

2.4JC-1染色觀察線粒體膜電勢見圖4。對照組和ABT-737組紅色熒光最強(qiáng)，綠色熒光較弱；CDDP組紅色熒光較對照組弱，但綠色熒光明顯高于對照組和ABT-737組；聯(lián)合用藥組紅色熒光與CDDP組差別不大，綠色熒光最強(qiáng)。

圖2　Hoechst染色觀察各組HepG2細(xì)胞細(xì)胞核的形態(tài)改變(Bar=80 μm，×800)

圖3　DCFH-DA染色觀察各組HepG2細(xì)胞的RBE ROS水平(Bar=80 μm，×400)

圖4　JC-1染色觀察各組HepG2細(xì)胞的線粒體膜電勢改變(Bar=80 μm，×400)

2.5流式細(xì)胞術(shù)檢測HepG2細(xì)胞凋亡對照組細(xì)胞凋亡率為7.12%，ABT-737組為7.53%，聯(lián)合用藥組為33.86%，CDDP組為19.24%。

3　討　論

CDDP是臨床常用于肝癌治療的化療藥物之一，但腫瘤細(xì)胞的耐藥性嚴(yán)重影響了CDDP的療效。腫瘤細(xì)胞對化療藥物的耐藥機(jī)制是多方面的，與DNA修復(fù)及合成異常、凋亡相關(guān)信號通路異常、自噬異常等因素密切相關(guān)〔5〕。通常認(rèn)為，腫瘤細(xì)胞能夠通過調(diào)控Bcl-2家族中的抗凋亡和促凋亡蛋白的平衡關(guān)系，從而應(yīng)答化療藥物的干預(yù)，同時(shí)，在應(yīng)激條件下，細(xì)胞可以通過自噬來維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)，該家族與線粒體關(guān)系密切，不但決定了線粒體外膜的凋亡閾值，而且參與調(diào)節(jié)線粒體外膜的通透性〔6〕。線粒體是大多數(shù)細(xì)胞的主要能量來源，同時(shí)也參與細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，當(dāng)線粒體受損時(shí)可啟動(dòng)內(nèi)源性凋亡〔7〕。

ABT-737是BH3-only 蛋白BAD的模擬物，與Bcl-2、Bcl-2-XL、Bcl-W有高度親和性，能夠抑制三者的抗凋亡功能〔8〕。因此可以推測ABT-737能夠增加HepG2細(xì)胞對CDDP的敏感性，CDDP進(jìn)入細(xì)胞后可直接靶向作用于線粒體，并與線粒體外膜的某些蛋白直接結(jié)合，誘導(dǎo)線粒體凋亡。在應(yīng)激情況下，線粒體常常通過融合和分裂過程產(chǎn)生更長或更短的線粒體，有研究認(rèn)為線粒體分裂是重要的凋亡上游的生物學(xué)事件，受損的線粒體會導(dǎo)致ROS的堆積，進(jìn)一步損傷核DNA或mtDNA〔9〕。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，ABT-737聯(lián)合CDDP引起的HepG2細(xì)胞凋亡與線粒體的關(guān)系極為密切。ABT-737能增加CDDP對HepG2細(xì)胞線粒體的損傷，主要表現(xiàn)在ROS蓄積和線粒體膜電位的變化，線粒體的損傷趨勢與細(xì)胞凋亡的趨勢相同，提示足夠的線粒體損傷可能是CDDP殺傷HepG2細(xì)胞的重要條件，ABT-737通過線粒體凋亡途徑增加了HepG2細(xì)胞對CDDP的敏感性。

1Galluzzi L，Senovilla L，Vitale I，etal.Molecular mechanisms of cisplatin resistance〔J〕.Oncogene，2012；31(15)：1869-83.

2Kong B，Wang Q，F(xiàn)ung E，etal.p53 is required for cisplatin-induced processing of the mitochondrial fusion protein L-Opa1 that is mediated by the mitochondrial metallopeptidase Oma1 in gynecologic cancers〔J〕.J Biol Chem，2014；289(39)：27134-45.

3Cassidy-Stone A，Chipuk JE，Ingerman E,etal.Chemical inhibition of the mitochondrial division dynamin reveals its role in Bax/Bak-dependent mitochondrial outer membrane permeabilization〔J〕.Dev Cell，2008；14(2)：193-204.

4Srimunta U，Sawanyawisuth K，Kraiklang R,etal.High expression of ABCC1 indicates poor prognosis in intrahepatic cholangiocarcinoma〔J〕.Asian Pac J Cancer Prev，2012；13(2)：125-30.

5Yoon H，Min JK，Lee DG,etal.L1 cell adhesion molecule and epidermal growth factor receptor activation confer cisplatin resistance in intrahepatic cholangiocarcinoma cells〔J〕.Cancer Lett，2012；316(1)：70-6.

6Scheibye-Knudsen M，F(xiàn)ang EF，Croteau DL,etal.Protecting the mitochondrial powerhouse〔J〕.Trends Cell Biol，2015；25(3)：158-70.

7Webster BR，Scott I，Traba J,etal.Regulation of autophagy and mitophagy by nutrient availability and acetylation〔J〕.Biochim Biophys Acta，2014；1841(4)：525-34.

8Hollville E，Carroll RG，Cullen SP,etal.Bcl-2 family proteins participate in mitochondrial quality control by regulating Parkin/PINK1-dependent mitophagy〔J〕.Mol Cell，2014；55(3)：451-66.

9Arena G，Gelmetti V，Torosantucci L,etal.PINK1 protects against cell death induced by mitochondrial depolarization，by phosphorylating Bcl-xL and impairing its pro-apoptotic cleavage〔J〕.Cell Death Differ，2013；20(7)：920-30.